Способ ранней диагностики функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом Российский патент 2025 года по МПК G01N33/74 G01N27/62 G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской экологии, гигиенической диагностике и к гастроэнтерологии. Изобретение может быть использовано для выполнения ранней диагностики функциональной диспепсии у детей дошкольного возраста 4-6 лет, возникающей под воздействием свинца.

Согласно формулировке, предложенной постоянно действующим комитетом по функциональным заболеваниям Всемирного конгресса гастроэнтерологов в 1994 г., синдром диспепсии (далее - СД) определяется как комплекс расстройств, включающий боль или ощущение дискомфорта в эпигастрии, чувство переполнения в эпигастральной области после еды, раннее насыщение, тошноту, рвоту, отрыжку, изжогу.

Согласно Международной классификации болезней (МКБ-10) заболевание «Диспепсия» относится к классу К30.

У детей различают:

- простую диспепсию (связана с алиментарными факторами - погрешностями во вскармливании ребенка: перекормом, однообразным питанием, нарушением диеты кормящей матери, быстрым переводом на искусственное вскармливание, введением прикорма; у более старших детей простая диспепсия может развиваться при злоупотреблении фаст-фудом, газировками, несоблюдении режима питания, попадание токсичных лекарственных и других химических веществ, повышенных учебных нагрузках, стрессовых ситуациях);

- синдром желудочной диспепсии (наличие абдоминальных болей или дискомфорта в верхней части живота, при этом могут быть и другие симптомы: тошнота, изжога, отрыжка, чувство насыщения и переполнения, вздутие живота и др. Симптомы могут быть связаны с приемом пищи или не зависеть от него);

- и хроническую диспепсию (если симптомы отмечаются в течение 3 и более месяцев).

Существует две формы диспепсии (Д.В. Печкуров, А.В. Горелов «Синдром диспепсии у детей, дифференциальный диагноз, дифференцированный подход к лечению» /«РМЖ» №17, 2012):

- органическая диспепсия (характеризуется наличием язвы желудка и двенадцатиперстной кишки с повреждением слизистой оболочки пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки);

- и функциональная диспепсия (абдоминальная (в верхней части) или ретростернальная боль, дискомфорт, изжога, тошнота, рвота, вздутие или другие симптомы, указывающие на вовлечение в процесс проксимальных отделов желудочно-кишечного тракта и продолжающиеся не менее 4 недель, при условии, что обследование желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) не выявило органической патологии).

Состояние окружающей среды всегда являлось одним из наиболее важных факторов, влияющих на жизнедеятельность человека и общества в целом. Тяжелые металлы занимают второе место по токсичности среди всех веществ, загрязняющих окружающую среду, превышение их содержания приводит к развитию множества заболеваний.

Среди химических факторов риска развития негативных эффектов со стороны болезни ЖКТ к числу приоритетных по уровню и частоте воздействия относится свинец. Широкое использование свинца в различных отраслях промышленности, выделение его с выбросами автотранспорта обусловило риск непрофессионального воздействия на организм неработающего населения, в том числе на детей и подростков.

В уровне техники установлены два вида известных методов диагностики функциональной диспепсии:

1. Основанные на использовании в качестве диагностических критериев лабораторных и функциональных показателей;

2. Основанные на использовании в качестве диагностических критериев генетических показателей.

Известные методы, основанные на использовании в качестве диагностических критериев лабораторных и функциональных показателей:

- патент РФ №2270610 «Способ диагностики хронического гастродуоденита и функциональной диспепсии у детей». Проводят обследование больного, при этом газохроматографическим методом определяют в слюне уксусную, пропионовую и масляную кислоты и при концентрации любой из трех кислот: уксусной больше 0,910 ммоль/л, пропионовой больше 0,150 ммоль/л, масляной больше 0,013 ммоль/л диагностируют хронический гастродуоденит, а при концентрациях кислот: уксусной в пределах больше 0,010 до 0,910 ммоль/л, пропионовой до 0,150 ммоль/л, масляной до 0,013 ммоль/л диагностируют функциональную диспепсию.

