НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОНЪЮГАТ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 A61K31/713 A61K48/00 A61P7/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, способной ингибировать экспрессию гена фактора свертывания крови XI (FXI), и фармацевтической композиции и конъюгату миРНК, содержащим указанную нуклеиновую кислоту. Настоящее изобретение также относится к способу получения и применению таких нуклеиновых кислот, фармацевтических композиций и конъюгатов миРНК.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор свертывания крови XI (далее именуемый «FXI») является важным компонентом внутреннего пути активации свёртывания крови, который способствует выработке тромбина, который, в свою очередь, является важным компонентом, который участвует в образовании фибрина и обеспечивает защиту от фибринолиза. Высокий уровень FXI является одним из факторов риска венозного тромбоза. Ингибирование экспрессии гена FXI позоляет предотвращать и лечить тромботические заболевания (в частности, венозный тромбоз и ишемический инсульт) на клеточном уровне.

Малая интерферирующая РНК (миРНК) может ингибировать или блокировать экспрессию любого целевого гена, представляющего интерес, специфичным для последовательности образом, основанным на механизме РНК-интерференции (РНКи), что позволит достичь цели лечения заболеваний.

Ключом к разработке лекарственных средств на основе миРНК, которые ингибируют экспрессию гена FXI и лечат тромботические заболевания, является поиск подходящей миРНК, ее модификации и эффективной системы доставки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что следующие миРНК и их модифицированные последовательности, предложенные согласно настоящему изобретению, способны специфически ингибировать экспрессию гена FXI, и фармацевтические композиции или конъюгаты миРНК, содержащие такие миРНК, способны специфически нацеливаться на печень, ингибируя таким образом экспрессию гена FXI в печени с обеспечением профилактики или лечения тромботических заболеваний, реализуя таким образом назначение настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена первая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID ΝΟ:1, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Ζ₁ представляет собой U, и Z₂ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃ в положении, соответствующем Z₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₄ в положении, соответствующем Z₂, где нуклеотид Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена вторая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 61, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 62, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₅ представляет собой U, и Z₆ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₇ в положении, соответствующем Z₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₈ в положении, соответствующем Ζ₆, где нуклеотид Ζ₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена третья миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 121, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 122, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₉ представляет собой А, и Ζ₁₀ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Ζ₁₁ в положении, соответствующем Ζ₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Ζ₁₂ в положении, соответствующем Ζ₁₀, где нуклеотид Ζ₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена четвертая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 181, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 182, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₁₃ представляет собой U, и Z₁₄ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₅ в положении, соответствующем Z₁₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Ζ₁₆ в положении, соответствующем Z₁₄, где нуклеотид Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена пятая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 241, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 242, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Ζ₁₇ представляет собой U, и Z₁₈ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₉ в положении, соответствующем Z₁₇, нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₀ в положении, соответствующем Z₁₈, где нуклеотид Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена шестая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 301, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 302, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

в которой Z₂₁ представляет собой G, и Z₂₂ представляет собой С, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₃ в положении, соответствующем Z₂₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₄ в положении, соответствующем Ζ₂₂, где нуклеотид Ζ₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена седьмая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 361, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 362, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₂₅ представляет собой А, и Z₂₆ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₇ в положении, соответствующем Z₂₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₈ в положении, соответствующем Z₂₆, где нуклеотид Z₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена восьмая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 421, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 422, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₂₉ представляет собой U, и Z₃₀ представляет собой А, и нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Ζ₃₁ в положении, соответствующем Ζ₂₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Ζ₃₂ в положении, соответствующем Ζ₃₀, где нуклеотид Ζ₃₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена девятая миРНК, способная ингибировать экспрессию гена FXI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 481, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 482, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₃₃ представляет собой А, и Z₃₄ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃₅ в положении, соответствующем Z₃₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₃₆ в положении, соответствующем Z₃₄, где нуклеотид Z₃₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая миРНК согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен конъюгат миРНК, содержащий миРНК согласно настоящему изобретению и конъюгирующую группу, конъюгированную с миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта, включающий введение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению субъекту, страдающему от тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ ингибирования экспрессии гена FXI в гепатоцитах, включающий приведение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в контакт с гепатоцитами.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий миРНК и/или фармацевтическую композицию, и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ

МиРНК, фармацевтическая композиция и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют высокую стабильность, имеют высокую ингибирующую активность в отношении мРНК гена FXI и низкие нецелевой эффект и/или в значительной степени лечат или облегчают симптомы тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют превосходную ингибирующую активность в отношении целевого гена в экспериментах с клетками в условиях in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии целевого гена в гепатоцитах по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению проявляет ингибирующую активность в отношении мРНК FXI в системе psiCHECK, причем значения IC₅₀ для мРНК FXI находятся в диапазоне от 0,013 нМ до 0,119 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению проявляет высокую ингибирующую активность в клетках HepG2, причем значения IC₅₀ для мРНК FXI находятся в диапазоне от 1,49 нМ до 11,1 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет высокую ингибирующую активность в первичных гепатоцитах мыши, причем значения IC₅₀ для мРНК FXI находятся в диапазоне от 0,012 нМ до 3,86 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению может ингибировать экспрессию мРНК FXI в клетках HepG2 и проявлять процент ингибирования в отношении мРНК FXI до 86,9% при концентрации 50 нМ.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению могут проявлять гораздо более высокую стабильность и/или активность в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии целевого гена в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена FXI в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена FXI в печени в условиях in vivo по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена FXI в печени в условиях in vivo в моделях на животных по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляют процент ингибирования в отношении экспрессии гена FXI в печени в условиях in vivo у человека по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет процент ингибирования в отношении экспрессии мРНК FXI у мышей до 95,0% в условиях in vivo при концентрации миРНК, равной 5 мг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет процент ингибирования в отношении экспрессии мРНК FXI человека у гуманизированных мышей до 93,09% в условиях in vivo при концентрации миРНК, равной 3 мг/кг. Кроме того, конъюгат миРНК может значительно ингибировать концентрацию белка FXI в плазме, проявляя процент ингибирования до около 99%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может значительно повышать активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ, АРТТ) в плазме у мышей CD57 в условиях in vivo, например, на 64,9%.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК, фармацевтическая композиция миРНК или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению не проявляют очевидного нецелевого эффекта. Нецелевой эффект может представлять собой, например, ингибирование нормальной экспрессии гена, который не является целевым геном. Считается, что если связывание/ингибирование экспрессии нецелевых генов составляет менее 50%, 40%, 30%, 20% или 10% по сравнению с эффектом в отношении целевого гена, нецелевой эффект является несущественным.

Следовательно, миРНК, фармацевтическая композиция миРНК и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению могут ингибировать экспрессию гена FXI, эффективно лечить и/или предотвращать тромботические заболевания и/или ишемический инсульт, вызванные избыточной экспрессией гена FXI, и, таким образом, их применение является очень перспективным.

Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут подробно проиллюстрированы в следующей части «подробное описание изобретения».

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конкретные варианты реализации настоящего изобретения подробно описаны ниже. Следует понимать, что конкретные варианты реализации, описанные в настоящем документе, предназначены только для иллюстрации и пояснения настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения в каком-либо отношении.

Применительно к настоящему изобретению мРНК FXI относится к мРНК с нуклеотидной последовательностью, представленную под номером доступа в Genbank NM_000128.3. Кроме того, если не указано иное, термин «целевой ген», используемый в настоящем изобретении, относится к гену, который может транскрибировать вышеуказанную мРНК FXI; и термин «целевая мРНК» относится к вышеуказанной мРНК FXI.

Определения

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, С, G, U, А и Τ обозначают состав оснований нуклеотидов; буква m обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы m, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; f обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы f, представляет собой модифицированный фтором нуклеотид; s обозначает, что два нуклеотида по обеим сторонам от буквы s соединены тиофосфотиоатной связью; Р1 обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р1, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, VP обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне VP, представляет собой нуклеотид, модифицированный винилфосфатом (5''-(Е)-винилфосфат, Ε-VP), Ps обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Ps, представляет собой тиофосфат-модифицированный нуклеотид; и Ρ обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида фтором. Термин «нуклеотид с нефторной модификацией» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида группой, отличной от фторгруппы, или к аналогу нуклеотида. «Аналог нуклеотида» относится к группе, которая может заместить нуклеотид в нуклеиновой кислоте, при этом она структурно отличается от аденинового рибонуклеотида, гуанинового рибонуклеотида, цитозинового рибонуклеотида, урацилового рибонуклеотида или тиминового дезоксирибонуклеотида, такого как изонуклеотид, нуклеотид мостиковой нуклеиновой кислоты (ΒΝΑ) или ациклический нуклеотид. «Метокси-модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

Применительно к настоящему изобретению выражения «комплементарный» и «обратнокомплементарный» могут использоваться взаимозаменяемо и имеют общеизвестное значение в данной области техники, а именно, основания в одной цепи комплементарно спарены с основаниями в другой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В ДНК пуриновое основание аденин (А) всегда спарено с пиримидиновым основанием тимином (Т) (или урацилом (U) в РНК); и пуриновое основание гуанин (G) всегда спарено с пиримидиновым основанием цитозином (С). Каждая пара оснований содержит пурин и пиримидин. Если аденины в одной цепи всегда спарены с тиминами (или урацилами) в другой цепи, а гуанины всегда спарены с цитозинами, эти две цепи считаются комплементарными; и последовательность цепи может быть выведена из последовательности ее комплементарной цепи. Соответственно, «неправильное спаривание» означает, что в двухцепочечной нуклеиновой кислоте основания в соответствующих положениях не представлены в виде комплементарно спаренных.

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, «преимущественно обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями присутствует не более 3 неправильно спаренных оснований. «По существу обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями присутствует не более 1 неправильно спаренного основания. «Полностью обратнокомплементарный» означает, что между двумя нуклеотидными последовательностями отсутствуют неправильно спаренные основания.

