ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ЦИННАМИЛТИО-1,2,4-ТРИАЗОЛА В КАЧЕСТВЕ АНТИГЕЛЬМИНТНОГО И ЛАРВИЦИДНОГО СРЕДСТВ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/4196 C07D403/06 A61P33/00 A61P33/10 

Изобретение относится к области органической химии, применительно к биологически активному производному циннамилтио-1,2,4-триазолу, и может найти применение в качестве антигельминтного и ларвицидного средств в медицине.

Известно близкое по строению и биологической активности к предлагаемому соединению, ряд соединений общей формулы IV:

где R1, R2 и R4 независимо выбираемы из группы H, алкил, арил, арилалкил, гетероарил, замещенные гетероарилметил, а R3 - H, алкил, гетероалкил, циклоалкил, арил и гетероарил, которые предлагается применять в качестве инсектицидов или антигельминтных препаратов [3].

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является применение - препарата пирантел, а при исследовании на инвазированных животных аналогом антигельминтных средств выступает альбендазол [4], прототипом ларвицидной активности является имидаклоприд [5]. Недостатком прототипа является недостаточная эффективность применения на моделях антигельминтной и ларвицидной активности, а также более высокая токсичность.

Острая токсичность пирантела составляет при введении per os 620 мг/кг [4]. Имидаклоприд является инсектицидом и относится к 3 классу умеренно опасных веществ при пероральном применении LD₅₀ - 450 мг/кг. Значительной опасностью применение большинства неоникотиноидов, в том числе - имидаклоприда, все виды наружного применения клотианидина из-за опасности для пчел и других опылителей [5].

Технической задачей предлагаемого решения является расширение спектра антигельминтных средств, повышение эффективности применения с целью профилактики инвазионных заболеваний, вызываемых гельминтами, расширение функциональных возможностей антигельминтных средств.

Для решения поставленной задачи предлагается соединение

N⁴-бензил-3-циннамилтио-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазола формулы I:

использовать в качестве антигельминтного и ларвицидного средства.

Соединение I было получено по описанной в литературе методике [1]: к раствору 10,88 г (0,04 ммоль) N⁴-бензил-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазол-3-тиона в 100 мл абс. ТГФ добавляют 4,74 г (0,042 моль) трет-бутилата калия, кипятят в течение 1 ч, добавляют раствор 6,1 г (0,04 моль) циннамилхлорида в 30 мл абс. ТГФ, кипятят в течение 72 ч, растворитель отгоняют на РПИ в вакууме водоструйного насоса. Остаток промывают серным эфиром (2×10 мл), получают 13,99 г (90%) N⁴-бензил-3-циннамилтио-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазола, с т.пл.98-100°С.

Таким образом, соединение I получено взаимодействием 4-бензил-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазол-3-тиона II с циннамилбромидом в тетрагидрофуране, в присутствии трет-бутилата калия при кипячении в течение 7 ч.

Cпектральные характеристики соединения I:

¹ H ЯMР-Спектр (δ,м.д., ³J, Гц): 3.93 д (2H, CH₂CH=CH, ³J=6.6), 5.68 c (2H, CH₂N), 5.85 c (2H, CH₂C₆H₅), 6.2 дт (1H, CH₂CH=CH, ³J=6.6), 6.47 д (1Н, CH₂CH=CH, ³J=16.1), 6.97 м (2Н, СН_Ar), 7.22-7.42 м (8Н, СН_Ar) 7.91 с (1Н, С³Н_Trz), 8.58 с (1Н, С⁵Н_Trz).

Степень чистоты соединения I установлена c помощью ¹H ЯМР спектроскопии и составляет более 95%.

Соединение II, было получены ацилированием (1,2,4-триазол-1-ил)ацетгидразида бензилтиоизоцианатом в абс. этаноле с получением N⁴-бензил-N¹-(1,2,4-триазол-1-илацетил)-тиосемикарбазида III, который затем циклоконденсируют в ключевой N⁴-бензил-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазол-3-тион II, под действием водного раствора гидроксида натрия, с последующим подкислением водным раствором соляной кислотой, по описанной в литературе методике [2].

Острая токсичность синтезированного соединения I cоставляет 1170-1530 мг/кг при пероральном введении у лабораторных животных, что соответствует 4 классу токсичности [6].

Определение ларвицидной активности проводили на личинках хиромонид (Diptera, Chiromonidae) [7], а также дождевых червей - европейский ночной выползок - Dandrobaena veneta (семейство Lumbricidae) [8].