- патент РФ №2255337 «Способ дифференциальной диагностики хронического гастродуоденита и функциональной диспепсии у детей». У детей исследуют клинико-лабораторные показатели, при этом дополнительно определяют спонтанную адгезию лейкоцитов и их чувствительность к модуляторам клеточной адгезии -фитогемаглютинину (ФГА), теофиллину, тималину. При показателях функциональной активности лейкоцитов в пределах нормы: спонтанная адгезия нейтрофилов 28,03±2,0%; моноцитов 30,04±1,27%; лимфоцитов 20,81±0,97% и модулированной адгезии нейтрофилов: ФГА 31,02±1,27%, теофиллин 30,88±1,07%, тималин 32,66±2,01%; моноцитов: ФГА-32,15±1,11%, теофилин 31,02±2,07%, тималин 31,54±1,21%, лимфоцитов: ФГА 23,05±1,27%, теофиллин 22,14±1,12%, тималин 21,98±1,09%, устанавливают диагноз функциональной диспепсии. При показателях функциональной активности лейкоцитов, превышающих пределы нормы, диагностируют хронический гастродуоденит.

- патент РФ №2442538 «Способ оценки динамики течения неязвенной диспепсии у детей». Проводят оценку в три этапа. На первом этапе оценивают в баллах симптомы неязвенной диспепсии: частоту и интенсивность боли в животе, изжогу, тошноту, рвоту, отрыжку, дисфагию, вздутие, горечь во рту. На втором этапе рассчитывают индекс выраженности диспепсии, по полученным данным диагностируют неязвенную диспепсию у детей. На третьем этапе находят разность индексов выраженности диспепсии, по полученным данным количественно оценивают степень выраженности диспепсии и динамику интенсивности заболевания.

- патент РФ №2392850 «Способ диагностики функциональной диспепсии и активного хронического гастрита». Проводят многоканальную компьютерную электрогастрографию. При снижении коэффициента частоты основного электрического ритма до 0,39 и ниже, наличии аритмии в обе фазы исследования и снижении показателя связи по медленным волнам по сравнению с нормой диагностируется активный хронический гастрит. При повышении коэффициента частоты основного электрического ритма до 1,24 и выше, наличии выраженной аритмии в обе фазы исследования и снижении показателя связи по медленным волнам по сравнению с нормой диагностируется функциональная диспепсия.

Недостатками указанных известных способов является недостаточная точность, особенно в условиях воздействия тяжелых металлов, т.к. установлено, что у 60-80% рабочих, работающих в условиях воздействия свинца, отмечены нарушения функций желудочно-кишечного тракта при отсутствии клинико - лабораторных симптомов интоксикации («Клинико-морфологические особенности гастропатий от воздействия свинца». Авторы: Соркина Н.С., Лощилов Ю.А., Комарова С.Г., ФГБНУ «НИИ медицины труда»).

Также известны методы диагностики функциональной диспепсии, основанные на генетических исследованиях:

- В статье Маев И.В., Кучерявый Ю.А., Андреев Д.Н. «Функциональная диспепсия: эпидемиология, классификация, этиопатогенез, диагностика и лечение». - М.: ООО «СТ-Принт», 2015. - 40 с. указано, что в генезе функциональной диспепсии определенную роль имеет наследственный фактор. Установлено, в частности, что полиморфизм C825T гена GNB3 может иметь значение в рамках этиопатогенеза данной патологии. Риск развития диспепсии у лиц с генотипом GNB3 СС оказывается в 2 раза выше, чем у людей с генотипами ТТ или ТС. В ряде других исследований была отмечена связь развития функциональной диспепсии со следующими генетическими вариациями:

IL-17F - 7488T (Arisawa T. et al., 2007);

MIF - G-173C (Arisawa T. et al., 2007);

CCK1 интрон 1 - 779 TC (Tahara T. et al., 2009);

COX-1 - T-1676C (Arisawa T. et al., 2008);

nNOS - rs2682826 T аллель (Park J.M. et al., 2014);

ADRB2 - rs1042714 G аллель (Kushnir V.M. et al., 2013).

