Штамм дрожжевого гриба вида Candida duobushaemulonii, предназначенный для использования в качестве референтного для фенотипической идентификации при лабораторной диагностике кандидозов Российский патент 2025 года по МПК C12N1/16 C12Q1/04 C12R1/72 

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской микологии, а также к клинической микробиологии, и может быть использовано лаборантом или врачом-исследователем для проведения идентификации грибов вида Candida duobushaemulonii, выделенных при лабораторном исследовании клинического материала от животных и человека.

Поверхностные и системные кандидозы животных являются актуальной проблемой ветеринарной медицины. Большую долю в этиологии микозов занимают грибы рода Candida, являющиеся распространенными оппортунистическими патогенами животных и человека. В последние годы расширяется видовой состав клинически значимых грибов (в т.ч. рода Candida), распространяются новые для РФ виды, ранее не встречавшиеся. Если раньше наиболее часто встречался вид С.albicans, в последние годы у животных возросла распространенность видов Candida non-albicans [Овчинников Р.С, Самылина И.В., Гайнуллина А.Г. и др. Оппортунистические дрожжевые грибы у животных-компаньонов в Московском регионе. Ветеринария. 2023; 4:13-19].

Учитывая, что известно около 200 видов рода Candida, лабораторная диагностика и видовая идентификация кандид представляет существенные трудности. Современные аппаратные методы идентификации, такие как масс-спектрометрия MALDI-TOF и бактериологические анализаторы, доступны лишь для единичных ветеринарных лабораторий, поэтому во многих лабораториях существует потребность в доступных фенотипических методах идентификации.

Для облегчения рутинной видовой идентификации грибов рода Candida, предлагается использовать референтные штаммы, обладающие типичными для определенного вида фенотипическими характеристиками, без необходимости использования дорогостоящего оборудования.

Одним из видов рода Candida non-albicans является Candida duobushaemulonii, который входит в комплекс, включающий также виды С.haemulonii sensu stricto, С.duobushaemulonii, и С.haemulonii var. vulnera. Близкородственными видами являются Candida pseudohaemulonii и Candida amis.

Виды, входящие в этот комплекс, обладают множественной лекарственной устойчивостью к противогрибковым препаратам и способны вызвать различные проявления микозов - поверхностных, глубоких и системных.

Вид С.duobushaemulonii, наряду с другими редкими и атипичными видами рода Candida, недавно был диагностирован у животных на территории РФ [Самылина И.В., Гайнуллина А.Г., Овчинников Р.С. Редкие и атипичные виды дрожжевых грибов у животных. Ветеринария и кормление. 2023; 6: 60-64]. Это демонстрирует потребность в доступных методах фенотипической диагностики (идентификации) грибов данного вида.

Уровень техники.

В настоящее время для видовой идентификации микроорганизмов наиболее современным и эффективным методом идентификации является масс-спектрометрия MALDI-TOF (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией). Недостатком данного метода является высокая стоимость оборудования (масс-спектрометра), что делает метод недоступным для многих ветеринарных лабораторий.

Существуют автоматические биохимические анализаторы, однако они также дорогостоящие, с высокой стоимостью расходных материалов, что делает их использование нерациональным при проведении рутинных лабораторных исследований в ветеринарии.

Существуют наборы для ручной биохимической идентификации дрожжевых грибов рода Candida, где учитывается ферментация и ассимиляция различных субстратов (в основном углеводов). Пример - набор HiCandida (KB006R-20KT), производимый фирмой HiMedia (Индия). Однако данный набор, как и другие аналогичные наборы, не позволяет проводить идентификацию вида С.duobushaemulonii, т.к. не содержит в своей базе данных именно этот вид.

Предложен хромогенный агар для грибов Candida (например https://himedialabs.ru/crome), однако он также не позволяет идентифицировать вид С.duobushaemulonii.

Известны штаммы грибов, предлагаемые для контроля ростовых свойств питательных сред [Штаммы мицелиальных грибов Microsporum canis и Trichophyton mentagrophytes, предназначенные для контроля ростовых свойств питательных сред. Патент RU 2741097 С1 от 09.04.2020].

Однако данные штаммы не предполагается использовать в качестве референтных при видовой идентификации. Нам неизвестны примеры использования референтных штаммов грибов, включая Candida duobushaemulonii, для видовой идентификации, а также неизвестны неаппаратные методы фенотипической идентификации грибов данного вида.

Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является необходимость расширение арсенала штаммов грибов вида Candida duobushaemulonii, используемых в качестве референтных для фенотипической идентификации

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала штаммов грибов вида Candida duobushaemulonii, используемых в качестве референтных для фенотипической идентификации.