Применительно к настоящему изобретению, если нуклеотидная последовательность имеет «различие по нуклеотидам» от другой нуклеотидной последовательности, основания нуклеотидов в одном и том же положении между ними изменены. Например, в случае, если нуклеотидное основание во второй последовательности представляет собой А, а нуклеотидное основание в том же положении в первой последовательности представляет собой U, С, G или Т, эти две нуклеотидные последовательности считаются имеющими различие по нуклеотиду в этом положении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нуклеотид в некотором положении замещен лишенным азотистого основания нуклеотидом или аналогом нуклеотида, также считается, что в этом положении существует различие по нуклеотиду.

Применительно к настоящему изобретению, в частности, в описании способа получения миРНК, композиции миРНК или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению, если не указано иное, термин «нуклеозидный мономер» относится, в соответствии с видом и последовательностью нуклеотидов в миРНК или конъюгате миРНК, которые должны быть получены, к немодифицированным или модифицированным РНК-фосфоамидитами (иногда РНК-фосфоамидиты называют фосфоамидитами нуклеозидов) применяемым в твердофазном фосфоамидитном синтезе. Твердофазный фосфоамидитный синтез представляет собой способ синтеза РНК, хорошо известный специалистам в данной области техники. Все нуклеозидные мономеры, применяемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными.

Применительно к настоящему изобретению, если не указано иное, «конъюгирование» относится к двум или более химическим группам, каждая из которых имеет специфическую функцию, соединенным друг с другом за счет ковалентной связи. Соответственно, «конъюгат» относится к соединению, образованному с помощью ковалентной связи отдельных химических групп. Кроме того, «конъюгат миРНК» представляет собой соединение, образованное с помощью ковалентного присоединения миРНК и одной или более химических групп, каждая из которых имеет специфические функции. В следующем тексте конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению иногда сокращенно обозначают как «конъюгат». Согласно контексту настоящего изобретения, конъюгат миРНК следует понимать как общий термин для конъюгатов миРНК, общий термин для конъюгатов миРНК, представленных Формулами (305) и (307), или конъюгатов миРНК, представленных Формулами (305), (307) или (308). Применительно к настоящему изобретению термин «конъюгирующая молекула» следует понимать как конкретное соединение, которое может быть конъюгировано с миРНК за счет реакций с получением в конечном итоге конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению.

В настоящем документе термин «необязательный» или «необязательно» означает, что описанное впоследствии событие или условие может происходить или может не происходить, и что описание включает случаи, когда событие или условие происходит или не происходит. Например, «необязательно замещенный алкил» включает оба «алкил» и «замещенный алкил», как определено ниже. Специалисты в данной области техники поймут, в отношении любой группы, содержащей один или более заместителей, что такие группы не предназначены для введения какого-либо замещения или профилей замещения, которые являются стерически непрактичными, синтетически неосуществимыми и/или нестабильными по своей природе.

В настоящем документе термин «алкил» относится к линейной цепи и разветвленной цепи, содержащей указанное количество атомов углерода, обычно от 1 до 20 атомов углерода, например, от 1 до 10 атомов углерода, например, от 1 до 8 или от 1 до 6 атомов углерода. Например, C₁-С₆ алкил включает оба линейный и разветвленный алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. При обозначении алкильного остатка, содержащего определенное количество атомов углерода, подразумевается включение всех форм с разветвленной цепью и линейной цепью, содержащих такое количество атомов углерода; таким образом, например, «бутил» означает н-бутил, втор-бутил, изобутил и трет-бутил; «пропил» включает н-пропил и изопропил. Алкилен представляет собой подгруппу алкила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкенил» относится к ненасыщенной разветвленной или линейной алкильной группе, имеющей по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, которая получается путем соответствующего удаления одной молекулы водорода от двух соседних атомов углерода исходного алкила. Группа может быть в цис-или транс-конфигурации двойной связи (связей). Типичные алкенильные группы включают, но не ограничиваются ими, этенил; пропенил, такой как проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил (аллил), проп-2-ен-2-ил; бутенил, такой как бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил; и тому подобное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения алкенильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, а в других вариантах реализации от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкенилен представляет собой подгруппу алкенила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкенил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкинил» относится к ненасыщенной разветвленной или линейной алкильной группе, имеющей по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, полученную путем удаления двух молекул водорода от двух смежных атомов углерода исходного алкила. Типичные алкинильные группы включают, но не ограничиваются ими, этинил; пропинил, такой как проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил; бутинил, такой как бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил; и тому подобное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения алкинильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, а в других вариантах реализации от 2 до 10, от 2 до 8 или от 2 до 6 атомов углерода. Алкинилен представляет собой подгруппу алкинила, относящуюся к тем же остаткам, как и алкинил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин «алкокси» относится к алкильной группе с указанным количеством атомов углерода, связанной за счет кислородного мостика, например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентилокси, 2-пентилокси, изопентилокси, неопентилокси, гексилокси, 2-гексилокси, 3-гексилокси, 3-метилпентилокси и тому подобное. Алкоксигруппа обычно содержит от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода, присоединенных за счет кислородного мостика.

В настоящем документе термин «арил» относится к радикалу, происходящему из ароматической моноциклической или полициклической углеводородной кольцевой системы путем удаления атома водорода от кольцевого атома углерода. Ароматическая моноциклическая или полициклическая углеводородная кольцевая система содержит только водород и углерод, включая от 6 до 18 атомов углерода, причем по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе является полностью ненасыщенным, т. е. оно содержит циклическую делокализованную (4n+2)π-электронную систему в соответствии с теорией Хюккеля. Арильные группы включают, но не ограничиваются ими, группы, такие как фенил, флуоренил и нафтил. Арилен представляет собой подгруппу арила, относящуюся к тем же остаткам, как и арил, но имеющую два положения присоединения.

В настоящем документе термин « гало-заместитель» или «галоген» относится к фторо, хлоро, бромо и йодо, а термин «галоген» включает фтор, хлор, бром и йод.

в настоящем документе термин «галогеналкил» относится к алкилу, определенному выше, с указанным количеством атомов углерода, замещенному одним или более атомами галогена, до максимально допустимого числа атомов галогена. Примеры галогеналкила включают, но не ограничиваются ими, трифторметил, дифторметил, 2-фторэтил и пентафторэтил.

«Гетероциклил» относится к стабильному 3-18-членному неароматическому кольцевому радикалу, который содержит от 2 до 12 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода или серы. Если в описании не указано иное, гетероциклил представляет собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может содержать конденсированную или мостиковую кольцевую систему(ы). Гетероатом(ы) в гетероциклильном заместителе необязательно может (могут) быть окислен(ы). Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно являются кватернизованными. Гетероциклильный заместитель является частично или полностью насыщенным. Гетероциклил может быть соединен с остальной частью молекулы за счет любого атома кольца(колец). Примеры таких гетероциклильных заместителей включают, но не ограничиваются ими, диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил,

октагидроизоиндолил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксапиримидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, тритианил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-оксатиоморфолинил и 1,1-диоксатиоморфолил.

«Гетероарил» относится к заместителю, происходящему из 3-18-членного ароматического кольцевого заместителя, который содержит от 2 до 17 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода или серы. В настоящем документе гетероарильный заместитель может представлять собой мо но циклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, причем по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе является полностью ненасыщенным, т. е. содержит циклическую делокализованную (4n+2)ππ-электронную систему в соответствии с теорией Хюккеля. Гетероарил включает конденсированную или мостиковую кольцевую систему(ы). Гетероатом(ы) в гетероарильном заместителе необязательно окислен(ы). Один или более атомов азота, если они присутствуют, необязательно являются кватернизованными. Гетероарил соединен с остальной частью молекулы за счет любого атома кольца(колец). Примеры таких гетероарилов включают, но не ограничиваются ими, азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензиндолил, 1,3-бензодиоксазолил, бензофуранил, бензоксазолил, бензо[d]тиазолил, бензотиадиазолил, бензо[d][1,4]диоксепинил, бензо[d][1,4]оксазинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензооксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил, бензотиено[3,2-d]пиримидинил, бензотриазолил, бензо[4,6]имидазо[1,2-а]пиридинил, карбазолил, циннолинил, циклопента[d]пиримидинил, 6,7-дигидро-5Н-циклопента[4,5]-тиено[2,3-d]-пиримидинил, 5,6-дигидробензо[h]хиназолинил, 5,6-дигидробензо[h]циннолинил, 6,7-дигидро-5Н-бензо[6,7]циклогепта[1,2-с]пиридазинил, дибензофуранил, дибензотиенил, фуранил, фуранонил, фуро[3,2-с]пиридинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиримидинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклогепта[d]пиридазинил, 5,6,7,8,9,10-гексагидроциклоокта[d]пиридинил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, 5,8-метано-5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, нафтиридинонил, 1,6-нафтиридинонил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 5,6,6а,7,8,9,10,10а-октагидробензо[h]хиназолинил, 1-фенил-1H-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиразоло[3,4-d]пиримидинил, пиридинил, пиридо[3,2-d]пиримидинил, пиридо[3,4-d]пиримидинил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, хиназолинил, хиноксалинил, хинолинил, тетрагидрохинолинил, 5,6,7,8-тетрагидрохиназолинил, 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 6,7,8,9-тетрагидро-5Н-циклогепта[4,5]тиено[2,3-d]пиримидинил, 5,6,7,8-тетрагидропиридо[4,5-с]пиридазинил, тиазолил, тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил, тиено[2,3-d]пиримидинил, тиено[3,2-d]пиримидинил, тиено[2,3-с]придинил и тиофенил/тиенил.