- В статье И.Г. Пахомовой «Функциональная диспепсия как проявление нарушений моторики желудочно-кишечного тракта», журнал «Медицинский совет» № 6, 2013, с.33-38 указано, что основными этиопатогенетическими факторами возникновения функциональной диспепсии являются: нарушение моторной функции желудка, изменение чувствительности висцерального аппарата желудка, наследственность, в частности, наличие генов GN β3 СС (ТТ, ТС); SERT-P; SERT-SL; TRPV1; MIF-173C и другой генотип, психосоциальные факторы, инфекция Н. рylori, кислотно-пептический фактор.

- В последние годы активно рассматривается возможность генетической предрасположенности к развитию функциональной диспепсии. Известен ген, кодирующий бета-3 субъединицу внутриклеточного мессенджера G-протеина (GNB3 CС). Кроме того, обсуждается возможная роль полиморфизма промотора гена транспортера серотонина (SERT-P), причем генотип SERT-SL ассоциируется с риском постпрандиального дистресс-синдрома. В общей сложности изучено более 6 генов, влияющих на развитие данного заболевания, которые связаны с нейрогуморальными регуляторными структурами и их взаимодействием с органами пищеварительного тракта (Oshima T., Toyoshima F., Nakajima S., Fukui H., Watari J., Miwa H. Genetic factors for functional dyspepsia. J. Gastroenterol Hepatol., 2011; 26 (3): 83-87).

Недостатками указанных известных способов является то, что алгоритм и техника выполнения диагностических процедур предрасположенности либо развития функциональной диспепсии не учитывает модификацию патологического процесса экзогенными химическими факторами, в частности, свинцом.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы определения ранних проявлений функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред свинцом, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении ранней диагностики функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред свинцом, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний у детей уже на ранних стадиях его формирования.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом ранней диагностики функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом, согласно которому определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют содержание свинца в крови, в качестве лабораторных показателей определяют уровень дофамина и уровень ионизированного кальция в крови, а в качестве генетических показателей определяют при помощи метода полимеразной цепной реакции полиморфизм генов DRD2 и CALCR, используя в качестве праймера участок дезоксирибонуклеиновой кислоты путем исследования генотипов гена DRD2 C2137T (rs1800497), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и генотипов гена CALCR C1377T (rs1801197), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и при одновременном выполнении следующих условий: при содержания свинца в крови ребенка не менее чем 0,0173 мг/дм³, при превышении уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 44 пг/см³, не менее чем в 1,5 раза, и при содержании ионизированного кальция не менее чем 1,25 ммоль/ дм³, а также при наличии комбинации генотипа ТТ гена DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа ТТ гена CALCR C1377T (rs1801197) диагностируют у детей ранние проявления функциональной диспепсии, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом.

Поставленный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Последнее десятилетие приобретает актуальность, но остается до конца не решенным, вопрос возможного влияния токсичных и потенциально токсичных химических элементов в патогенезе желудочно-кишечных расстройств.

Современные научные изыскания не в полной мере освещают вопросы аддитивности компонентов средовой химической нагрузки и условий декомпенсации слабых генетически наследуемых компартментов регуляторных систем и обмена организма, лежащих в основе формирования патологии пищеварительной системы.

Детская популяция представляет собой группу высокого риска, так как дети имеют ряд физиологических особенностей, характеризуются наличием критических периодов развития, большей чувствительностью к влиянию токсичных веществ.

При воздействии химических соединений в первую очередь страдают неспецифические звенья защитных систем, в частности, иммунная и биохимическая системы, обеспечивающие поддержание гомеостаза. Комплекс биохимических реакций, направленных на метаболизм и трансформацию токсических соединений экзогенного происхождения, определяет развитие адаптационно-компенсаторных процессов. Нарушение согласованности этапов биотрансформации, являясь одним из общих механизмов эндогенной интоксикации, способствует возникновению болезней ЖКТ.

