СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА К ОКСИДАТИВНОМУ СТРЕССУ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, более конкретно к разделу внутренних болезней.

В настоящее время большинство исследователей уделяют внимание реализации стресс-реакции на уровне отдельных клеток, способных продуцировать повреждающие организм активные формы кислорода (АФК). К АФК относят атомы кислорода, несущие на внешней оболочке лишний электрон и в связи с чем имеющие отрицательный заряд: супероксид анион ( $$O_2^{-}$$ ), гидроксильный радикал (OH^-), а также радикал диоксида азота(NO₂), перекись водорода (H₂O₂) и др. Избыточные концентрации АФК повреждают в организме белки, липиды и ДНК, приводя к старению клеток и возникновению так называемых свободно-радикальных заболеваний таких как атеросклероз, эссенциальная гипертония, сенильная деменция типа Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рак и др.

Раннее выявление чувствительности индивида к оксидативному стрессу позволит своевременно начать профилактические мероприятия, направленные на предупреждение развития указанных выше заболеваний.

В свою очередь эти заболевания являются для организма стрессорами и еще в большей степени усиливают клеточный оксидативный или окислительный стресс с дальнейшей аггравацией патологического процесса (B. Uttara et al. Oxidative Stress and Neurodegenerative Diseases: A Review of Upstream and Downstream Antioxidant Therapeutic Options. Curr. Neuropharmacology.2009, 7 (1): 65-74).

Как показывают клинические и экспериментальные данные, чувствительность организма к повреждающим стрессорам внешней среды во многом зависит от функции мозгового и коркового слоев надпочечников, находящихся под контролем гипоталамо-гипофизарной системы.

Болезнь Аддисона-Бирмена с недостаточностью функции надпочечников у человека сопровождается весьма высокой чувствительностью к различным стрессорам, включая ряд инфекций, и может реализоваться на уровне фагоцитарных клеток с усилением синтеза АФК. Подобная картина наблюдается у адреналэктомированных животных.

Известен способ оценки уровней психоэмоционального стресса (К.В. Судаков «Социальные и биологические аспекты психоэмоционального стресса: пути защиты от его нежелательных последствий», Вестник международной академии наук, 2006, №1, стр.8-14). Он включает приборную регистрацию наиболее информативных физиологических показателей (частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, величины систолического и диастолического кровяного давления, показатели электромиограммы, кожно-гальванической реакции и др.). В представленном способе оценки уровней психоэмоционального стресса не учитывается оксидативный клеточный стресс, приводящий к развитию вышеуказанных патологий у человека.

В качестве прототипа нами выбран способ определения индивидуальной чувствительности к гипербарической оксигенации (авторское свидетельство SU №1246935). Указанный способ включает воздействие на лимфоциты периферической крови человека повышенным парциальным давлением кислорода или гипербарической оксигенацией. Повышенное давление кислорода является для клеток нефизиологическим фактором или стрессором. В результате действия подобного стрессора в лимфоцитах конкретного индивидуума происходят морфологические изменения хромосом (аберрации, делеции), которые отражают индивидуальную чувствительность к стрессу. Прототип обладает следующими недостатками:

- сложностью, поскольку предполагает культивирование лимфоцитов, использование аппаратуры для создания повышенного давления кислорода, оценку изменений структуры хромосом лимфоцитов;

- недостаточной точностью определения индивидуальной чувствительности к стрессовому воздействию, так как лимфоциты не обладают фагоцитарной активностью, не продуцируют экзогенные формы АФК и не могут участвовать непосредственно в развитии оксидативного стресса.

Нами поставлена задача: разработать простой достоверный способ определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу.

Технический результат заключается в обеспечении простоты и точности определения чувствительности человека к оксидативному стрессу за счет оценки продукции АФК нейтрофилами в реакции хемилюминесценции.