В качестве референтного предлагается использовать штамм Candida duobushaemulonii M155-23SnC, достоверно идентифицированный, хорошо изученный, охарактеризованный и депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦВИЭВ РАН под номером F-89. Данный штамм обладает типичными для вида для вида культуральными и морфологическими свойствами.

Благодаря использованию предлагаемого изобретения лаборант или врач-исследователь, может провести видовую идентификацию клинических изолятов грибов вида Candida duobushaemulonii, которые нельзя идентифицировать с помощью имеющихся в продаже наборов для биохимической идентификации грибов рода Candida. Идентификация проводится путем культивирования изолятов на наборе питательных сред, изучения макро- и микроморфологических признаков, определения ферментации набора углеводов и дополнительных тестов.

Candida duobushaemulonii относится к отделу Ascomycota, классу Saccharomycetes, порядку Saccharomycetales, семейству Debaryomycetaceae, род Candida, вид С.duobushaemulonii.

Штамм выделен с кожного покрова змеи с признаками дерматомикоза (г.Москва), в июле 2023 г.

Культура штамма растет на твердых питательных средах: среда Сабуро, картофельно-декстрозный агар, агар Чапека-Докса, хромогенный агар Candida, агар с бенгальским розовым при 25-27°С в аэробных условиях 24-72 часа.

На среде Сабуро образует округлые, блестящие, выпуклые колонии кремового-белого цвета, край ровный. Реверс желтый. Диаметр колоний при инкубировании 25-27°С в аэробных условиях 72 часа составляет 2-3 мм. Пигмент не образуют.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример № 1. Авторский штамм микроорганизма Candida duobushaemulonii F-89.

1. Вид микроорганизма: Candida duobushaemulonii

2. Штамм депонирован во Всероссийская государственная коллекция патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-89

3. Основание для депонирования: референтный штамм для проведения идентификации по фенотипическим признакам при лабораторной диагностике кандидозов

4. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» грибы рода Candida относятся к четвертой группе патогенности

5. Способ получения штамма (когда, где и кем получен): штамм выделен от естественного хозяина при микологическом исследовании клинического материала от змеи с признаками дерматомикоза (г.Москва), в июле 2023 г. в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦВИЭВ РАН авторами штамма

6. Где и кем идентифицирована культура: в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦ ВИЭВ РАН, авторами штамма.

7. Методы идентификации: штамм идентифицирован на основании изученных морфологических и физиологических свойств в соответствии с микологическими определителями клинически значимых грибов с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF.

8. Культуральные особенности: культура штамма растет на твердых питательных средах: среда Сабуро, картофельно-декстрозный агар, агар Чапека-Докса, хромогенный агар Candida, агар с бенгальским розовым при 25-27°С в аэробных условиях. Время температура

9. При культивировании в жидкой среде Сабуро спустя 24 часа образуется 1*10⁸-1*10⁹ КОЕ/мл дрожжевых клеток.

10. Морфологические особенности:

А. Макроморфологические признаки на питательных средах

Колонии на среде Сабуро: округлые, блестящие, выпуклые, кремового-белого цвета, край ровный. Реверс желтый. Диаметр колоний на 3 сутки 2-3 мм. Пигмент не образуют.

Б. Микроморфологические признаки: после 48-часовой инкубации при 25-27°С образуются только шаровидные дрожжевые клетки (2,5-10 мкм в диаметре)

11. Тест на образование хламидоспор по Дальмау: хламидоспоры и псевдогифы не образуются

12. Рост с 0,1% раствором циклогексимида: наблюдается наличие роста

13. Биохимическая характеристика штамма: глюкоза+, мелибиоза -, лактоза -, мальтоза+, сахароза+, галактоза -, целлобиоза -, инозит -, ксилоза-, дульцит -, раффиноза+, трегалоза+, уреазная активность -.

14. Условия культивирования: культура штамма выращивается на агаре Сабуро (pH 6,7-6,9) при температуре 26-28°С.Срок инкубирования 24-72 часа.

15. Условия хранения: культуры штамма хранятся при температуре -70°С в криогенных пробирках, при температуре 4-6°С или в пробирках на агаре Сабуро под ватно-марлевыми пробками при температуре 4-6°С. Периодичность пересевов на питательной среде один раз в месяц, из криогенных пробирок раз в год.

Пример № 2. Пример роста на хромогенной среде Candida Chrom agar. На питательной среде Candida Chrom agar при 26°С через 48 часов инкубации культура С.duobushaemulonii сформировала округлые, выпуклые, блестящие колонии белого цвета с ровным краем, при длительной инкубации (72 часа) наблюдался розоватый оттенок.