При разбалансировке в силу различных обстоятельств возможна конкуренция между ионами металлов, так свинец способен конкурентно заменять, например, селен в ферменте детоксикации глутатионпероксидазе, снижая его функционал. Металлы способны нарушать апоптоз, усиливать мутацию и клональный рост клеток, увеличивать образование свободных радикалов, что вызывает генотоксические эффекты.

Функциональная диспепсия у детей проявляется характерным симптомокомплексом: дискомфортом или болью в эпигастрии, чувством переполнения желудка после еды, ранним насыщением, тошнотой, рвотой, отрыжкой, изжогой, запором или диареей. Частота диспепсии у детей объясняется анатомо-физиологическими особенностями ЖКТ, нервной системы, состоянием обмена веществ в детском возрасте. Диспепсия у детей является полиэтиологичным и гетерогенным синдромом, который может сопровождать широкий круг патологических состояний. В структуре гастроэнтерологической патологии по обращаемости синдром диспепсии занимает до 95%, причем преобладает именно функциональная диспепсия. Исходя из особенности детского возраста, удельный вес органической диспепсии составляет у дошкольников всего лишь около 1%, причем увеличиваясь только в старших возрастных группах.

Благодаря расширению в предлагаемом способе прогностических информационных показателей (одновременное использование лабораторных и генетических показателей) и одновременно с сочетанным наличием химического токсиканта - свинца, в пробе крови и будет обеспечена точность оценки диагностики влияния этого соединения на возможное развитие указанной патологии.

В качестве критерия формирования у детей синдрома функциональной диспепсии в условиях избыточной контаминации свинцом рекомендуется использовать TT - вариантный генотип гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497), отвечающего, в том числе, за пищевое поведение, когда снижение плотности рецепторного поля приводит к стрессу из-за снижения базального уровня дофамина, что ведет к необходимости, слабо контролируемой потребности в повышении уровня потребления пищи, приводя к дисбалансу необходимости и фактического потребления, провоцируя функциональные диспептические проявления. Ген DRD2 кодирует рецептор дофамина - белок, располагающийся на поверхности нейронов, сопряженный с G-белками и ингибирующий аденилатциклазу под воздействием дофамина.

Дофамин - представитель класса молекул, называемых катехоламинами, которые служат в качестве нейротрансмиттеров и гормонов. В мозге дофамин является нейротрансмиттером и выпускается нервными клетками, чтобы подавать сигналы другим нервным клеткам. В периферической нервной системе дофамин выступает местным химическим посредником (синаптическим медиатором) в некоторых частях тела. Уже известно, что дофамин играет важную роль в мышлении, памяти, движении и вознаграждении. Однако недавно исследователи показали, что дофаминергическая нейротрансмиссия играет центральную роль в модулировании восприятия боли и анальгезии в определенных частях мозга, включая островковый аппарат, таламус, базальные ганглии, переднюю поясную кору и периакведуктальное серое вещество.

Ген CALCR кодирует аминокислотную последовательность рецептора к гормону кальцитонину. Кальцитонин - гормон щитовидной железы, регулирующий обмен кальция. Под воздействием кальцитонина происходит снижение уровня кальция в крови за счет снижения поступления кальция в кровь из костной ткани, а также за счет снижения реабсорбции кальция в почках и уменьшения всасывания кальция в кишечнике.

Одновременное присутствие в биологических средах металла свинца, обладающего сродством к ионам кальция (состояние окисления +2, т.е. аналогичное кальцию), усиливает нейропатические эффекты, усугубляет диспептические расстройства, типичные для интоксикации свинцом, приводит к усугублению процессов ремоделирования костной ткани, что характеризуется феноменом негативной гаптенной активации, и отражается повышением экспрессии специфического иммуноглобулина G (IgG) к свинцу.