Нами установлено, что регистрация и сравнение интенсивности хемилюминесценции, например, индуцированной опсонизированным зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции стрессированных и нестрессированных нейтрофилов периферической крови конкретного индивидуума с оценкой величины коэффициента хемилюминесценции, т.е. соотношения числа импульсов в минуту нестрессированных нейтрофилов к числу импульсов в минуту стрессированных нейтрофилов, позволяет достоверно определять чувствительность исследуемого к оксидативному стрессу.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу получают суспензию нейтрофилов периферической крови. Регистрируют интенсивности исходной хемилюминесценции (ИХ) нейтрофилов и хемилюминесценции (НХ) после нагревания суспензии нейтрофилов в течение 30-60 секунд при температуре 42°C путем подсчета числа импульсов в минуту. При значении ИХ/НХ менее 3 выявляют чувствительность исследуемого к оксидативному стрессу.

При этом действие на нейтрофилы теплового шока в указанном режиме их нагревания сопровождается продукцией АФК, оценка которой в реакции хемилюминисценции путем подсчета импульсов в минуту позволяет достоверно определить чувствительность к оксидативному стрессу.

В частном случае регистрируют индуцированную опсонизированным зимозаном люминолзависимую хенмилюминесценцию.

Способ осуществляется следующим образом.

Популяцию нейтрофилов получают центрифугированием периферической крови пациентов на двойном градиенте плотности фиколлверографина (плотность нижнего раствора 1.119 г/см³, верхнего раствора - 1.077 г/см³) в течение 40 минут, скорость центрифугирования 400×g. Нейтрофилы удаляют микропипеткой из нижнего интерфазного слоя и отмывают 2 раза физиологическим раствором с последующей ресуспензией в бесцветном растворе Хенкса и подсчетом количества ядерных клеток в суспензии. Суспензия полученных нейтрофилов имеет чистоту 96-98%. Реакцию хемилюминесценции проводят в пластиковых пробирках, которые содержат 20 микролитров бесцветного Хенкса и 150 микролитров люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазинедион), например, фирмы Serva (Германия) в концентрации 2,5 мкг/мл. Пробирки помещают в барабан хемилюминометра и термостатируют в течение одного часа для достижения температуры 37°C, затем добавляют 100 микролитров суспензии нейтрофилов (2×10⁵ ядерных клеток) и спустя один час стимулируют нейтрофилы опсонизированным зимозаном. Например, фирмы Sigma (США) в объеме 100 микролитров и в концентрации 20 мг/мл. Учитывают индуцированную хемилюминесценцию и динамику продукции активных форм кислорода нейтрофилами в течение 30 минут, с оценкой количества импульсов в минуту. Для стрессирования нейтрофилов применяют тепловой шок - нагревание клеток в пробирках на водяной бане при 42°C в течение 30-60 секунд, т.е. краткосрочный стресс с последующим введением стрессированных и нестрессированных нейтрофилов в реакцию хемилюминесценции.

Математический анализ для сравнения исходной хемилюминесценции и показателей хемилюминесценции нейтрофилов после теплового шока продолжительностью 30 сек., 1 мин. и 3 мин. проводили с использованием биномиального распределения: $$P(r)=C_n^r{p}^r{(1-p)}^{n-r}$$ , где n - число опытов, p - вероятность успеха, r - число успешных опытов,. $$C_n^r$$ - число сочетаний из n по r, P(r) - вероятность наблюдать r успехов в n опытах при вероятности успеха P.

Оценка вероятности успеха получается путем максимилизации вероятности наблюдать r успехов при n испытаниях

95% доверительный интервал для вероятности успеха определяется по точным формулам биномиального распределения, приведенным в виде номограмм в статистической литературе (Вентцель Е.С. «Теория вероятностей», 1969 г., «Наука»)

В качестве доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Приводим примеры определения динамики продукции активных форм кислорода в реакции индуцированной опсонизированным зимозаном хемилюминесценции нейтрофилами у 4 из 17 пациентов разного возраста после теплового шока (число импульсов/мин.) (Табл. 1-4).