Оценка ларвицидного действия соединения I проводили по следующей методике, изложенной в МУ 3.5.2.1759-03 [9]. Объектом были выбраны личинки хиромонид (Diptera, Chiromonidae) размерами 5±1 см. Одновременно испытывали несколько концентраций, каждая в 3 повторностях. Контролем служили личинки хиромонид, находившиеся в воде без добавления инсектицида. Параллельно ставят контроль с эталонным препаратом - имидаклопридом. В период эксперимента температура воды находилась в пределах 21 - 23°С. Подсчет погибших личинок проводили через 1 час, 2 часа, 3 часа 20 минут (200 минут) и 24 ч. Фиксировали время наступления смерти личинок. Результаты ларвицидного действия оценивали по значению так называемой ларвицидной концентрации ЛК_50. Каждый опыт проводился в 3 повторностях. Контролем являлись личинки, находившиеся в 50 мл воды очищенной без добавления соединения. Прототипом и эталоном сравнения использовали раствор имидаклоприда («Щелково Агрохим», Россия) [9].

ЛК₅₀ соединения I для личинок (Diptera, Chiromonidae) возраста (L₄) составляет 0,10 мг/мл. Для прототипа ларвицидная концентрация составляет 0,5 мг/мл, что в 5 раз более больше и в течение 24 ч при действии имидаклоприда наблюдалось эффективность 75%, в то время как у соединения I эффективность составила 100%.

Таблица 1
Результаты ларвицидной активности соединения I и прототипа Соединения Кол. особей Вид особей Кол. неподвижных, % ЛК₅₀,
мг/мл 1 ч 2 ч 3 ч 20 мин 24 ч Имидаклоприд 20 Chironomidae 5 15 20 75 0,5 I 20 Chironomidae 0 24 40 100 0,1 Контроль 20 Chironomidae 0 0 2 5 0

Антигельминтную активность (АГА) синтезированных соединений определяли на дождевых червях Dandrobaena veneta [9]. В чашку Петри с диаметром 80-100 мм наливали 10 мл водного раствора исследуемого соединения в различной концентрации 0,1, 0,3 и 0,5 мг/мл, помещали в него 6 особей длиной 7±1 см и оставляли под наблюдением при температуре
21-23°С. Фиксировали время наступления смерти червей по отсутствию двигательной активности и реакции на внешнее механическое воздействие. Каждый опыт проводился в 3 повторностях. В качестве контроля использовали червей, находившихся в 10 мл воды очищенной без добавления соединений. Препаратами сравнения являлись измельченные таблетки пирантела 250 мг («Озон», Россия) и измельченные таблетки левамизола 150 мг («Гедеон Рихтер», Венгрия). Каждый из прототипов брали в концентрации 0,1, 0,3 и 0,5 мг/мл. Результаты исследования антигельминтной активности приведены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты исследования антигельминтной активности соединения I
и прототипа пирантела Соединения Кол. особей Вид особей Кол. неподвижных, % IC₅₀ 1 ч 2 ч 3 ч 20 мин 24 ч Левамизол 20 Dandrobaena veneta 5 15 20 75 0,5 Пирантел 20 Dandrobaena veneta 5 15 30 75 0,3 I 20 Dandrobaena veneta 0 24 40 100 0,1 Контроль 20 Dandrobaena veneta e 0 0 2 5 0

В соответствии с методическими рекомендациями для определения антигельминтной активности соединения I проводилось изучение in vivo на спонтанно инвазированных животных [10]. Значительная распространенность среди кишечных гельминтозов наблюдается у токсокароза [11]. Аналогом антигельминтного средства для лечения токсокароза является альбендазол [12]. С целью подтверждения антигельминтного действия соединения I были проведены исследования в примере 1.

Пример 1. С целью обнаружения токсокароза проведены скрининговые тесты иммуно-ферментного анализа. Была сформирована группа собак из 30 собак пород немецкая овчарка (21 собака) и бельгийская овчарка (9 собак) в возрасте от 4 до 6 месяцев, у которых был обнаружен положительный тест. Далее собаки были разделены по группам по методу пар-аналогов: 1 группа - опыт (соединение I), 2 группа - эталон сравнения, аналог (альбендазол), 3 группа - контроль по 10 голов обоих полов в каждой группе. В качестве эталона сравнения применяли аналог антигельминтиков альбендазол в дозе 50 мг/кг, соединение I давали в дозе 10 мг/кг. В течение 5 дней препараты были даны в день 1 (1 прием), 2 день (2 прием), 3 день (3 прием) и 4 день (4 прием) собакам, у которых были установлены разная степень инвазированности Toxocara canis. Результаты антигельминтной активности приведены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты антигельминтной активности в отношении T.canis Соединения Кол. собак Интенсивность инвазии - количество яиц гельминтов в 1 г фекалий до после 1
приема после 2 приема после 3
приема после 4 приема Альбендазол 10 3140 1040 360 0 0 I 10 3380 820 240 0 0 Контроль 10 3200 3160 3340 3380 3400

Определение степени инвазии Т.canis определяли методом Фюллеборна с последующей копроовоскопией фекальных масс [13]. Общую антигельминтную активность рассчитывали исходя из числа яиц, обнаруженных при копрологическом анализе, проведенном после применения препарата на 2-е сутки после приема, на 3 сутки, на 4 сутки, на 5 сутки. Таким образом, в сравнении с прототипом альбендазолом, соединение I показало снижение степени инвазии после 1 приема на 75,74% (у прототипа - на 66,88%), после 2 приема - уменьшение степень инвазии составило 92,89% (у прототипа - 88,54%). На 4 и 5 день яиц токсокар при копроовоскопическом анализе обнаружено не было.