Подтверждающим фактором нейротропных нарушений и регуляторного катехоламинового дисбаланса служит превышение референтного диапазона экспрессии дофамина, свидетельствующее о преимущественно симпатической вегетативной регуляции тонуса гладкой мускулатуры ЖКТ и коррекции пищевого поведения, снимающего контроллинг за физиологическим ограничением объема пищи.

Усугубляющим действие кальцитонина фактором и связанные с ним эффекты повышения содержания кальция, реализующиеся в депрессивном эффекте на нейромышечную регуляцию тонуса гладкой мускулатуры, замедленную эвакуацию пищевого содержимого желудка и 12-персной кишки с формированием диспептического синдрома служит избыточная контаминация биосред свинцом, превышающая референтную концентрацию (референтный уровень свинца в крови 0,0144±0,001 мг/дм³).

Клиническая значимость предлагаемых генетических показателей доказана методом корреляционно-регрессионного анализа, а также доказана дополнительная информационная связь изменений указанных совокупных критериев с превышением в крови над фоновым уровнем содержания свинца, что делает предлагаемый способ достоверным.

Генетический профиль детей с синдромом диспепсии и избыточной контаминацией свинцом (не менее чем 0,0173 мг/дм³) отличается повышенной частотой Т-аллеля гена рецептора дофамина DRD2 C2137T (rs1800497), (мультипликативная модель: показатель отношения шансов OR=3,83; доверительный интервал 95%CI=1,02-19,22, вероятность p=0,046). Связь указанного гена с риском развития функциональной диспепсии характеризуется следующими его параметрами: RR = 1,38; 95 % CI = 1,07-1,98.

Одновременно генетический профиль детей с синдромом функциональная диспепсия и избыточной контаминацией свинцом (не менее чем 0,0173 мг/дм³) отличается повышенной частотой Т-аллеля гена CALCR C1377T (rs1801197). Связь указанного гена с риском развития функциональной диспепсии доказывается следующей моделью: OR=4,91; CI=1,02-25,76; p=0,0316; (RR = 1,45; 95 % CI = 1,19-1,75), что соотносится с выявленной повышенной экспрессией дофамина и избыточным уровнем ионизированного кальция.

Таким образом, для установления ранних проявлений функциональной диспепсии у детей, ассоциированной с содержанием свинца в биосредах (кровь), рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипов кандидатных генов и в случае вариантной гомозиготы TT гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497), и TT вариантного генотипа гена кальцитонинового рецептора CALCR C1377T (rs1801197), превышения физиологического уровня содержания ионизированного кальция в крови дофамина, избыточном содержании свинца в крови, регистрируют наличие ранних проявлений синдрома функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, обусловленной избыточной контаминацией биосред свинцом.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности всех операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:

1. Проводят отбор группы дошкольников 4-6 лет одной этнической популяции, проживающих на неблагополучной по условиям проживания территории с повышенным содержанием в атмосфере воздуха свинца. Затем проводят отбор пробы крови у обследуемого ребенка - для определения содержания свинца в крови, а также уровня дофамина и ионизированного кальция. Указанные показатели определяют следующими методами:

- содержание свинца - методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500сх («Agilent Technologies Inc.», США) в соответствии c методическими указаниями МУК 4.1.3230 -14 и МУК 4.1.3161 -14;

- уровень дофамина - методом иммуноферментного анализа согласно инструкции к коммерческому набору Dopamine ELISA Fast Track (Labor Diagnostika Nord GmbH,Германия);

- уровень ионизированного кальция определяли методом ионоселективных электродов на анализаторе электролитов EASYLYTE CALCIUM Na/K/Ca/pH Medica Corporation (США).

2. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт : ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена DRD2 C2137T (rs1800497) и гена CALCR C1377T (rs1801197).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных гена DRD2 C2137T (rs1800497) и гена CALCR C1377T (rs1801197) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма гена DRD2 C2137T (rs1800497) и гена CALCR C1377T (rs1801197) (ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°C; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена DRD2 в исследуемом участке ДНК C2137T (rs1800497), а также гена CALCR в исследуемом участке ДНК C1377T (rs1801197) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается вариантное гомозиготное (ТТ) или гетерозиготное (CT) состояние гена CALCR C1377T (rs1801197), а также устанавливается вариантное гомозиготное (ТТ) или гетерозиготное (СТ) состояние гена DRD2 C2137T (rs1800497).

3. И при выполнении следующих условий: при одновременном наличии у ребенка ТТ генотипа гена DRD2 C2137T (rs1800497), а также генотипа ТТ гена CALCR C1377T (rs1801197), при превышении содержания свинца в крови ребенка в 1,2 и более раз по сравнению с нормой, равной 0,0144±0,001мг/дм³ (содержание свинца в крови не менее 0,0173мг/дм³), при повышении уровня сывороточного дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 44 пг/см³, не менее чем в 1,5 и более раз, и при содержании ионизированного кальция не менее чем 1,25 ммоль/ дм³, диагностируют у детей ранние проявления функциональной диспепсии, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа были сформированы несколько группы детей:

Группа наблюдения - дети, в крови которых установлено повышенное содержание свинца, с диагнозом «функциональная диспепсия» (28 чел.). Указанные дети были со следующими клиническими проявлениями заболевания: жжение в эпигастрии, боль в эпигастрии (21 человек), чувство сытости после приема пищи и раннее насыщение (25 человек), тошнота, ощущение вздутия в эпигастрии (19 человек).

Группа сравнения - дети, в крови которых не установлено повышенное содержание свинца, и без диагноза «функциональная диспепсия» (21 чел).

Также были обследованы дети (21 чел.), у которых было превышение в крови содержания свинца выше референтного уровня, но без диагноза «функциональная диспепсия».

Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

У всех обследуемых детей была взята проба венозной крови, исследование которых проводилось по вышеуказанной схеме.

Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.

Данные, полученные в результате исследований для детей из указанных выше трех групп, приведены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что у пациентов, которым поставлен диагноз «функциональная диспепсия» (примеры 1-4), выявлены одновременно следующие обстоятельства:

- превышение содержания свинца в крови ребенка в 1,20-1,33 раза по сравнению с нормой, равной 0,0144±0,001мг/л (содержание свинца у детей составляло 0,0173-0,0191 мг/дм³);

- превышение уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 44 пг/см³, составляет в 1,54-1,76 раза (уровень дофамина у детей группы наблюдения от 67,6 до 77,6 пг/см³);

- превышение уровня ионизированного кальция в 1,14-1,19 раза по сравнению с верхней границей нормы (норма 1,01-1,10 ммоль/ дм³) (содержание Са-ион. составляет от 1,25 до 1,31 ммоль/ дм³);

- наличие в совокупности комбинации ТТ генотипа гена DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа ТТ гена CALCR C1377T (rs1801197).

В то время как у пациентов группы сравнения без заболевания «функциональная диспепсия» (примеры 5-8) отсутствует одновременное наличие всех вышеуказанных диагностических показателей.

В третьей группе пациентов (примеры 9-12), у которых хотя и имеется превышение уровня свинца в крови и имеется превышение по дофамину, но одновременно с этим отсутствует комбинация заявляемых аллелей ТТ генотипов генов DRD2 и CALCR, диагноз «функциональная диспепсия» не выявлен, что доказывает достоверность предлагаемого способа.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам.