В настоящем изобретении можно применять различные защищающие гидроксил группы. Как правило, защитные группы делают химические функциональные группы инертными к конкретным условиям реакции и могут быть присоединены к таким функциональным группам в молекуле и удалены от них без существенного повреждения остальной части молекулы. Типичные защищающие гидроксил группы раскрыты в Beaucage, et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, а также в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2 изд., John Wiley & Sons, New York, 1991, каждый из которых тем самым полностью включен посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения защитная группа стабильна в основных условиях, но может быть удалена в кислых условиях. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неисключающие примеры защищающих гидроксил групп, которые могут быть использованы в настоящем документе, включают диметокситритил (DMT), монометокситритил, 9-фенилксантен-9-ил (Pixy1) и 9-(п-метоксифенил)ксантен-9-ил (Мох). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неисключающие примеры защищающих гидроксил групп, применяемых в настоящем документе, включают Тг (тритил), MMTr (4-метокситритил), DMTr (4,4'-диметокситритил) и TMTr (4,4',4''-триметокситритил).

В настоящем документе термин «субъект» относится к любому животному, например, млекопитающему или сумчатому. Субъект согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается ими, человека, примата, не относящегося к человеку (например, макаку резуса или другие виды макак), мышь, свинью, лошадь, осла, корову, овцу, крысу и любой вид домашней птицы.

В настоящем документе термин «лечение» относится к способу получения предпочтительного или целевого результата, включая, но не ограничиваясь этим, терапевтическую пользу. «Терапевтическая польза» означает устранение или улучшение потенциального нарушения, подлежащего лечению. Также терапевтическая польза достигается путем устранения или уменьшения одного или более физиологических симптомов, связанных с потенциальным расстройством, так, что у субъекта наблюдается улучшение, несмотря на то, что субъект все еще может быть поражен потенциальным нарушением.

В настоящем документе термин «профилактика» относится к способу получения предпочтительного или целевого результата, включая, но не ограничиваясь этим, профилактическую пользу. Для достижения «профилактической пользы» миРНК, конъюгаты миРНК или фармацевтические композиции миРНК можно вводить субъекту, подверженному риску развития конкретного заболевания, или субъекту, сообщающему об одном или более физиологических симптомах заболевания, даже если диагноз этого заболевания не был установлен.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены с первой по девятую миРНК, способные ингибировать экспрессию гена FXI. Они будут последовательно подробно описаны ниже.

МиРНК согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидные группы в качестве основных структурных блоков. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что нуклеотидная группа содержит фосфатную группу рибозную группу и основание. Подробные иллюстрации этих групп в настоящем документе не представлены.

Первая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой первую миРНК.

Первая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид в первой миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID ΝΟ: 1, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Ζ₁ представляет собой U, и Ζ₂ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃ в положении, соответствующем Ζ₁; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₄ в положении, соответствующем Z₂ где нуклеотид Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Применительно к настоящему изобретению термин «соответствующее положение» означает нахождение в одном и том же положении в нуклеотидной последовательности при отсчете с одного и того же конца нуклеотидной последовательности. Например, первый нуклеотид на 3'-конце нуклеотидной последовательности I представляет собой нуклеотид в положении, соответствующем первому нуклеотиду на 3'-конце SEQ ID ΝΟ: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID ΝΟ:1, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2 включает различие в положении Z₄, причем Z₄ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₄, причем Z₄ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₄. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II; «преимущественно обратнокомплементарный» относится к не более чем 3 неправильно спаренным основаниям в двух нуклеотидных последовательностях; «по существу обратнокомплементарный» относится к не более чем 1 неправильно спаренному основанию в двух нуклеотидных последовательностях; «полностью обратнокомплементарный» относится к отсутствию неправильно спаренных оснований в двух нуклеотидных последовательностях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4:

в которых Z₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₃ выбран из A, U, G или С, и Z₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃; в некоторых вариантах реализации Z₃ представляет собой U, и Z₄ представляет собой А.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину Таким образом, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 или 23/26. В некоторых вариантах реализации изобретения отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/21, 21/23 или 23/25.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID ΝΟ: 1 в целевой мРНК, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой А; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UCU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AGA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UUCU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AGAA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Вторая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой вторую миРНК.

Вторая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид во второй миРНК независимо представляет собой модифицированный или ^модифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 61, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 62, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₅ представляет собой U, и Z₆ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₇ в положении, соответствующем Z₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₈ в положении, соответствующем Ζ₆, где нуклеотид Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 62.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62, включает различие в положении Z₈, причем Z₈ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₈, причем Z₈ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₇ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₈. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64:

в которых Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₇ выбран из A, U, G или С, и Z₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₇; в некоторых вариантах реализации Z₇ представляет собой U, и Z₈ представляет собой А.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I, и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 61, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой С; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AAG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CUU; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GAAG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CUUC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Третья миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой третью миРНК.

Третья миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь; каждый нуклеотид в третьей миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид; причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; причем нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 121, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 122, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Ζ₉ представляет собой А, и Ζ₁₀ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Ζ₁₁ в положении, соответствующем Ζ₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Ζ₁₂ в положении, соответствующем Ζ₁₀, где нуклеотид Ζ₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 121, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 122.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 122, включает различие в положении Ζ₁₂, причем Ζ₁₂ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Ζ₁₂, причем Ζ₁₂ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ζ₁₁ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₁₂. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 123, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 124:

в которых Ζ₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₁ выбран из A, U, G или С, и Z₁₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₁; в некоторых вариантах реализации Z₁₁ представляет собой А, и Z₁₂ представляет собой U.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I, и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая примыкает к 5'-концу нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 121, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой А; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GU, и состав сонований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AGU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой ACU; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GAGU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой ACUC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АС; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Четвертая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой четвертую миРНК.

Четвертая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 181, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 182, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₁₃ представляет собой U, и Z₁₄ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₅ в положении, соответствующем Z₁₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₁₆ в положении, соответствующем Z₁₄, где нуклеотид Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 181, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 182.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между нуклеотидной последовательностью II и нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 182, включает различие в положении Z₁₆, причем Ζ₁₆ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₁₆, причем Z₁₆ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ζ₁₅ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₁₆. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 183, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184:

в которых Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₅ выбран из A, U, G или С, и Z₁₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₅; в некоторых вариантах реализации Z₁₅ представляет собой U, и Z₁₆ представляет собой А.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, причем указанная антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и указанная нуклеотидная последовательность III и указанная нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; указанная нуклеотидная последовательность III и указанная нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и являются по существу обратнокомплементарными или полностью обратнокомплементарными; указанная нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I, а указанная нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II; указанная нуклеотидная последовательность IV является по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая примыкает к 5'-концу нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 181, и имеет такую же длину, что и указанная нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотида, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой А; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CUU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AAG; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GCUU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AAGC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой АА; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Пятая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой пятую миРНК.

Пятая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 241, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 242, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Ζ₁₇ представляет собой U, и Z₁₈ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₁₉ в положении, соответствующем Z₁₇; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₀ в положении, соответствующем Z₁₈, где нуклеотид Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 241, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 242.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью согласно SEQ ID NO: 242 включает различие в положении Z₂₀, причем Z₂₀ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Ζ₂₀, причем Ζ₂₀ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ζ₁₉ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₂₀. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 243, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 244:

в которых Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₁₉ выбран из A, U, G или С, и Z₂₀ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₉; в некоторых вариантах реализации Z₁₉ представляет собой U, и Z₂₀ представляет собой А.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I, и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID ΝΟ:241, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотида, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой А, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой U; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой АА, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AAA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UUU; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой СААА, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UUUG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой АА, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Шестая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой шестую миРНК.

Шестая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или ^модифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 301, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 302, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

в которой Z₂₁ представляет собой G, и Z₂₂ представляет собой С, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₃ в положении, соответствующем Z₂₁ нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₂₄ в положении, соответствующем Z₂₂, где Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, а антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 301, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 302.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью согласно SEQ ID NO: 302 включает различие в положении Z₂₄, причем Z₂₄ выбран из U, G или А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₂₄, причем Z₂₄ выбран из U, G или А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₂₃ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₄. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 303, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 304:

в которых Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₂₃ выбран из A, U, G или С, и Z₂₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₃; в некоторых вариантах реализации изобретения Z₂₃ представляет собой G, и Z₂₄ представляет собой С.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I, и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II; нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, что относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID NO: 301, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотида, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой А, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой U; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CGA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UCG; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UCGA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UCGA; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Седьмая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой седьмую миРНК.

Седьмая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 361, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 362, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₂₅ представляет собой А, и Z₂₆ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₂₇ в положении, соответствующем Ζ₂₅; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Ζ₂₈ в положении, соответствующем Ζ₂₆, где нуклеотид Ζ₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 361, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 362.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 362, включает различие в положении Z₂₈, причем Z₂₈ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₂₈, причем Z₂₈ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₂₇ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₈. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 363, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 364:

в которых Z₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₂₇ выбран из A, U, G или С, и Z₂₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₇; в некоторых вариантах реализации Z₂₇ представляет собой А, и Z₂₈ представляет собой U.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID ΝΟ: 361, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой G, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой С; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GCG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CGC; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AGCG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CGCU; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CG, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой CG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Восьмая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой восьмую миРНК.

Восьмая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 421, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 422, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₂₉ представляет собой U, и Z₃₀ представляет собой А, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃₁1 в положении, соответствующем Z₂₉; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₃₂ в положении, соответствующем Z₃₀, где нуклеотид Z₃₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 421, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 422.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью согласно SEQ ID NO: 422 включает различие в положении Z₃₂, причем Z₃₂ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₃₂, причем Z₃₂ выбран из U, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₃₁ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃₂. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 423, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 424:

в которых Z₃₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₃₁ выбран из A, U, G или С, и Z₃₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃₁; в некоторых вариантах реализации Z₃₁ представляет собой U, и Z₃₂ представляет собой А.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и по существу обратнокомплементарны или полностью обратнокомплементарны; нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности I; и нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом нуклеотидной последовательности II. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность IV по существу обратнокомплементарна или полностью обратнокомплементарна второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID ΝΟ: 421, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой А, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой U; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой AGA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UCU; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UAGA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UCUA; в этом случае соотношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GA, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой UC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Девятая миРНК

Согласно настоящему изобретению миРНК может представлять собой девятую миРНК.