Пациент М., 88 лет, ж., 31.05.11 (1 - нейтрофилы без шока, 2 - шок 30 сек., 3 - шок 1 мин., 4 - шок 3 мин.) (Таблица 1).

Таблица 1 Исходные 1 мин 2 мин 4 мин 8 мин 10 мин 12 мин 14 мин 1.2254 4010 7187 9149 9375 9306 8538 7331

2. 1007 1613 3543 5015 5170 5210 4720 4172 3. 1176 1871 4160 533,9 5685 5494 4784 4008 4. 347 429 1194 2073 2637 2454 2335 1892

Пациент X., 86 лет, м, 31.05.11 (1 - нейтрофилы без шока, 2 - шок 30 сек., 3 - шок 1 мин., 4 - шок 3 мин) (Таблица 2).

Таблица 2 Исходные 1 мин 2 мин 4 мин 8 мин 10 мин 12 мин 14 мин 1. 1993 2619 8536 13526 15690 15824 15427 14253 2. 366 488 1619 2941 3905 4666 4700 4463 3.204 272 729 1308 1641 1828 1854 1913 4. 216 176 416 770 1036 1207 1080 1146

Пациент Ф, 93 года, ж, 23.05.11 (1 - нейтрофилы без шока, 2 - шок 30 сек., 3 - шок 1 мин., 4 - шок 3 мин) (Таблица 3)..

Таблица 3 Исходные 2 мин 4 мин 6 мин 10 мин 12 мин 1. 1022 11068 14961 14825 11594 8721 2. 316 2965 5234 5194 4562 3701 3. 259 2026 3845 4041 3946 3133 4. 131 1284 2754 2801 2603 1986

Пациент В, 26 лет, ж, 23.05.11 (1 - нейтрофилы без шока, 2 - шок 30 сек., 3 - шок 1 мин., 4 - шок 3 мин) (Таблица 4).

Таблица 4 Исходные 2 мин 4 мин 6 мин 10 мин 12 мин 1. 1589 8289 18524 18271 16828 12784 2. 343 1800 3700 3953 3883 2884 3. 588 2767 6940 6980 7063 5280 4. 787 2781 7120 7000 7400 6107

На рисунках 1-3 приведены кривые динамики отношения интенсивности исходной хемилюминесценции нейтрофилов к интенсивности хемилюминесценции нейтрофилов после теплового шока различной длительности для 17 пациентов разного возраста. Вычисляли вероятность того, что отношение интенсивности исходной хемилюминесценции к интенсивности хемилюминесценции после теплового шока достигает максимума в пределах первых 3 минут. Например, по данным хемилюминесценции после теплового шока длительностью 30 секунд, представленным на рис.1, вероятность того, что максимум отношения наступает ранее 3 минут равна 14/17=0.82 при 95% доверительном интервале от 0.59 до 0.84. Результаты расчета для длительности теплового шока 30 сек., 1 мин., 3 мин. представлены в таблице 5.

Таблица 5 Время теплового шока Вероятность проявления максимальной чувствительности Нижнее значение 95% доверительного интервала Верхнее значение 95% доверительного интервала

  в первые 3 мин     30 секунд 0.82 0.59 0.84 1 минута 0.89 0.62 0.99 3 минуты 0.71 0.45 0.88

Как видно из таблицы большие значения доверительного интервала зарегистрированы при продолжительности теплового шока 30 сек. и 1 мин. Статистически значимое увеличение коэффициента хемилюминесценции нейтрофилов (по оси ординат) для 3 типов стресса зарегистрировано в первую минуту после действия стрессора, что указывает на необходимость определения индивидуальной чувствительности к оксидативному стрессу именно в этот промежуток времени.

Клинические примеры изменения чувствительности пациентов к оксидативному стрессу в результате лечения.

