Способ идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/04 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления и идентификации дрожжеподобных грибов Candida auris в лабораторной диагностике, микологии.

Колонизация и инфицирование Candida auris среди госпитализированных пациентов и лиц, находящихся на длительном лечении, стала глобальной проблемой, Candida auris является распространенным оппортунистическим патогеном, представляющим серьезную угрозу здоровью. Данный микроорганизм трудно идентифицировать стандартными лабораторными методами. Возбудитель легко распространяется в медицинских учреждениях. По этой причине важно быстро идентифицировать Candida auris у госпитализированного пациента, чтобы принять меры для предотвращения распространения и возникновения вспышечной заболеваемости. Уязвимыми являются иммунокомпроментированные лица - пожилые, ослабленные хроническими и острыми заболеваниями (онкозаболевания, политравма, сахарный диабет, сепсис, пневмонии, почечная недостаточность и т.п.), новорожденные, люди после пересадки органов и косного мозга, ВИЧ-инфицированные. Особая опасность представляется для отделений интенсивной терапии (ОИТ) и пациентов с тяжелой формой COVID-19. Симптомы некоторых грибковых заболеваний могут быть аналогичны симптомам симптомам COVID-19, включая лихорадку, кашель и одышку. Лабораторное тестирование необходимо для определения того, есть ли у человека грибковая инфекция или COVID-19. У некоторых пациентов может быть COVID-19 и грибковая инфекция одновременно. Сочетанные инфекции ведут к тяжести заболевания и смерти пациентов.

В методических рекомендациях «Грибы рода CANDIDA (Методы выделения, идентификации на видовом уровне и определение чувствительности к противогрибковым препаратам)» (НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), М. 2009, описаны методы выделения и идентификации грибов рода Candida, определению чувствительности их к антигрибковым препаратам (антимикотикам), однако Candida auris была впервые выделен в 2010 году.

Лабораторная диагностика инфекции Candida auris с использованием доступных тест-систем затруднительна ввиду частых ошибок идентификации. Наиболее высокой степенью точности обладает метод, основанный на матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) и способен отличить Candida auris от других видов Candida. Такая услуга доступна крупным бактериологическим лабораториям, но не доступна для обычных клинических и бактериологических лабораторий. Для бактериологического контроля Candida spp. (Candida albicans и других видов грибов рода Candida) рекомендовано использование питательных сред: «Питательная среда для контроля микробной загрязненности» (Питательная среда (ГРМ №2 (Сабуро)», «Питательная среда для выделения и культивирования дрожжеподобных и плесневых грибов (Сабуро - мальтоза агар)», триптикоза - соевого агара по ОФС.1.2.4.0003.15 (ГФ РФ Государственная Фармокопея Российской Федерации XIV издание), МУК 4.2.2942-11 (Методы санитарно-бактериологических исcледований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях), регламентирующим перечень питательных сред для выявления Candida albicans.

Ведущими зарубежными фирмами MERCK, HiMedia выпускаются сухие питательные среды для обнаружения Candida spp.): Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest agar) HiMedia, Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedi, Бульон Сабуро (Sabouraud Broth), Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedia, Декстрозный агар Сабуро с4% Glucose Agar) HiMedi, Бульон Сабуро (Sabouraud Broth), Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedia, Декстрозный агар Сабуро с соевым лецитином и Твин 80 HiMedia (ФСЗ 2009/03709.

Недостатком вышеперечисленных сред является одинаковый рост колоний Candida spp. что не позволяет провести идентификацию до вида.

Для идентификации используют хромогенную среду, предназначенную для дифференциации C. albicans и других видов Candida в клинических и неклинических образцах: «HiCrome Candida Differential agar» M1297A состоящий из следующих компонентов г/л: пептон особый - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт - 4,0 г/л, дикалий гидрофосфат - 1,0 г/л, хромогенная смесь - 7,22 г/л, хлорамфеникол - 0,500 г/л, агар микробиологический - 15 г/л

«HiCrome Candida Differential agar» является альтернативой традиционным средам для выделения и идентификации Candida spp. Хромогенные субстраты, содержащиеся в данной среде, позволяют быстро идентифицировать и дифференцировать различные виды кандид по цвету колоний. Колонии Candida albicans - зеленые, Candida krusei - фиолетово-розовые, Candida tropicalis - синие, Candida glabrata и Candida parapsilosis - бледно-фиолетовый. Candida auris может иметь на данной среде розовый, красный, кремовый или фиолетовый цвет, а также иметь сочетание этих цветов на одной чашке.

Слабовыраженное окрашивание колоний Candida auris, приводит к сомнительным дифференцирующим свойствам.