Девятая миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II по меньшей мере частично обратнокомплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область; при этом нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 481, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами, и нуклеотидная последовательность II имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 482, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами:

где Z₃₃ представляет собой А, и Z₃₄ представляет собой U, и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотид Z₃₅ в положении, соответствующем Z₃₃; нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотид Z₃₆ в положении, соответствующем Z₃₄, где нуклеотид Z₃₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность I, и антисмысловая цепь содержит только нуклеотидную последовательность II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 481, и/или нуклеотидная последовательность II содержит не более 1 нуклеотида, отличного от нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 482.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам между указанной нуклеотидной последовательностью II и указанной нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 482, включает различие в положении Z₃₆, причем Z₃₆ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различие по нуклеотидам представляет собой различие в положении Z₃₆, причем Z₃₆ выбран из А, С или G. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Z₃₅ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃₆. МиРНК, содержащие указанные выше различия по нуклеотидам также имеют высокую ингибирующую способность в отношении целевой мРНК, и такие миРНК, содержащие различия по нуклеотидам, также включены в объем настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I является преимущественно обратнокомплементарной, по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность I представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 483, и нуклеотидная последовательность II представляет собой нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 484:

в которых Z₃₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи, Z₃₅ выбран из A, U, G или С, и Z₃₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃₅; в некоторых вариантах реализации Z₃₅ представляет собой А, и Z₃₆ представляет собой U.

Кроме того, смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, причем смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину, а антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, при этом указанная антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV, и указанная нуклеотидная последовательность III и указанная нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов; указанная нуклеотидная последовательность III и указанная нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и являются по существу обратнокомплементарными или полностью обратнокомплементарными; указанная нуклеотидная последовательность III соединена с 5'-концом указанной нуклеотидной последовательности I, и указанная нуклеотидная последовательность IV соединена с 3' -концом указанной нуклеотидной последовательности II. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность IV является по существу обратнокомплементарной или полностью обратнокомплементарной второй нуклеотидной последовательности, которая относится к нуклеотидной последовательности, которая соединена с 5'-концом нуклеотидной последовательности целевой мРНК, представленной в SEQ ID ΝΟ: 481, и имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид, и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой U, и основание нуклеотидной последовательности IV представляет собой А; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 20/20; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой ACU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AGU; в этом случае, отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 22/22; или, нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GACU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AGUC; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 23/23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют длину 2 нуклеотида, и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CU, и состав оснований нуклеотидной последовательности IV представляет собой AG; в этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи составляет 21/21.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность III полностью обратнокомплементарна нуклеотидной последовательности IV. Таким образом, если предложено основание нуклеотидной последовательности III, основание нуклеотидной последовательности IV также определено.

Следующее описание, касающееся нуклеотидной последовательности V, последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидной модификации и модифицированной последовательности миРНК применимо к любой из вышеупомянутых миРНК от первой до девятой. А именно, если не указано иное, следующее описание миРНК следует рассматривать как описание первой, второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой и девятой миРНК поочередно. Например, если не указана конкретная миРНК, выражение "миРНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V" означает, что "первая миРНК, вторая миРНК, третья миРНК, четвертая миРНК, пятая миРНК, шестая миРНК, седьмая миРНК, восьмая миРНК и девятая миРНК дополнительно содержат нуклеотидную последовательность V".

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V. Нуклеотидная последовательность V имеет длину от 1 до 3 нуклеотидов и соединена с 3'-концом антисмысловой цепи с образованием 3'-липкого конца антисмысловой цепи. В этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи в миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25 или 23/26. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность V содержит 2 нуклеотида в длину. В этом случае отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению может составлять 19/21, 21/23 или 23/25.

Каждый нуклеотид в нуклеотидной последовательности V может представлять собой любой нуклеотид. Для облегчения и удешевления синтеза нуклеотидная последовательность V представляет собой 2 последовательных тиминовых дезоксирибонуклеотида (dTdT) или 2 последовательных урацильных рибонуклеотида (UU); или, для повышения аффинности между антисмысловой цепью миРНК и целевой мРНК, нуклеотидная последовательность V комплементарна нуклеотидам в соответствующих положениях целевой мРНК. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение длины смысловой цепи к длине антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению составляет 19/21 или 21/23. В этом случае миРНК согласно настоящему изобретению проявляет лучшую подавляющую активность в отношении целевой мРНК.

Нуклеотиды в соответствующих положениях целевой мРНК относятся к нуклеотидам или нуклеотидной последовательности, которые соединены с 5'-концом сегмента нуклеотидной последовательности целевой мРНК. Этот сегмент нуклеотидной последовательности целевой мРНК относится к сегменту нуклеотидной последовательности, который является по существу обратно комплементарным или полностью обратнокомплементарным нуклеотидной последовательности II, или по существу обратнокомплементарным или полностью обратнокомплементарным нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидной последовательности II и нуклеотидной последовательности IV.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к первой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8:

в которых Ζ₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₃ выбран из A, U, G или С, и Ζ₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃.

Согласно некоторым вариантам реализации применительно ко второй миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68:

в которых Z₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₇ выбран из A, U, G или С, и Z₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₇.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к третьей миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 125, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 126:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 127, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 128:

в которых Z₁₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Ζ₁₁ выбран из A, U, G или С, и Ζ₁₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₁₁.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к четвертой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 185, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 186:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 187, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188:

в которых Z₁₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₁₅ выбран из A, U, G или С, и Z₁₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₅.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к пятой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 245, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 246:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 247, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 248:

в которых Z₂₀ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₁₉ выбран из A, U, G или С, и Z₂₀ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₁₉.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к шестой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 305, ив антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 306:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 307, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 308:

в которых Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₂₃ выбран из A, U, G или С, и Z₂₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₃.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к седьмой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 365, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 366:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 367, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 368:

в которых Z₂₈ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₂₇ выбран из A, U, G или С, и Z₂₈ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₇.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к восьмой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 425, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 426:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 427, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 428:

в которых Ζ₃₂ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Ζ₃₁ выбран из A, U, G или С, и Ζ₃₂ представляет собой нуклеотид, комплементарный Ζ₃₁.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применительно к девятой миРНК смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 485, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 486:

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 487, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 488:

в которых Z₃₆ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца указанной антисмысловой цепи; Z₃₅ выбран из A, U, G или С, и Z₃₆ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₃₅.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой siFXIa1, siFXIa2, siFXIb1, siFXIb2, siFXIc1, siFXIc2, siFXId1, siFXId2, siFXIe1, siFXIe2, siFXIf1, siFXIf2, siFXIg1, siFXIg2, siFXIh1, siFXIh2, siFXIi1 или siFXIi2, перечисленные в Таблицах 1a-1i.

Как упоминалось выше, в миРНК согласно настоящему изобретению каждый нуклеотид независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотид в миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой немодифицированный нуклеотид; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в миРНК согласно настоящему изобретению некоторые или все нуклеотиды представляют собой модифицированные неклеотиды. Такие модификации на нуклеотидных группах не будут вызывать значительного уменьшения или потери функций конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению для ингибирования экспрессии гена FXI.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеотид.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотиду образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы другими группами, или аналогу нуклеотида, или нуклеотиду с модифицированным основанием. Модифицированный нуклеотид не будет вызывать значительного уменьшения или потери функций миРНК в отношении ингибирования экспрессии генов. Например, могут быть выбраны модифицированные нуклеотиды, раскрытые в J.K. Watts, G. F. Deleavey and M.J. Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p. 842-55.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один нуклеотид в смысловой или антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой модифицированный нуклеотид и/или по меньшей мере одна фосфатная группа представляет собой фосфатную группу с модифицированной группой(группами). Другими словами, по меньшей мере часть фосфатных и/или рибозных групп в фосфатно-рибозном остове по меньшей мере одной одиночной цепи в смысловой цепи и антисмысловой цепи представляют собой фосфатные и/или рибозные группы с модифицированными группами.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения все нуклеотиды в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи представляют собой модифицированные нуклеотиды. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид или нуклеотид с нефторной модификацией.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что миРНК согласно настоящему изобретению достигают высокого баланса между стабильностью в плазме и эффективностью подавления генов в экспериментах на животных.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные модифицированные фтором нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II. Кроме того, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, по меньшей мере нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; и, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, по меньшей мере нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные фтором нуклеотиды расположены внутри нуклеотидных последовательностей I и II; и в нуклеотидной последовательности I присутствует не более 5 модифицированных фтором нуклеотидов. Кроме того, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, по меньшей мере, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 указанной нуклеотидной последовательности I представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; в нуклеотидной последовательности II присутствует не более 7 модифицированных фтором нуклеотидов; и по меньшей мере, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 указанной нуклеотидной последовательности II представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией; в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией.

Применительно к настоящему изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида атомом фтора, который имеет структуру, представленную следующей Формулой (7). «Нуклеотид с нефторной модификацией» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы нуклеотида группой, отличной от фтора, или к аналогу нуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид с нефторной модификацией независимо выбран из нуклеотида, образованного путем замещения 2'-гидроксила его рибозной группы группой, отличной от фтора, или аналога нуклеотида.

Нуклеотиды, образованные путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы группой, отличной от фтора, хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть выбраны из группы, состоящей из 2'-алкоксимодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных алкоксимодифицированных нуклеотидов, 2'-алкилмодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных алкилмодифицированных нуклеотидов, 2'-аминомодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных аминомодифицированных нуклеотидов и 2'-дезоксинуклеотидов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-алкоксимодифицированный нуклеотид представляет собой 2'-метокси (2'-ОМе) -модифицированный нуклеотид, представленный Формулой (8). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-замещенный алкоксимодифицированный нуклеотид представляет собой, например, 2'-метоксиэтил (2'-МОЕ) - модифицированный нуклеотид, представленный Формулой (9). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-амино-(2'-ΝΗ2) - модифицированный нуклеотид представляет собой тот, который представлен Формулой (10). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 2'-дезоксинуклеотид (ДНК) представляет собой тот, который представлен Формулой (11).