Пример № 3. Пример роста культуры на агаре с бенгальским розовым. На питательной среде RBA (rose bengal agar) при 26°С через 48 часов инкубации культура С.duobushaemulonii сформировала округлые, выпуклые, матовые колонии с ровным краем. По краям колонии светло-розового цвета, к центру становятся насыщенно малиновыми.

Пример № 4. Пример роста на агаре Чапека-Докса. На питательной среде при 26°С через 48 часов инкубации культура С.duobushaemulonii сформировала округлые, слегка выпуклые, блестящие колонии в форме «пуговки», в центре небольшой бугорок, плоский, ровный край, цвет - светло-бежевый.

Пример №5. Пример роста культуры на сердечно-мозговом агаре. На питательной среде при 26°С через 48 часов инкубации культура С.duobushaemulonii сформировала округлые, выпуклые, блестящие колонии с ровным краем. Цвет колонии от белого до кремового.

Пример № 6. Определение ферментации углеводов на наборе HiCandida (KB006R-20KT). Определение основано на изменении цвета среды, содержащей углевод и индикатор. Для этого теста на агаре Сабуро получали чистую культуру штамма. Использованы следующие тесты: наличие фермента уреазы, утилизация мелибиозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, галактозы, целлобиозы, инозитола, ксилозы, раффинозы, трегалозы.

Результаты теста: уреазная активность-, мелибиоза-, лактоза-, мальтоза, сахароза+, галактоза-, целлобиоза-, инозит-, ксилоза-, дульцит-, раффиноза+, трегалоза+.

В базе данных, прилагаемых к набору HiCandida, микроорганизма с указанными характеристиками не было обнаружено.

Пример № 7. Способ криогенного хранения штамма и его реактивации из замороженного состояния для использования в качестве референтного в лабораторной диагностике. Технология криогенной заморозки: взвесь чистой культуры микроорганизма (коэффициент мутности по МакФарланду 3-4) асептически инокулировали в пробирку CRYOBANK (DELTALAB, Испания), затем перемешивали и добавляли консервант. Стерильной пипеткой удаляли консервант и закрывали пробирку. После этого помещали в морозильную камеру при -60°…-80°С.

Пример № 8. Пример идентификации клинического изолята X неизвестного дрожжевого гриба.

При микологическом посеве клинического материала на среде Сабуро были получены округлые белые выпуклые колонии с матовым блеском, диаметр 2-3 мм (72 часа роста). На среде с роз бенгалом RBA получили округлые, выпуклые колонии, малинового цвета, по периферии розовые. На хромогенной среде Candida Chrom agar получили округлые выпуклые колонии белого цвета.

При микроскопии наблюдали округлые дрожжевые почкующиеся клетки, дочерние клетки меньше материнских. Клетки образуют короткие цепочки. Тест на ростовую трубку отрицательный.

Сравнение изученных характеристик изолята X с характеристиками референс-штамма С.duobushaemulonii M155-23SnC установило их полное фенотипическое соответствие по морфологии колоний на различных питательный средах (агар Сабуро, роз-бенгал агар RBC, хромогенная среда Candida Chrom agar) и по микроморфологическим свойствам.

На наборе HiCandida (KB006R-20KT) был получен следующий биохимический профиль изолята X: уреаза -, мелибиоза -, лактоза -, мальтоза -, сахароза +, галактоза -, целлобиоза -, инозит -, ксилоза-, дульцит -, раффиноза+, трегалоза+.

По биохимическим признакам с помощью данного набора изолят идентифицировали как Candida zeylanoides с вероятностью 85,2%, что является недостоверным результатом. Однако полученный биохимический профиль был идентичен профилю референс-штамма С.duobushaemulonii M155-23SnC.

Таким образом, по изученным фенотипическим характеристикам изолят X проявил полное сходство с референс-штаммом С.duobushaemulonii M155-23SnC, что позволило отнести изолят X к данному виду. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF подтвердил принадлежность изолята X к виду С.duobushaemulonii.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым штаммам грибов вида Candida duobushaemulonii, и может быть использовано в медицине для лабораторной фенотипической идентификации возбудителей кандидозов. Предложен штамм Candida duobushaemulonii M155-23SnC, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-89. Данный штамм обладает типичными для вида культуральными и морфологическими свойствами. Изобретение позволяет расширить арсенал штаммов грибов вида Candida duobushaemulonii, используемых в качестве референтных для фенотипической идентификации грибов вида Candida duobushaemulonii, выделенных при лабораторном исследовании клинического материала от животных и человека. 8 пр.

Штамм дрожжевого гриба Candida duobushaemulonii, предназначенный для использования в качестве референтного для лабораторной фенотипической идентификации возбудителей кандидозов, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-89.