Рекомендованной и наиболее используемой служит «Питательная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов (агар Сабуро)». Состав питательной среды (агар Сабуро): панкреатический гидролизат рыбной муки - 10 г/л, панкреатический гидролизат казеина - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г/л, глюкоза моногидрат - 40 г/л, агар микробиологический - 10,0 +/- 3,0, вода очищенная - 1 л, мл, рН 6,0. Навеску, соответственно прописи, растворить в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать 15 мин при 121°С, после охлаждения до 50 - 45°С разлить в стерильные чашки Петри.

Высев до единичных колоний провести общепринятым микробиологическим методом, посевы инкубировать при температуре 20-25°С в течение 24±72ч,

Данная среда традиционно используется для микробиологической практики. На агаре Сабуро рост Candida spp. в виде белых колоний среднего размера, рост Candida auris в виде более мелких белых колоний.

Однако эта среда не позволяет провести идентификацию Candida spp. до вида.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ идентификации гриба Candida albicans,( RU, патент № 2386693) предусматривающий посев гриба на среде с индикаторами, инкубацию при 37°С и выделение культуры гриба по изменению цвета колоний на среде, посев осуществляют на агар Сабуро, содержащий среду Гисса с глюкозой и среду Гисса с мальтозой, и на агар Сабуро, содержащий среду Гисса с сахарозой, инкубацию проводят в течение 24-48 ч. Выделение дрожжеподобных грибов Candida albicans осуществляют по изменению цвета колоний: при этом на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с глюкозой и среду Гисса с мальтозой, - колонии синего цвета, на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с сахарозой, - бледно-голубого цвета.

Однако опытным путем установлено, что Candida albicans и Candida auris на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с глюкозой, среду Гисса с сахарозой, среду Гисса с мальтозой, по цвету не отличаются.

Задачей данного изобретения является модификация метода идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris.

Техническим результатом изобретения является, достижение стабильности результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам, позволяющей упростить и исключить ложную идентификацию возбудителя.

Технический результат достигается тем что предложен способ идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris, предусматривающий посев культуры на питательную среду с добавками, инкубацию при температуре 37°C и визуальную идентификацию культуры, причем посев осуществляют на питательную среду Легионелбакагар, в которую дополнительно вносят дрожжевой экстракт 9,0 г/л, глюкозу- 40 г/л, железа пирофосфат 0,25 г/л, автоклавируют 15 мин. при 121°С, после охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, а визуальную идентификацию осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida.

Изобретение осуществляется следующим образом:

Готовят навеску «Питательной среды для культивирования легионелл (Легионелбакагар)» состава: сернокислотный гидролизат рыбной муки (марки ФК) - 10,0 г/л, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0 г/л, агар бактериологический - 12,0±2,0 г/л, растворяютв 900 мл дистилированной воды, перемешивают дополнительно вносят дрожжевой экстракт 9,0 г/л, глюкозу- 40 г/л, железа пирофосфат 0,25 г/л, автоклавируют 15 мин. при 121°С. После охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания чашки используют для засева. Высев до единичных колоний проводят общепринятым микробиологическим методом, культивируют при температуре 37°C в течение 24 - 48 часов. Рост C. auris в виде средних желтоватых колонии с четкой зоной фосфолипазной активности (появление беловатой зоны преципитации вокруг колонии дрожжей), рост Candida albicans и Candida spp. в виде крупных желтых колоний с отсутствием зоны фосфолипазной активности.

Графические материалы, иллюстрирующие предлагаемое изобретение:

Фиг.1 - фото среды «Легионелбакагар».

Фиг.2 - фото среды «Легионелбакагар с эмульсией яичного желтка».

Фиг.3 - фото среды «Сабуро агар».

Фиг.4 - фото Рост культуры Candida auris на питательной среде «Легионелбакагар с эмульсией яичного желтка».

Фиг.5 - Рост культуры Candida albicans на питательной среде «Легионелбакагар с эмульсией яичного желтка».

Фиг.6 - Рост культуры Candida auris - колонии с зоной фосфолиполиза, Candida albicans (крупные белые колонии) и Staphylococcus aureus (ярко - желтые крупные колонии) на питательной среде Легионелбакагар с эмульсией яичного желтка.

Фиг.7 - фото Рост культуры Candida auris на питательной среде «Легионелбакагар».

Фиг.8 - Рост культуры Candida albicans на питательной среде «Легионелбакагар».