Пример 1. Пациент, 5 лет, русский, диагноз: «К30 Диспепсия». Жалобы на периодические боли в эпигастрии, изжогу, отрыжку, чувство сытости после приема пищи тошноту, ощущение вздутия в эпигастрии. Определяется высокий уровень свинца в крови - 0,0191 мг/дм³ (референтный уровень - 0,0144±0,001 мг/дм³). Определяется наличие ТТ генотипа гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа ТТ гена рецептора кальцитонина CALCR C1377T (rs1801197). Значение содержания IgG к свинцу: 0,17 у.е., т.е. в 1,7 раза выше верхней границы нормы. Содержание нейрорегуляторного маркера рецептора нейромедиатора дофамина - 77,6 пг/см³, т.е. выше верхней границы диапазона нормы (5,6-44 пг/см³) в 1,76 раза; повышено содержание ионизированного кальция, свидетельствующего об избыточной циркуляции кальция как последствие избыточной резорбции костного кальция под воздействием кальцитонина - 1,31 ммоль/ дм³ (норма 1,01-1,10 ммоль/ дм³). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к свинцу, уровня дофамина и маркера избыточного содержания кальция - ионизированного кальция, на фоне повышенного по отношению к референтному уровню содержания свинца в крови, а также наличие ТТ генотипа гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа ТТ гена рецептора кальцитонина CALCR C1377T (rs1801197), кодирующих белки ответственные за экспрессию гена дофаминового рецептора - регулятора пищевого поведения, при мутации которого возникает потребность в употреблении избыточного количества пища, а также гена кальцитонинового рецептора, при мутации которого возникает феномен резорбции кальция из костной ткани, что приводит к умеренной гиперкальциемии и опосредованной регуляторной нейромышечной гипотонии, задержке пищевого комка и усугубления диспептических проявлений, свинец способствует усилению данных эффектов из-за сродства к кальцию, тропности к нервной ткани, что приводит к формированию диспептических расстройств, реализации геноопосредованных функциональных нарушений нормальной деятельности желудка, ассоциированных с воздействием свинца, и фенотипически проявляющихся состоянием «К30 Диспепсия», в данном случае - функциональной диспепсии.

Пример 2. Пациент, 4 года, русский, здоров. Уровень свинца в крови - 0,0132 мг/дм³ (референтный уровень - 0,0144±0,001 мг/дм³) соответствует референтному диапазону. Определяется наличие CC генотипа гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа CC гена рецептора кальцитонина CALCR C1377T (rs1801197). Значение содержания IgG к свинцу: 0,085 у.е., т.е. ниже верхней границы нормы (отсутствие сенсибилизации к свинцу). Содержание нейрорегуляторного маркера рецептора нейромедиатора дофамина - 39,1 пг/см³, соответствует диапазону нормы (5,6-44 пг/см³); содержание ионизированного кальция - 1,06 ммоль/ дм³ соответствует диапазону нормы (норма 1,01-1,10 ммоль/ дм³). Таким образом, отсутствие ТТ генотипа гена дофаминового рецептора DRD2 C2137T (rs1800497) (наличие его дикого СС генотипа) и генотипа ТТ гена рецептора кальцитонина CALCR C1377T (rs1801197) (наличие его дикого СС генотипа) позволяет минимизировать избыточный активационный эффект дофамина, формирующий потребность в дополнительном поступлении пищи, а также оптимизировать экспрессию кальцитонина, вызывающего резорбцию костного кальция и формирование его накопления в нервной ткани, что ведет к гипотонии гладкой мускулатуры ЖКТ и задержке пищевого комка в желудке, а также уровня IgG к свинцу, что на фоне референтного содержания свинца в крови, не приводит к развитию эффектов нейроинтоксикации и не формирует у данного пациента, ассоциированное с действием свинца, развитие ранних проявлений диспептических расстройств, в том числе, с фенотипическими проявлениями функциональной диспепсии.

Таким образом, заявляемый способ позволяет уже на ранних стадиях устанавливать проявления функциональной диспепсии у детей дошкольного возраста 4-6 лет, ассоциированной с контаминацией биосред свинцом.