Аналог нуклеотида относится к группе, которая может замещать нуклеотид в нуклеиновой кислоте, при этом она структурно отличается от аденинового рибонуклеотида, гуанинового рибонуклеотида, цитозинового рибонуклеотида, урацилового рибонуклеотида или тиминового дезоксирибонуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог нуклеотида может представлять собой изонуклеотид, нуклеотид мостиковой нуклеиновой кислоты или ациклический нуклеотид.

Мостиковая нуклеиновая кислота (ΒΝΑ) относится к ограниченному или недоступному нуклеотиду. ΒΝ А может содержать 5-, 6-членную или 7-членную кольцевую мостиковую структуру со сморщиванием «фиксированного» С3'-эндо-сахара. Мостик, как правило, встроен в 2'- и 4'-положения рибозы, чтобы получить 2',4'-ΒΝΑ нуклеотид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ΒΝΑ может представлять собой LNA, ΕΝΑ, сЕТ ΒΝΑ и т.п., которые представлены Формулами (12), (13) и (14), соответственно:

Ациклический нуклеотид относится к классу нуклеотидов, в которых кольцо сахара незамкнуто. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения акриловый нуклеотид может представлять собой незапертую нуклеиновую кислоту (UNA) или нуклеиновую кислоту на основе глицерина (GNA), которые представлены Формулами (15) и (16), соответственно:

В приведенных выше формулах (15) и (16) R выбран из Н, ОН или алкокси (О-алкила).

Изонуклеотид представляет собой соединение, образованное путем изменения положения основания на рибозном кольце в нуклеотиде. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения изонуклеотид может представлять собой соединение, в котором основание перемещено из положения -1' в положение -2' или -3' на рибозном кольце, представленное Формулами (17) или (18), соответственно

В вышеуказанных соединениях формул (17)-(18) «основание» представляет собой основание нуклеиновой кислоты, такой как A, U, G, С или Т; R выбран из Н, ОН, F или вышеуказанной группы, отличной от фтора.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог нуклеотида представляет собой аналог, выбранный из группы, состоящей из изонуклеотида, LNA, ΕΝΑ, сЕТ, UNA и GNA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый нуклеотид с нефторной модификацией представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид. Применительно к настоящему изобретению метокси-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

Применительно к изобретению термин «модифицированный фтором нуклеотид», «2'-фтор-модифицированный нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидроксил рибозной группы замещен атомом фтора», и «2'-фторрибозил» имеют одинаковое значение, относясь к соединению, в котором 2'-гидроксил нуклеотида замещен атомом фтора, имеющему структуру, представленную Формулой (7). «Метокси-модифицированный нуклеотид», «2'-метокси-модифицированный нуклеотид», «нуклеотид, в котором 2'-гидроксил рибозной группы замещен метокси» и «нуклеотид с 2'-метоксирибозилом» имеют одинаковое значение, относясь к соединению, в котором 2'-гидроксил рибозной группы в нуклеотиде замещен метокси, имеющему структуру, представленную Формулой (8).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой миРНК со следующими модификациями: в направлении от 5' -конца к 3' -концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой миРНК со следующими модификациями: в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды;

или, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды;

или, в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности I в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности II в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды, а нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды.

В некоторых вариантах реализации изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую из siFXIa1-M1, siFXIa1-M2, siFXIa1-M3, siFXIa2-M1, siFXIa2-M2, siFXIa2-M3, siFXIb1-M1, siFXIb1-M2, siFXIb1-M3, siFXIb2-M1, siFXIb2-M2, siFXIb2-M3, siFXIc1-M1, siFXIc1-M2, siFXIc1-M3, siFXIc2-M1, siFXIc2-M2, siFXIc2-M3, siFXId1-M1, siFXId1-M2, siFXId1-M3, siFXId2-M1, siFXId2-M2, siFXId2-M3, siFXIe1-M1, siFXIe1-M2, siFXIe1-M3, siFXIe2-M1, siFXIe2-M2, siFXIe2-M3, siFXIf1-M1, siFXIf1-M2, siFXIf1-M3, siFXIf2-M1, siFXIf2-M2, siFXIf2-M3, siFXIg1-M1, siFXIg1-M2, siFXIg1-M3, siFXIg2-M1, siFXIg2-M2, siFXIg2-M3, siFXIh1-M1, siFXIh1-M2, siFXIh1-M3, siFXIh2-M1, siFXIh2-M2, siFXIh2-M3, siFXIi1-M1, siFXIi1-M2, siFXIi1-M3, siFXIi2-M1, siFXIi2-M2 и siFXIi2-M3 перечисленных в Таблицах 1a-1i.

МиРНК с указанными модификациями могут быть обеспечены не только с более низкими затратами, но также снижают склонность рибонуклеаз расщеплять нуклеиновую кислоту в крови так, чтобы повысить стабильность нуклеиновой кислоты и обеспечить более высокую устойчивость нуклеиновой кислоты к гидролизу нуклеазами. Более того, миРНК с вышеуказанными модификациями проявляют более высокую ингибирующую активность в отношении целевой мРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере часть фосфатных групп в фосфатно-рибозном остове по меньшей мере одной одиночной цепи в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению представляют собой фосфатные группы с модифицированными группами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфатная группа с модифицированной (ыми) группой(ами) представляет собой фосфотиоатную группу, образованную путем замещения по меньшей мере одного атома кислорода в сложной фосфодиэфирной связи в фосфатной группе атомом серы. Согласно некоторым вариантам реализации указанная фосфатная группа с модифицированной(ыми) группой(ами) представляет собой фосфотиоатную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (1):

Эта модификация может стабилизировать двухцепочечную структуру миРНК, что поддерживает высокую специфичность и высокую аффинность спаривания оснований.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в миРНК согласно настоящему изобретению фосфотиоатная связь присутствует в по меньшей мере одном положении, выбранном из группы, состоящей из следующих положений: положение между первым и вторым нуклеотидами на любом конце смысловой или антисмысловой цепи, положение между вторым и третьим нуклеотидами на любом конце смысловой или антисмысловой цепи или в любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует во всех вышеуказанных положениях, за исключением 5'-конца смысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует во всех вышеуказанных положениях, за исключением 3'-конца смысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фосфотиоатная связь присутствует по меньшей мере в одном из следующих положений: положение между первым и вторым нуклеотидами на 5''-конце смысловой цепи; положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5''-конце смысловой цепи; положение между первым и вторым нуклеотидами на 3''-конце смысловой цепи; положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3''-конце смысловой цепи; положение между первым и вторым нуклеотидами на 5''-конце антисмысловой цепи; положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5''-конце антисмысловой цепи; положение между первым и вторым нуклеотидами на 3''-конце антисмысловой цепи; и положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3''-конце антисмысловой цепи.

В некоторых вариантах реализации изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую из siFXIa1-MIS, siFXIa1-M2S, siFXIa1-M3S, siFXIa2-M1S, siFXIa2-M2S, siFXIa2-M3S, siFXIb1-MIS, siFXIb1-M2S, siFXIb1-M3S, siFXIb2-M1S, siFXIb2-M2S, siFXIb2-M3S, siFXIc1-MIS, siFXIc1-M2S, siFXIc1-M3S, siFXIc2-M1S, siFXIc2-M2S, siFXIc2-M3S, siFXId1-MIS, siFXId1-M2S, siFXId1-M3S, siFXId2-M1S, siFXId2-M2S, siFXId2-M3S, siFXIe1-MIS, siFXIe1-M2S, siFXIe1-M3S, siFXIe2-M1S, siFXIe2-M2S, siFXIe2-M3S, siFXIf1-MIS, siFXIf1-M2S, siFXIf1-M3S, siFXIf2-M1S, siFXTf2-M2S, siFXIf2-M3S, siFXIg1-MIS, siFXIg1-M2S, siFXIg1-M3S, siFXIg2-M1S, siFXIg2-M2S, siFXIg2-M3S, siFXIh1-M1S, siFXIh1-M2S, siFXIh1-M3S, siFXIh2-M1S, siFXIh2-M2S, siFXIh2-M3S, FXIil-MIS, siFXIi1-M2S, siFXIi1-M3S, siFXB2-M1S, siFXIi2-M2S и siFXIi2-M3S, перечисленных в Таблицах 1a-1i.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 5'-концевой нуклеотид в антисмысловой цепи миРНК представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата.

Обычно применяемые 5'-фосфатные нуклеотиды или нуклеотиды, модифицированные аналогом 5'-фосфата, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, 5'-фосфатные нуклеотиды могут иметь следующую структуру:

в качестве другого примера, раскрытого в Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48, приведены следующие четыре нуклеотида, модифицированные аналогом 5'-фосфата:

где R выбран из Η, ОН, метокси и F;