Пример 1

Навеску 33 г, содержащую сернокислотный гидролизат рыбной муки (марки ФК) - 10,0 г/л, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0 г/л, агар бактериологический - 12,0±2,0 г/л, растворяют в 900 мл дистилированной воды, дополнительно вносят дрожжевой экстракт 9,0 г/л, глюкозу - 40 г/л, железа пирофосфат 0,25 г/л, автоклавируют 15 мин при 121°С. После охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают и используют для высева.

Для контроля посев осуществляют на питательную среду для выращивания дрожжевых и плесневых грибов (агар Сабуро) и на питательную среду для культивирования легионелл (Легионелбакагар)».

Высев на данные питательные среды штаммов C. auris CBS 10913, C. auris 48/20, C. albicans ATCC 90028, C. lusitania AV85, C. glаbrata, C. dubliensis KM19, C. parapsilosis OR16, C. kefir до единичных колоний проводят общепринятым микробиологическим методом, посевы культивируют при температуре 37°C в течение 24 - 48 часов. Результаты характерных признаков роста колоний Candida spp., выращенных при температуре 37°C в течение 24 - 48 часов, представлены в таблице№1.

Таблица №1 № п/п Наименование исследуемых штаммов Сабуро агар Легионелбакагар Легионелбакагар с эмульсией яичного желтка 1 C. auris CBS 10913 Более мелкие белые колонии Средние желтоватые колонии Средние желтоватые колонии с четкой зоной фосфолипазной активности (появление беловатой зоны преципитации вокруг колонии дрожжей) 2 C. auris 48/20 Более мелкие белые колонии Средние желтоватые колонии Средние желтоватые колонии с четкой зоной фосфолипазной активности (появление беловатой зоны преципитации вокруг колонии дрожжей) 3 C. albicans ATCC 90028 Мелкие белые колонии Крупные желтые колонии Крупные белые колонии 4 C. lusitania AV85 Мелкие белые колонии Крупные белые колонии Крупные белые колонии 5 C. glаbrata ТМ Мелкие белые колонии Крупные белые колонии Крупные белые колонии 6 C. dubliensis KM19 Мелкие белые колонии Крупные белые колонии Крупные белые колонии 7 C. parapsilosis OR16 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 8 Staphylococcus aureus Очень мелкие белые колонии Мелкие белые колонии Крупные ярко - желтые колонии

На агаре Сабуро - Candida spp. в виде белых колоний среднего размера, рост Candida auris в виде более мелких белых колоний.

В предлагаемом способе рост Candida albicans в виде крупных желтых колоний, рост Candida lusitania, Candida glabrata, Candida dubliensis в виде крупных белых колоний, Candida parapsilosis - средние белые колонии, а Candida auris - средние желтоватые колонии с четкой зоной фосфолипазной активности (появление беловатой зоны преципитации вокруг колонии дрожжей).

Данный способ позволяет визуально идентифицировать наличие продукции фосфолипазы у C. auris и отсутствие продукции фосфолипазы у C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata и C. parapsilosis.

Таким образом, из фото № 4 - № 6 видно, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет исключить ложную идентификацию Candida auris, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata и Candida parapsilosis.

Внесение до стерилизации дрожжевого экстракта, глюкозы, железа пирофосфата и после стерилизации - эмульсии яичного желтка, дает возможность не проводить трудоемких затрат для разработки питательных сред и одновременно получить четкий результат идентификации до вида.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris, предусматривающий посев культуры на питательную среду и инкубацию при 37°C. Питательная среда содержит Легионелбакагар, включающий 10,0 г/л гидролизата сернокислотного рыбной муки марки ФК, 10,0 г/л стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 12±2,0 г/л бактериологического агара, и дополнительно 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 40 г/л глюкозы, 0,25 г/л железа пирофосфата и 100 мл эмульсии яичного желтка; причем эмульсию яичного желтка вносят после автоклавирования питательной среды в течение 15 мин при 121°С и охлаждения до 50 – 45°С. Визуальную идентификацию культуры осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности в виде беловатой зоны преципитации вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida. Изобретение обеспечивает расширения арсенала способов селективного обнаружения Candida auris. 8 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris, предусматривающий посев культуры на питательную среду с добавками, инкубацию при температуре 37°C и визуальную идентификацию культуры, отличающийся тем, что посев осуществляют на питательную среду Легионелбакагар следующего состава, г/л: гидролизат сернокислотный рыбной муки марки ФК - 10,0, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0, бактериологический агар - 12±2,0, дополнительно содержащую дрожжевой экстракт 9,0 г/л, глюкозу - 40 г/л, железа пирофосфат - 0,25 г/л, после автоклавирования среды в течение 15 мин при 121°С и охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, а визуальную идентификацию культуры осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности в виде беловатой зоны преципитации вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida.