СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ CANDIDA ALBICANS ПО БИОРИТМАМ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12R1/725 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике грибов рода Candida.

Candida albicans является наиболее патогенным микроорганизмом среди грибов этого рода. Кандидоз развивается на фоне ослабления защитных сил организма и может вызвать суперинфекцию при туберкулезе, вирусных и стафилококковых пневмониях, дифтерии, СПИДе и может осложнять течение некоторых форм злокачественных опухолей [П.Н.Кашкин, Н.Д.Шеклаков «Руководство по медицинской микологии». - М.: Медицина, 1978. - 335 с.]. С.albicans вызывает поражение слизистых оболочек, дыхательных путей, пищеварительного тракта, мочеполовых органов, центральной нервной системы. Септические формы кандидоза возникают у недоношенных детей раннего возраста и истощенных взрослых. При кандидоносительстве из грибов рода Candida первое место занимает С.albicans - 47-75%, второе - С.tropicalis (7%), третье - С.krusei и С.kefur (0,5-2%). Кандидоносительство у детей в возрасте до 3-х лет наблюдается в 97% случаев, а кандидоз возникает у 52% детей. Поэтому лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых С.albicans, является актуальной.

Лабораторная диагностика кандидозов включает микроскопические исследования, постановку серологических реакций, изучение культуральных и биохимических свойств возбудителей. Посев исследуемого материала проводят на среду Сабуро с агаром и или сусло-агар с добавлением антибиотиков, через 3-4 дня проводят пересев на агаровую среду Сабуро. Рост колоний наблюдают в течение 5-6 дней - 1-1,5 месяца [«Справочник по микробиологическим и вирусологическим исследованиям». Под ред. М.О.Биргера. - М.: Медицина, 1967. - С.319-324; «Справочник по микробиологическим и вирусологическим исследованиям». Под ред. М.О.Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 463 с.; «Медицинская микробиология». Под ред. В.И.Покровского, O.K.Поздеева. - М.: Медицина, 1998. - С.861-866; «Медицинская микробиология». O.K.Поздеев. М. ГЭОТАР-Мед, 2001. - С.515-519].

Общепринятый способ лабораторной диагностики грибов рода Candida требует значительных затрат на питательные среды, рабочего времени и окончательный результат лабораторного исследования может продлиться до 1-го месяца.

Используя различный состав питательных сред, авторам удалось сократить время лабораторной идентификации грибов рода Candida до 48 часов. А.В.Милихина с соавт. получили питательную среду для идентификации грибов рода Candida по тесту хламидоспорообразованию [патент РФ №1330156]. Данный метод не позволяет провести дифференциацию грибов до вида.

В.И.Немыря и Ю.Н.Никитина предложили питательную среду для выделения и идентификации грибов Candida utilis [патент РФ №1382847], позволяющую в течение 48 часов провести идентификацию данного вида гриба. Предложенный способ не может быть использован для идентификации грибов С.albicans, играющих ведущую роль в патологии человека.

Для диагностики хронического урогенитального кандидоза предложен способ морфологической дифференциации грибов, вызывающих патологию у человека [Патент РФ №2199116]. Способ не позволяет провести дифференциацию грибов до вида.

Предложена питательная среда для грибов, позволяющая в течение 24 часов провести индикацию грибов С.albicans [Патент РФ №1366529]. Метод не позволяет провести дифференциацию грибов до вида.

Известен способ дифференциации грибов С.albicans и С.tropicalis от других дрожжеподобных грибов с использованием сложных питательных сред и индикатора [Патент РФ №1104153]. В данном случае для выбора этиотропного лечения необходимо провести идентификацию возбудителя до вида.

Г.В.Кубась и О.П.Николаева предложили способ идентификации C.albicans с помощью люминесцентного микроскопа с использованием специфического иммуноглобулина против C.albicans, меченного флюорохромизотиоцианатом [Патент РФ №1303615]. Для диагностики данным способом необходимо иметь люминесцентный микроскоп, специально обученный персонал и дорогостоящий реактив для прямой реакции иммунофлюоресценции.

В настоящее время интенсивно развивается отрасль науки - хронобиология, изучающая закономерности организации жизнедеятельности биологических систем во времени. В частности, известно несколько генетических локусов, отвечающих за генерацию циркадианного ритма физической активности у грибов.

Наиболее близким по техническому решению является изобретение «Способ диагностики госпитальных штаммов по биоритмам бактерий» Э.А.Кашуба с соавт. "Заявка №2004132995/13(036154) от 15.11.2004 г.", на который получено положительное решение о выдаче патента на изобретение от 02.12.2005 г. и выбранный в качестве прототипа.

Предложенный способ имеет следующие недостатки: 1) способ предназначен для идентификации бактерий, а не грибов; 2) биоритмы бактерий определяют по трем показателям: мезору, амплитудам репродуктивной активности и интегральному показателю хроноинфраструктуры бактерий, расчет которого проводят по формуле (X_i=[∑(А_24r/А_12r+A_24r/A_8r)]/2), что создает определенные сложности.

Задачей настоящего изобретения является разработать способ выявления С.albicans на основании биоритмов микроорганизма.

Технический результат - предложен простой, не требующий больших материальных затрат способ, основанный на хронобиологических свойствах генотипа грибов С.albicans.

Технический результат достигается тем, что согласно изобретению исследуемую культуру грибов культивируют 24 часа, проводят стандартизацию взвеси грибов и на поверхность плотной питательной среды вносят грибы в концентрации 300 КОЕ/мл, затем в течение 24 часов определяют количество выросших колоний с 4-часовым интервалом при показателе мезора от 90 до 113 и ультрадианном биоритме выделенный штамм относят к С.albicans.