1. Пациентка Р., 84 года

Диагноз: гипертоническая болезнь 3 стадии, ишемическая болезнь сердца (ИБС), кардиосклероз, пневмосклероз, нефроангиосклероз. До госпитализации коэффициент хемилюминесценции нейтрофилов составил 1,75: 7616 импульсов (исходная хемилюминесценция) и 4338 импульсов (после стресса). Через 2 недели лечения амлодипином, предукталом, аспирином, каптоприлом, поливитаминами, преднизолоном коэффициент хемилюминесценции составил 4,56 при исходной хемилюминесценции нейтрофилов 406 импульсов и после действия теплового шока 89 импульсов, т.е. коэффициент увеличился в 2,6 раза.

2. Пациент О., 92 года. Диагноз: перелом шейки бедра. До лечения коэффициент хемилюминесценции составил 2,84 от соотношения исходной хемилюминесценции нейтрофилов 68621 импульс к хемилюминисценции после стресса 24146 импульсов. После лечения 7 сеансами низкоинтенсивной лазерной терапии коэффициент хемилюминесценции равнялся 3,75 от соотношения исходной хемилюминесценции 6484 импульса к хемилюминесценции нейтрофилов после стресса 1725 импульсов, то есть увеличился в 1,3 раза. Низкоинтенсивная лазерная терапия снижает воспаление и синтез АФК фагоцитами.

3. Пациентка В., 98 лет. Диагноз: ИБС, гипофункция щитовидной железы, кахексия. До лечения коэффициент хемилюминесценции составил 0,89 от соотношения исходной хемилюминесценции нейтрофилов 6961 импульс к хемилюминесценции после теплового шока 7741 импульс. Лечение тироксином, аспирином, комплексом витаминов В1, В6, В12, рибоксином, пирацетамом, предукталом в течение 2 недель привело к увеличению коэффициента до 13,8.

Эти примеры показывают, что госпитализация и адекватное лечение заболеваний у пациентов приводят к уменьшению чувствительности к оксидативному стрессу вследствие уменьшения проявлений патологических состояний как стрессоров, а также уменьшения продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками по причине активации антистрессорных генов антивоспалительными или антиоксидантными свойствами лекарств.

На рисунках 4 и 5 демонстрируется зависимость числа импульсов в минуту (продукция АФК) в нейтрофилах от возраста и дозы (мг) аспирина и индометацина, обладающих стимулирующим действием на антистрессорные гены клеток, антивоспалительным и антиоксидантным эффектами. Уменьшение продукции АФК нейтрофилами у пациентов разного возраста пропорционально дозе используемых препаратов (доза-эффект).

Определяя чувствительность людей к оксидативному стрессу, можно повысить эффективность лечения различных патологий в клиниках, своевременно проводить профилактические и реабилитационные мероприятия с предотвращением трудопотери и отбирать стрессоустойчивых лиц для успешного выполнения наиболее опасных производственных работ.

Изобретение относится к области медицины, а именно к внутренним болезням. Для определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу в суспензии нейтрофилов периферической крови конкретного индивидуума регистрируют интенсивность исходной хемилюминесценции (ИХ) и хемилюминесценции (НХ) после их нагревания в пробирках на водяной бане в течение 30-60 секунд при температуре 42°C путем подсчета числа импульсов в минуту. При значении ИХ/НХ менее 3 исследуемого относят к стрессочувствительным. Использование способа повышает эффективность лечения различных патологий в клиниках, способствует своевременному проведению профилактических и реабилитационных мероприятий с предотвращением трудопотерь и отбирает стрессоустойчивых лиц для успешного выполнения наиболее опасных производственных работ. 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 ил., 3 пр.

1. Способ определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу, отличающийся тем, что получают суспензию нейтрофилов периферической крови, регистрируют интенсивности исходной хемилюминесценции (ИХ) нейтрофилов и хемилюминесценции (НХ) после их нагревания в пробирках на водяной бане в течение 30-60 с при температуре 42°C, путем подсчета числа импульсов в минуту, и при значении ИХ/НХ менее 3 относят исследуемого к стрессочувствительным.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрируют индуцированную опсонизированным зимозаном люминолзависимую хемилюминесценцию.