Исследования показали, что представленное соединение I расширяет арсенал и спектр антигельминтных средств, повышает эффективность применения с целью профилактики инвазионных заболеваний, вызываемых гельминтами, расширяет функциональные возможности антигельминтных средств и является более безопасным и менее токсичным в качестве антигельминтных и ларвицидных средств.

Литература

1. Патент РФ 2568212 (Российская Федерация), МПК C07D 403/06, C07D 405/14, A01N 43/653, A01P 3/00, A01P 21/00. N⁴-Замещенные 3-алкилсульфанил-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазолы, способ их получения, фунгицидные и рострегуляторные композиции на их основе / Цаплин Г.В., Попков С.В., Алексеенко А.Л., Никишин Г.И., Терентьев А.О., Кузнецова М.А., Рогожин А.Н., Сметанина Т.И. Заявл. 14.11.2017.

2. Цаплин Г.В.; Попков С.В. Синтез N4-(бензил)- и N4-(циклогексил)-N1-(1,2,4-триазол-1-илацетил)тиосемикарбазидов и продуктов их циклоконденсации в кислой и основной среде.// Успехи в химии и хим. технологии: сб. науч. тр. Том XXX, №11, М: РХТУ им. Д. И. Менделеева . - 2016. - С. 91-93.3.

3. Патент US 0171650 (CША), МПК A61K 31/4439. Novel anthelmintic and insecticidal compositions/ Byung Hyun Lee, Martha Jane Larsen, Teresa Maria Publication Classification Kubiak. Заявл. 11.02.2004.

4. Дэвис А. Лекарственная терапия кишечных гельминтозов. М.: Медицина, 1975, 144 с.

5. Электронный ресурс: https://dezresursy.ru/neonikotinoidy (дата обращения 21.02.2022).

6. ГОСТ Р 12.1.007-76. Межгосударственный стандарт. Вредные вещества.

7. Зинченко Т.Д. Эколого-фаунистическая характеристика хирономид (Diptera, Chironomidae) малых рек бассейна Средней и Нижней Волги: атлас / Т.Д. Зинченко - Тольятти: Кассандра, 2011. - 258 с.

8. Симонов А.П. Методика испытания и отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания почвы. - Бюллетень Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина, 1977, вып. 19. - С. 60-66.

9. МУ 3.5.2.1759-03 Методы определения эффективности инсектицидов, акарицидов, регуляторов развития и репеллентов, используемых в медицинской дезинсекции. - Москва: Ин-т мед. паразитологии и троп. мед. им. Е.И. Марциновского, 2003. - 55 с.

10. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К. 2012. - 944с.

11. Сивкова Т.Н., Хазова М.В. Зараженность почвы кинологических центров МВД России по Пермскому краю яйцами гельминтов и способ ее дезинвазии // Российский паразитологический журнал. 2017. №2 (40). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/zarazhennost-pochvy-kinologicheskih-tsentrov-mvd-rossii-po-permskomu-krayu-yaytsami-gelmintov-i-sposob-ee-dezinvazii (дата обращения: 03.05.2022).

12. Sawant, R. Synthesis and biological evaluation of some novel 2-phenyl benzimidazole-1-acetamide derivatives as potential anthelmintic agents // R. Sawant, D. Kawade // Acta Pharm. - 2011. - Vol. 61, № 3. - P. 353-361.

13. Новикова Т. В., Гламаздин И. Г., Брагина М. А. Диагностика токсокароза собак: сравнительная характеристика эффективности методов //Молочнохозяйственный вестник. - 2016. - №. 2 (22). - С. 45-51.

Изобретение относится к применению производного циннамилтио-1,2,4-триазола в виде N⁴-бензил-3-циннамилтио-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазола формулы I в качестве антигельминтного и ларвицидного средства. Технический результат антигельминтное и ларвицидное действие, обеспеченное применением соединением формулы I. 3 табл., 1 пр.

Применение производного циннамилтио-1,2,4-триазола в виде N⁴-бензил-3-циннамилтио-5-(1,2,4-триазол-1-илметил)-1,2,4-триазола формулы I:

в качестве антигельминтного и ларвицидного средства.