Сущность способа достигается тем, что согласно изобретению показания мезора от 90 до 113 и ультрадианный биоритм в условиях проведения данного опыта являются проявлением генотипа грибов С.albicans.

По сравнению с прототипом предложенный способ уменьшает объем проводимых исследований, в частности не требуется проводить расчет по математическим формулам, позволяет идентифицировать выделенный микроорганизм гриба до вида, что необходимо для выбора этиотропного лечения больных кандидозом.

Предлагаемый способ осуществляли следующим образом: Популяцию гриба выращивали на среде Сабуро с теллуритом в течение 24 часов при температуре 37°С, получали концентрацию грибов в количестве 3 тыс. КОЕ/мл, используя прибор «Densi-La-Meter» фирмы «Lachema» и стандарт мутности по Мак Фарланду, приготовленную взвесь в количестве 0,1 мл вносили на поверхность плотной питательной среды Сабуро с теллуритом и в течение 24 часов культивирования грибов при температуре 37°С проводили подсчет количества выросших колоний с 4-часовым интервалом. Определяли число КОЕ/мл. По результатам исследований определяли мезор и биоритм грибов.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1.

Больной Н., 2,5 года. Диагноз: Кандидоз ротовой полости. Из зева больного через 24 часа культивирования на среде Сабуро с теллуритом при температуре 37°С выделены грибы рода Candida. Используя прибор «Densi-La-Meter» фирмы «Lachema», взвесь микроорганизмов доводили до концентрации 3×10⁸ КОЕ/мл по Мак Фарланду. Готовили рабочую концентрацию грибов 3×10³ КОЕ/мл и полученную взвесь в количестве 0,1 мл вносили на поверхность плотной питательной среды Сабуро с теллуритом. В течение 24 часов определяли количество выросших колоний с 4-часовым интервалом. Показатель мезора выделенной культуры составил 98, а временная организация исследуемой культуры характеризовалась преобладанием ультрадианного спектра с характерным пиком в 12 часов дня. На основании полученных данных выделенная культура отнесена к виду С.albicans.

Пример 2.

При бактериологическом исследовании материала из зева здорового ребенка выделены грибы. Культуру грибов выращивали в термостате 24 часа при температуре 37°С на среде Сабуро с теллуритом, готовили рабочую концентрацию грибов 3×10³ КОЕ/мл и высевали в количестве по 0,1 мл взвеси на 3 чашки со средой Сабуро с теллуритом. В течение 24 часов определяли КОЕ через каждые 4 часа. Мезор выделенной культуры составил 102, а временная организация выделенной культуры характеризовалась так: ультрадианный ритм с пиком в 12 часов в первые сутки. Выделенная культура отнесена к виду С.albicans.

Пример 3.

Грибы рода Candida выделены из зева носителя. Накопление грибов, приготовление рабочей концентрации и посев рабочей взвеси проводили на среду Сабуро с теллуритом в соответствии с примером 1. В течение 48 часов определяли КОЕ через каждые 4 часа. Выделенная культура имела четкий циркадианный биоритм, а мезор составил 72. Культура грибов не отнесена к виду С.albicans.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для идентификации грибов вида С.albicans.

Предлагаемый способ апробирован на кафедре микробиологии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава. Было получено 936 результатов исследований. В качестве контрольных исследований использованы музейные штаммы Candida spp. Музейный штамм С.albicans получен из американской коллекции типовых культур, АТСС 24433. Виды С.tropicalis, С.kefur и C.krusei выделены от носителей и идентифицированы в бактериологической лаборатории Областной клинической больницы №1 г.Тюмени по биологическим свойствам как музейные варианты. Хронобиологические свойства музейных штаммов изучены в соответствии с предложенным способом. Результаты исследований представлены в таблице.

ТаблицаХронобиологические свойства музейных штаммов Candida spp.Виды CandidaАмплитуда,
значенияМезор,
значенияПреобладающий биоритмС.albicans,46,3±15,36101,6±11,27УльтрадианныйС.tropicalis,66,1±11,2874,9±8,19ЦиркадианныйС.kefur82,2±13,5767,1±9,52ЦиркадианныйС.krusei157,3±25,74221,2±18,09Циркадианный

Исследования показали, что временная организация пролиферативной активности С.tropicalis, С.krusei и С.kefur характеризовалась циркадианным спектром с 12 и 8-часовой гармоникой. У С.albicans преобладал ультрадианный спект с 6-часовой гармоникой.

Способ выявления С.albicans по биоритмам позволяет проводить идентификацию грибов С.albicans, не требуют больших материальных затрат на оборудование и питательные среды. Идентификация возбудителей проводится с 95-100% достоверностью в течение 24 часов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике грибов рода Candida. Выявление Candida albicans проводят по биоритмам гриба. Исследуемую культуру грибов культивируют 24 часа, затем на поверхность плотной питательной среды вносят взвесь грибов в концентрации 300 КОЕ/мл в количестве 0,1 мл и в течение 24 часов определяют количество выросших колоний с 4-часовым интервалом, при показателе мезора от 90 до 113 и ультрадианном биоритме выделенный штамм относят к C.albicans. Способ не требуют больших материальных затрат на оборудование и питательные среды и позволяет провести идентификацию возбудителей в течение 24 часов с высокой достоверностью. 1 табл.

Способ выявления Candida albicans, характеризующийся тем, что исследуемую культуру грибов культивируют 24 ч, затем на поверхность плотной питательной среды вносят взвесь грибов в концентрации 300 КОЕ/мл в количестве 0,1 мл и в течение 24 ч определяют количество выросших колоний с 4-часовым интервалом, при показателе мезора от 90 до 113 и ультрадианном биоритме выделенный штамм относят к C.albicans.