«Основание» представляет собой основание нуклеиновой кислоты, выбранное из A, U, С, G или Т.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 5'-фосфатный нуклеотид представляет собой нуклеотид с 5'-фосфатной модификацией, представленный Формулой (2); нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, представляет собой нуклеотид с винилфосфонатной модификацией, представленный Формулой (3), или модифицированный фосфотиоатом нуклеотид, представленный Формулой (5).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению представляет собой любую из siFXIa1-ΜΙΡΙ, siFXIa1-M2P1, siFXIa1-M3P1, siFXIa2-M1P1, siFXIa2-M2P1, siFXIa2-M3P1, siFXIa1-M1SP1, siFXIa1-M2SP1, siFXIa1-M3SP1, siFXIa2-M1SP1, siFXIa2-M2SP1, siFXIa2-M3SP1, siFXIb1-MIPI, siFXIb1-M2P1, siFXIb1-M3PI, siFXIb2-MIPI, siFXIb2-M2PI, siFXIb2-M3P1, siFXIb1-M1SP1, siFXIb1-M2SP1, siFXIb1-M3SP1, siFXIb2-M1SP1, siFXIb2-M2SP1, siFXIb2-M3SP1, siFXIc1-ΜΙΡΙ, siFXIc1-M2P1, siFXIc1-M3P1, siFXIc2-M1P1, siFXIc2-M2P1, siFXIc2-M3P1, siFXIc1-M1SP1, siFXIc1-M2SP1, siFXIc1-M3SP1, siFXIc2-M1SP1, siFXIc2-M2SP1, siFXIc2-M3SP1, siFXId1-M1P1, siFXId1-M2P1, siFXId1-M3P1, siFXId2-M1P1, siFXId2-M2P1, siFXId2-M3P1, siFXId1-M1SP1, siFXId1-M2SP1, siFXId1-M3SP1, siFXId2-M1SP1, siFXId2-M2SP1, siFXId2-M3SP1, siFXIe1-ΜΙΡΙ, siFXIe1-M2P1, siFXIe1-M3P1, siFXIe2-M1P1, siFXle2-M2P1, siFXle2-M3P1, siFXlel-M1SP1, siFXlel-M2SP1, siFXlel-M3SP1, siFXIe2-M1SP1, siFXIe2-M2SP1, siFXIe2-M3SP1, siFXIf1-ΜΙΡΙ, siFXIf1-M2P1, siFXIf1-M3P1, siFXIf2-M1P1, siFXIf2-M2P1, siFXIf2-M3P1, siFXIf1-M1SP1, siFXIf1-M2SP1, siFXIf1-M3SP1, siFXIf2-M1SP1, siFXffi2-M2SP1, siFXffi2-M3SP1, siFXlgl-ΜΙΡΙ, siFXlgl-M2P1, siFXlgl-M3P1, siFXlg2-M1P1, siFXlg2-M2P1, siFXIg2-M3P1, siFXIg1-M1SP1, siFXIg1-M2SP1, siFXIg1-M3SP1, siFXIg2-M1SP1, siFXIg2-M2SP1, siFXIg2-M3SP1, siFXIh1-ΜΙΡΙ, siFXIh1-M2P1, siFXIh1-M3P1, siFXIh2-M1P1, siFXIh2-M2P1, siFXIh2-M3P1, siFXIh1-M1SP1, siFXIh1-M2SP1, siFXlhl-M3SP1, siFXlh2-M1SP1, siFXlh2-M2SP1, siFXlh2-M3SP1, FXlil-M1P1, siFXIi1-M2P1, siFXIi1-M3P1, siFXIi2-M1P1, siFXIi2-M2P1, siFXIi2-M3P1, siFXIi1-M1SP1, siFXIi1-M2SP1, siFXIi1-M3SP1, siFXIi2-M1SP1, siFXIi2-M2SP1 и siFXIi2-M3SP1, перечисленных в Таблицах 1a-1i.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что миРНК согласно настоящему изобретению обладают значительно повышенной стабильностью в плазме и лизосомах, сниженными нецелевыми эффектами, сохраняя при этом более высокую ингибирующую активность по отношению к целевой мРНК.

миРНК согласно настоящему изобретению могут быть получены с помощью обычных способов получения миРНК в данной области техники, например, с помощью способов твердофазного синтеза и жидкофазного синтеза. При этом для твердофазного синтеза уже доступны коммерческие услуги по требованиям заказчика. Модифицированные нуклеотиды могут быть введены в миРНК согласно настоящему изобретению с применением нуклеотидного мономера, имеющего соответствующую модификацию. Способы получения нуклеотидного мономера, имеющего соответствующую модификацию, и способы введения модифицированного нуклеотида в миРНК также хорошо известны специалистам в данной области техники.

Фармацевтическая композиция

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанную миРНК в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой носитель, обычно применяемый в области введения миРНК, например, но не ограничиваясь этим, один или более из магнитных наночастиц (таких как наночастицы на основе Fe₃O₄ и Fe₂O₃), углеродных нанотрубок, мезопористого кремния, наночастиц фосфата кальция, полиэтиленимина (ΡΕΙ), дендримера полиамидоамина (РАМАМ), поли-L-лизина (PLL), хитозана, 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (DOTAP), сополимера D- и L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), поли-2-аминоэтилэтиленфосфата (РРЕЕА), поли-2-диметиламиноэтилметакрилата (PDMAEMA) и их производных.

Особые требования к содержанию миРНК и фармацевтически приемлемому носителю в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению отсутствуют. Они могут присутствовать в любом количестве, обычно используемом для каждого компонента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения массовое отношение миРНК к фармацевтически приемлемому носителю может составлять 1:(1-500), и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанное выше массовое отношение составляет 1:(1-50).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция также может содержать другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые могут представлять собой один или более из различных составов или соединений, обычно применяемых в данной области техники. Например, указанные другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут содержать по меньшей мере один из буфера рН, защитного агента и регулятора осмотического давления.

Буфер рН может представлять собой буферный раствор гидрохлорида трис-гидроксиметиламинометана с рН=7,5-8,5 и/или фосфатный буферный раствор с рН=5,5-8,5, такой как фосфатный буферный раствор с рН=5,5-8,5.

Защитный агент может представлять собой по меньшей мере один из инозита, сорбита, сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы и глюкозы. Содержание защитного агента может составлять от 0,01 масс. % до 30 масс. % на основании общей массы фармацевтической композиции.

Регулятор осмотического давления может представлять собой хлорид натрия и/или хлорид калия. Содержание регулятора осмотического давления обеспечивает осмотическое давление фармацевтической композиции 200-700 мОсм/кг. В зависимости от целевого осмотического давления специалисты в данной области техники могут легко определить содержание регулятора осмотического давления.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может представлять собой жидкий состав, например, раствор для инъекций; или лиофилизированный порошок для инъекций, который смешивают с жидким вспомогательным веществом для получения жидкого состава при введении. Жидкий состав можно вводить, но не ограничиваясь этим, путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, а также можно вводить, но не ограничиваясь этим, в легкие путем распыления или другие органы (такие как печень) через легкие путем распыления. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят с помощью внутривенной инъекции.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть в форме липосомного состава. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, применяемый в липосомном составе, содержит аминосодержащее соединение для транс фекции (далее по тексту также упоминаемое как органический амин), вспомогательный липид и/или пегилированный липид. При этом органический амин, вспомогательный липид и пегилированный липид могут быть выбраны, соответственно, из одного или более из аминосодержащих соединений для трансфекции или их фармацевтически приемлемых солей или производных, вспомогательных липидов и пегилированных липидов, описанных в CN 103380113 A, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический амин может представлять собой соединение, представленное Формулой (201), раскрытый в CN 103380113 A, или его фармацевтически приемлемую соль:

где

X₁₀₁ и Х₁₀₂ независимо друг от друга выбраны из О, S, N-A или С-А, где А представляет собой водород или С₁-С₂₀ углеводородную цепь;

Y₁₀₁ и Z₁₀₁ независимо друг от друга выбраны из С=O, C=S, S=O, СН-ОН или SO₂;

R₁₀₁, R₁₀₂, R₁₀₃, R₁₀₄, R₁₀₅, R₁₀₆ и R₁₀₇ независимо друг от друга выбраны из водорода; циклической или ациклической, замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной алифатической группы; циклической или ациклической, замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной гетероалифатической группы; замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной ацильной группы; замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной арильной группы; и замещенной или незамещенной, разветвленной или линейной гетероарильной группы; х представляет собой целое число от 1 до 10;

n представляет собой целое число от 1 до 3, m представляет собой целое число от 0 до 20,

р равно 0 или 1, при этом, если m=p=0, то R₁₀₂ представляет собой водород; и если по меньшей мере один из n и m равен 2, то R₁₀₃ и азот в Формуле (201) образуют структуру, представленную Формулой (202) или (203):

в которых g, е и f независимо друг от друга представляют собой целое число 1-6; «НСС» представляет собой углеводородную цепь и каждый *N представляет собой атом азота, показанный в Формуле (201).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₃ представляет собой полиамин. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₃ представляет собой кеталь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀₁ и R₁₀₂ в Формуле (201) независимо друг от друга представляют собой любой замещенный или незамещенный, разветвленный или линейный алкил или алкенил, причем указанный алкил или алкенил содержит от 3 до около 20 атомов углерода (например, от 8 до около 18 атомов углерода) и 0-4 двойные связи (например, 0-2 двойные связи).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если пит независимо друг от друга представляют собой 1 или 3, R₁₀₃ может представлять собой любую из следующих формул (204)-(213):

где в Формулах (204)-(213) g, е и f независимо друг от друга представляют собой целое число от 1 до 6, каждый «НСС» представляет собой углеводородную цепь и каждый символ * представляет собой потенциальную точку присоединения R₁₀₃ к атому азота в Формуле (201), при этом каждый Н в любом * положении может быть замещен, чтобы осуществить присоединение к атому азота в Формуле (201).

Соединение, представленное Формулой (201), может быть получено в соответствии с описанием CN 103380113 A.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический амин представляет собой органический амин, представленный Формулой (214), и/или органический амин, представленный Формулой (215):

Вспомогательный липид представляет собой холестерин, аналоги холестерина и/или производные холестерина, и

указанный пегилированный липид представляет собой 1,2-дипальмитоиламин-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-N-[метоксиполиэтиленгликоль]-2000.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молярное отношение между органическим амином, вспомогательным липидом и пегилированным липидом в фармацевтической композиции составляет (19,7-80): (19.7-80): (0,3-50), например, молярное отношение может составлять (50-70): (20-40): (3-20).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы фармацевтической композиции, образованной миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанными аминосодержащими реагентами для трансфекции, имеют средний диаметр от около 30 нм до около 200 нм, как правило, от около 40 нм до около 135 нм, и более типично средний диаметр липосомных частиц составляет от около 50 нм до около 120 нм, от около 50 нм до около 100 нм, от около 60 нм до около 90 нм или от около 70 нм до около 90 нм; например, средний диаметр липосомных частиц составляет около 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или 160 нм.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в фармацевтической композиции, образованной миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанными аминосодержащими агентами для трансфекции, массовое отношение (отношение масса/масса) миРНК к общим липидам, например, органическим аминам, вспомогательным липидам и/или пегилированным липидам, варьируется от около 1:1 до около 1:50, от около 1:1 до около 1:30, от около 1:3 до около 1:20, от около 1:4 до около 1:18, от около 1:5 до около 1:17, от около 1:5 до около 1:15, от около 1:5 до около 1:12, от около 1:6 до около 1:12 или от около 1:6 до около 1:10. Например, массовое отношение миРНК согласно настоящему изобретению к общим липидам составляет около 1:5, 1:6, 1: 7, 1: 8, 1: 9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17 или 1:18.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может продаваться с каждым компонентом, предоставленным по отдельности, и может применяться в форме жидкого состава. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, образованная миРНК согласно настоящему изобретению и вышеуказанным фармацевтически приемлемым носителем, может быть получена с помощью различных известных способов, за исключением замены существующей миРНК на миРНК согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть получена в соответствии со следующим способом:

Органические амины, вспомогательные липиды и пегилированные липиды суспендируют в спирте в молярном отношении, описанном выше, и смешивают до однородности с получением раствора липидов; спирт применяют в таком количестве, чтобы полученный раствор липидов присутствовал в общей массовой концентрации от 2 до 25 мг/мл (например, от 8 до 18 мг/мл). Спирт представляет собой фармацевтически приемлемый спирт, такой как спирт, который находится в жидкой форме при приблизительно комнатной температуре, например, один или более из этанола, пропиленгликоля, бензилового спирта, глицерина, полиэтиленгликоля 200, полиэтиленгликоля 300 и полиэтиленгликоля 400, такого как этанол.

МиРНК согласно настоящему изобретению растворяют в забуференном солевом растворе для получения водного раствора миРНК. Забуференный солевой раствор имеет концентрацию от 0,05 до 0,5 М, такую как от 0,1 до 0,2 М. РН забуференного солевого раствора доводят до 4,0-5,5, например, 5,0-5,2. Забуференный солевой раствор применяют в таком количестве, чтобы миРНК присутствовала в концентрации не более 0,6 мг/мл, например, от 0,2 до 0,4 мг/мл. Буферная соль может представлять собой одну или более, выбранных из группы, состоящей из растворимого ацетата и растворимого цитрата, такого как ацетат натрия и/или ацетат калия.

Раствор липидов и водный раствор миРНК смешивают. Продукт, полученный путем смешивания, инкубируют при температуре от 40 до 60°С в течение по меньшей мере 2 минут (например, от 5 до 30 минут) для получения инкубированного липосомального состава. Отношение объемов раствора липидов к водному раствору миРНК составляет 1:(2-5) (например, 1:4).

Инкубированный липосомный состав концентрируют или разбавляют и затем подвергают удалению примесей и стерилизации с получением фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которая имеет следующие физико-химические параметры: рН от 6,5 до 8, процент инкапсуляции не ниже 80%, размер частиц от 40 до 200 нм, индекс полидисперсности не более 0,30 и осмотическое давление от 250 до 400 мОсм/кг. Например, физико-химические параметры могут быть следующими: рН от 7,2 до 7,6, процент инкапсуляции не ниже 90%, размер частиц от 60 до 100 нм, индекс полидисперсности не более 0,20 и осмотическое давление от 300 до 400 мОсм/кг.

При этом стадия концентрирования или разбавления может быть выполнена до, после или одновременно с удалением примесей. Способ удаления примесей может представлять собой любой из различных существующих способов, таких как ультрафильтрация с применением колонки с полыми волокнами 100 кДа, фосфатно-солевой буфер (ФСБ) при рН=7,4 в качестве раствора для обмена при ультрафильтрации и система тангенциального потока. Способ стерилизации может представлять собой любой из различных существующих способов, таких как стерилизация с помощью фильтрации на фильтре с размером пор 0,22 мкм.

Конъюгат миРНК

Согласно настоящему изобретению предложен конъюгат миРНК, который содержит описанную выше миРНК и присоединенную к ней конъюгирующую группу.

Как правило, конъюгирующая группа содержит по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую нацеливающую группу и необязательный линкер. Кроме того, миРНК, линкер и нацеливающая группа соединены последовательно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество нацеливающих групп составляет от 1 до 6. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество нацеливающих групп составляет от 2 до 4. Молекула миРНК может быть нековалентно или ковалентно конъюгирована с конъюгирующей группой, например, молекула миРНК может быть ковалентно конъюгирована с конъюгирующей группой. Положение конъюгации между миРНК и конъюгирующей группой может быть на 3'-конце или 5' -конце смысловой цепи миРНК, или на 5' -конце антисмысловой цепи миРНК, или во внутренней последовательности миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения положение конъюгации между миРНК и конъюгирующей группой находится на 3 -конце смысловой цепи миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгирующая группа может быть соединена с фосфатной группой, 2'-гидроксигруппой или основанием нуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгирующая группа также может быть соединена с 3'-гидроксигруппой, если нуклеотиды соединены за счет 2'-5' -фосфодиэфирной связи. Если конъюгирующая группа соединена с концом цепи миРНК, конъюгирующая группа, как правило, соединена с фосфатной группой нуклеотида; если конъюгирующая группа соединена с внутренней последовательностью миРНК, конъюгирующая группа, как правило, соединена с рибозным кольцом или основанием. Для различных типов соединения можно сослаться на: Muthiah Manoharan et.al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10(5): 1181-7.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК и конъюгирующая группа могут быть соединены с помощью кислото-лабильной или восстанавливаемой химической связи, и эти химические связи могут быть разрушены в кислой среде эндосом клетки, что приводит миРНК в свободное состояние. Для неразрушаемых видов конъюгации конъюгирующая группа может быть соединена со смысловой цепью миРНК, что сводит к минимуму влияние конъюгации на активность миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может представлять собой лиганд, обычно применяемый в области введения миРНК, например, различные лиганды, описанные в WO 2009082607 A2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может быть выбрана из одного или более из лигандов, образованных следующими нацеливающими молекулами или их производными: липофильных молекул, таких как холестерин, желчных кислот, витаминов (таких как витамин Е), молекул липидов с разной длиной цепи; полимеров, таких как полиэтиленгликоль; полипептидов, таких как пептид для проникновения в клетки; аптамеров; антител; квантовых точек; сахаридов, таких как лактоза, полилактоза, манноза, галактоза, N-ацетилгалактозамин (GalNAc); соли фолиевой кислоты; или рецепторных лигандов, экспрессируемых в паренхимных клетках печени, таких как асиалогликопротеин, асиало-сахарный остаток, липопротеины (такие как липопротеин высокой плотности, липопротеин низкой плотности и тому подобное), глюкагона, нейротрансмиттеров (таких как адреналин), факторов роста, трансферрина и тому подобного.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо выбран из лиганда, способного связываться с поверхностным рецептором клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцита млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с поверхностным рецептором гепатоцита человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой лиганд, способный связываться с печеночным поверхностным рецептором асиалогликопротеина (ASGPR) на поверхности гепатоцитов. Типы этих лигандов хорошо известны специалистам в данной области техники, и они, как правило, выполняют функцию связывания со специфическим рецептором на поверхности целевой клетки, что опосредует доставку ми РНК, связанной с лигандом, в целевую клетку.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа может представлять собой любой лиганд, который имеет аффмнность к рецепторам асиалогликопротеина (ASGβ-R) на поверхности гепатоцитов млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо представляет собой асиалогликопротеин, такой как асиалооросомукоид (ASOR) или асиалофетуин (ASF). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лиганд представляет собой сахарид или его производные.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд представляет собой сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой моносахарид, полисахарид, модифицированный моносахарид, модифицированный полисахарид или производное сахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд может представлять собой моносахарид, дисахарид или трисахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один лиганд представляет собой модифицированный сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд представляет собой модифицированный сахарид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд независимо выбран из полисахарида, модифицированного полисахарида, моносахарида, модифицированного моносахарида, производного полисахарида и производного моносахарида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд или по меньшей мере один лиганд выбран из группы, состоящей из глюкозы и ее производных, маннозы и ее производных, галактозы и ее производных, ксилозы и ее производных, рибозы и ее производных, фукозы и ее производных, лактозы и ее производных, мальтозы и ее производных, арабинозы и ее производных, фруктозы и ее производных, а также сиаловой кислоты.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый лиганд может быть независимо выбран из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионил галактозами на, N-n- бутирилгалактоз амина, N- изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-р-В-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида,

4-тио-β-D-галактопиранозы,

этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-β-глюкогептопиранозида,

2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы. Другие варианты лиганда могут быть найдены, например, в раскрытии CN 105378082 A, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа в конъюгате миРНК может представлять собой галактозу или N-ацетилгалактозамин, причем молекулы галактозы или N-ацетилгалактозамина могут быть моно-, би-, три- или тетравалентными. Следует понимать, что термины моно-, би-, три- или тетравалентный, описанные в настоящем документе, соответственно, означают, что молярное отношение молекулы миРНК к молекуле галактозы или N-ацетилгалактозамина в конъюгате миРНК составляет 1:1, 1:2, 1:3 или 1:4, причем конъюгат миРНК образован из молекулы миРНК и конъюгирующей группы, содержащей молекулу галактозы или N-ацетилгалактозамина в качестве нацеливающей группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемая нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если миРНК согласно настоящему изобретению конъюгирована с конъюгирующей группой, содержащей N-ацетилгалактозамин, молекула N-ацетилгалактозамина является трехвалентной или четырехвалентной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если миРНК согласно настоящему изобретению конъюгирована с конъюгирующей группой, содержащей N-ацетилгалактозамин, молекула N-ацетилгалактозамина является трехвалентной.