Таблица 1. Данные по установлению критериев ранней диагностики заболеваний функциональной диспепсией у детей в условиях контаминации биосред свинцом предлагаемым способом

Пациент Содержание свинца в крови, мг/л (референтный уровень 0,0144±0,001 мг/дм³) Генотип гена DRD2
C2137T (rs1800497), определенного в пробе буккального эпителия Генотип гена CALCR C1377T (rs1801197), определенного в пробе буккального эпителия Уровень IgG к свинцу, у.е (Норма 0-0,1) Содержание Дофамин, пг/см³ (Норма 5,6-44 пг/см³) Содержание Ионизированный Са, ммоль/дм³ (Норма 1,01-1,10 ммоль/ дм³) Группа наблюдения 1. (4 лет) 0,0173 TT TT 0,12 67,6 1,25 2. (5 лет) 0,0185 TT TT 0,17 69,9 1,30 3. (4 лет) 0,0179 TT TT 0,16 77,6 1,31 4. (6 лет) 0,0191 TT TT 0,19 73,1 1,27 Группа сравнения 5. (6 лет) 0,0117 СС CТ 0,075 40,2 1,07 6. (4 лет) 0,0109 CT СС 0,09 37,9 1,01 7. (5 лет) 0,0111 CT СТ 0,08 33,6 1,03 8. (4 лет) 0,0142 СС CC 0,085 39,1 1,06 Пациенты с содержанием свинца в крови выше референтного уровня, но без диагноза «функциональная диспепсия» 9. (6 лет) 0,0160 TT СT 0,11 49,1 1,15 10. (5 лет) 0,0158 СT TT 0,11 47,2 1,12 11. (4 лет) 0,0154 СС СТ 0,10 45,0 1,09 12. (6 лет) 0,0149 СТ СС 0,10 46,0 1,10

Примечание: 1. CC - дикий гомозиготный генотип гена DRD2 C2137T (rs1800497); CT - гетерозиготный гомозиготный генотип гена DRD2 C2137T (rs1800497); TT - вариантный генотип гена DRD2 C2137T (rs1800497);

2. CC - дикий гомозиготный генотип гена CALCR C1377T (rs1801197); CT - гетерозиготный гомозиготный генотип гена CALCR C1377T (rs1801197); TT - вариантный генотип гена CALCR C1377T (rs1801197);

3. Зависимость уровня IgG к свинцу и содержания дофамина от концентрации свинца в крови (мг/дм³) достоверна (R²= 0,77-0.97; p<0,05), где R² – коэффициент детерминации; р - вероятность.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской экологии, гигиенической диагностике и гастроэнтерологии, и может быть использовано для ранней диагностики функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом. При содержании свинца в крови ребенка не менее чем 0,0173 мг/дм³, при превышении уровня дофамина не менее чем в 1,5 раза по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 44 пг/см³, и при содержании ионизированного кальция не менее чем 1,25 ммоль/дм³, а также при наличии комбинации генотипов ТТ гена DRD2 C2137T (rs1800497) и ТТ гена CALCR C1377T (rs1801197) диагностируют у детей ранние проявления функциональной диспепсии, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом. Способ обеспечивает раннюю диагностику функциональной диспепсии, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом, у детей 4-6 лет за счет одновременного определения токсикологических, лабораторных и генетических показателей. 1 табл., 2 пр.

Способ ранней диагностики функциональной диспепсии у детей 4-6 лет, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом, характеризующийся тем, что определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют содержание свинца в крови, в качестве лабораторных показателей определяют уровень дофамина и уровень ионизированного кальция в крови, а в качестве генетических показателей определяют при помощи метода полимеразной цепной реакции полиморфизм генов DRD2 и CALCR, используя в качестве праймера участок дезоксирибонуклеиновой кислоты путем исследования генотипов гена DRD2 C2137T (rs1800497), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и генотипов гена CALCR C1377T (rs1801197), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании свинца в крови ребенка не менее чем 0,0173 мг/дм³, при превышении уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 44 пг/см³, не менее чем в 1,5 раза и при содержании ионизированного кальция не менее чем 1,25 ммоль/дм³, а также при наличии комбинации генотипа ТТ гена DRD2 C2137T (rs1800497) и генотипа ТТ гена CALCR C1377T (rs1801197) диагностируют у детей ранние проявления функциональной диспепсии, ассоциированной с избыточной контаминацией биосред свинцом.