Нацеливающая группа может быть соединена с молекулой миРНК за счет соответствующего линкера, и соответствующий линкер может быть выбран специалистами в данной области техники в соответствии с конкретным типом нацеливающей группы. Типы этих линкеров и нацеливающих групп, а также виды соединения с миРНК можно найти в раскрытии WO 2015006740 А2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин, подходящий линкер может иметь следующую структуру, представленную Формулой (301):

где

к представляет собой целое число от 1 до 3;

L^A представляет собой цепную группу, содержащую амидную связь, которая имеет структуру, представленную Формулой (302), и каждый L^A соответствующим образом соединен с нацеливающей группой и группой L^C посредством простой эфирной связи на двух своих концах:

L^B представляет собой цепную группу, содержащую N-ацилпирролидин, которая имеет структуру, представленную Формулой (303), причем цепная группа содержит карбонильную группу на одном конце и соединена с группой L^C за счет амидной связи, а также содержит оксигруппу на другом конце и соединена с указанной миРНК за счет сложной фосфоэфирной связи:

L^c представляет собой двухвалентную или четырехвалентную соединяющую группу на основе гидроксиметиламинометана, дигидроксиметиламинометана или тригидроксиметиламинометана, и группа L^C соединена с каждой из групп L^A посредством простой эфирной связи посредством атома кислорода и соединена с группой L^B посредством амидной связи за счет атома азота.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если n=3 и L^C представляет собой четырехвалентную соединяющую группу на основе тригидроксиметиламинометана, конъюгат миРНК, образованный путем соединения молекул N-ацетилгалактозамина с молекулой миРНК за счет -(L^A)_з-тригидроксиметиламинометан-L в- в качестве линкера, имеет структуру, представленную Формулой (304):

в которой структура двойной спирали представляет миРНК.

Аналогичным образом, положение конъюгации между миРНК и конъюгирующей группой может находиться на 3'-конце или 5'-конце смысловой цепи миРНК, или на 5'-конце антисмысловой цепи, или во внутренней последовательности миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 3'-конец смысловой цепи миРНК согласно настоящему изобретению ковалентно конъюгирован с тремя молекулами N-ацетилгалактозамина (GalNAc) за счет линкера -(L^A)₃ -тригидроксиметиламинометан-L ^B - с получением конъюгата миРНК, в котором молярное отношение молекулы миРНК к молекуле GalNAc составляет 1:3 (далее также упоминается как (GalNAc)₃ -миРНК), и этот конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (305):

в которой структура двойной спирали представляет миРНК; и линкер соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если нацеливающая группа представляет собой N-ацетилгалактозамин, подходящий линкер может иметь структуру, представленную Формулой (306):

где

l представляет собой целое число от 0 до 3;

* представляет собой положение на указанном линкере, соединенное с указанной нацеливающей группой за счет простой эфирной связи; и

# представляет собой положение на указанном линкере, соединенное с указанной миРНК за счет сложной фосфоэфирной связи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если l=2, конъюгат ми РНК имеет структуру, представленную Формулой (307):

в которой структура двойной спирали обозначает миРНК; и линкер соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК.

Указанные выше конъюгаты могут быть синтезированы в соответствии со способом, подробно описанным в предшествующем уровне техники. Например, в WO 2015006740 А2 подробно описаны способы получения различных конъюгатов. Конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может быть получен с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, в WO 2014025805 А1 описан способ получения конъюгата, имеющего структуру, представленную Формулой (305). Rajeev et al, ChemBioChem 2015, 16, 903-908 описали способ получения конъюгата, имеющего структуру, представленную Формулой (307).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (308):

где

n1 представляет собой целое число от 1 до 3, и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;

m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляют собой целые числа от 2 до 10;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅ независимо друг от друга представляют собой Н, или выбраны из группы, состоящей из C₁-С₁₀ алкила, C₁-С₁₀ галогеналкила и C₁-С₁₀ алкокси,

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой (А59):

в которой E₁ представляет собой ОН, SH или ВН₂; и Nu представляет собой миРНК согласно настоящему изобретению;

R₂ представляет собой линейный алкилен от 1 до 20 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещены любой одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилен, С₂-С₁₀ алкинилен, С₆-С₁₀ арилен, С₃-C₁₈ гетероциклилен и С₅-С₁₀ гетероарилен, и при этом R₂ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: C₁-С₁₀ алкил, С₆-С₁₀арил, С₅-С₁₀ гетероарил, C₁-С₁₀ галогеналкил, -OC₁-С₁₀ алкил, -OC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкил, -SC₁-С₁₀ алкил, -SC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-SH, -SC1-C1 о галогеналкил, галоген, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, -N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкилфенил), -NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -СО₂Н, -C(O)O(C₁-С₁₀) алкил, -CON(C₁-С₁₀алкил)(C₁-C₁₀ алкил), -CONH(C₁-С₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-С₁₀алкил)С(O)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(фенил), -C(O)C₁-C₁₀) алкил, -C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, -C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, -OC(O)C₁-С₁₀алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C_1N алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

каждый L₁ представляет собой линейный алкилен от 1 до 70 атомов углерода в длину, причем один или более атом углерода необязательно замещен любой одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из: С(О), NH, О, S, CH=N, S(O)₂, С₂-С₁₀ алкенилен, С₂-С₁₀ алкинилен, С₆-С₁₀ арилен, С₃-C₁₈ гетер оцикли лен и С₅-С₁₀ гетероарилен, и при этом L₁ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: C₁-С₁₀ алкил, С₆-С₁₀ арил, С₅-С₁₀ гетероарил, C₁-С₁₀ галогеналкил, -OC₁-С₁₀ алкил, -OC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-ОН, -OC₁-С₁₀ галогеналкил, -SC₁-С₁₀ алкил, -SC₁-С₁₀ алкилфенил, -C₁-С₁₀ алкил-SH, -SC₁-C₁₀ галогеналкил, галоген, -ОН, -SH, -NH₂, -C₁-С₁₀ алкил-NH₂, -N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкил), -NH(C₁-C₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)(С₁-С₁₀ алкилфенил), -NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, -СО₂Н, -C(O)O(C₁-С₁₀ алкил), -CON(C₁-С₁₀алкил)(C₁-C₁₀ алкил), -CONH(C₁-С₁₀ алкил), -CONH₂, -NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), -NHC(O)(фенил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(С₁-С₁₀ алкил), -N(C₁-C₁₀ алкил)С(O)(фенил), -C(O)C₁-С₁₀алкил, -C(O)C₁-С₁₀алкилфенил, -C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, -OC(O)C₁-С₁₀алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, -SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и -NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ может быть выбран из группы, состоящей из групп формул (А1)-(А26) или любой их комбинации, причем структуры и определения А1-А26 приведены далее:

где j1 представляет собой целое число от 1 до 20;

j2 представляет собой целое число от 1 до 20;

R' представляет собой C₁-С₁₀ алкил;

Ra выбран из группы, состоящей из групп Формул (А27)-(А45) или любой их комбинации:

Rb представляет собой C₁-С₁₀ алкил; и

представляет собой положение, в котором группа присоединена ковалентно.

Специалисты в данной области техники поймут, что, несмотря на то, что для удобства L₁ определен как линейный алкил, он не может представлять собой линейную группу или не может называться по-другому, например, амином или алкенилом, полученным с помощью указанной выше замены и/или замещения. Для целей настоящего изобретения длина L₁ представляет собой количество атомов в цепи, соединяющей две точки присоединения. Для этой цели кольцо, полученное путем замещения атома углерода линейного алкилена, такого как гетероциклилен или гетероарилен, считается как один атом.

M₁ представляет собой нацеливающую группу, определения и варианты которой аналогичны определениям и вариантам вышеуказанных нацеливающих групп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый M₁ независимо выбран из лигандов, которые обладают аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов млекопитающего.

Если M₁ представляет собой лиганд, который обладает аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина на поверхности гепатоцита млекопитающего, согласно некоторым вариантам реализации n1 может представлять собой целое число от 1 до 3, а n3 может представлять собой целое число от 0 до 4, чтобы гарантировать, что количество нацеливающей группы M₁ в конъюгате может составлять по меньшей мере 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n1+n3≥2, поэтому количество нацеливающей группы M₁ составляет по меньшей мере 3, это обеспечивает более легкое связывание нацеливающей группы M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов, что может облегчать эндоцитоз конъюгата в клетки. Эксперименты показали, что, если количество нацеливающих групп Mi, превышает 3, легкость связывания нацеливающих групп M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов существенно не увеличивается. Таким образом, с учетом различных аспектов, таких как удобство синтеза, стоимость структуры/способа и эффективность доставки, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, n1 представляет собой целое число от 1 до 2, n3 представляет собой целое число от 0 до 1 и n1+n3=от 2 до 3.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляют собой целое число, выбранное из 2-10, стерические положения среди многих нацеливающих групп M₁ могут быть соответствующими для связывания нацеливающих групп M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов. Для того чтобы конъюгат согласно настоящему изобретению имел более простую структуру, более легкий синтез и/или уменьшенную стоимость, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляют собой целые числа 2-5, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения m1=m2=m3.

Специалисты в данной области техники поймут, что, если R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо друг от друга выбраны из Н, C₁-С₁₀ алкила, C₁-С₁₀ галогеналкила и C₁-С₁₀ алкокси, они не изменят свойства конъюгата согласно настоящему изобретению и все смогут достичь цели настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅ независимо друг от друга выбраны из Н, метила и этила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅ представляют собой Н.

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой А59, где E₁ представляет собой ОН, SH или ВН₂, и с учетом высокой доступности исходных материалов, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, E₁ представляет собой ОН или SH.

R₂ выбран для того, чтобы обеспечить соединение между группой, представленной Формулой А59, и атомом N на азотистом остове. Применительно к настоящему изобретению термин «азотистый остов» относится к цепной структуре, в которой атом N коаксиально связан с атомами углерода, к которым присоединены R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ или R₁₅. Таким образом, R₂ может представлять собой любую соединяющую группу, способную присоединять группу, представленную Формулой (А59), к атому N на азотистом остове с помощью подходящих средств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в случае если конъюгат миРНК Формулы (308) получен с помощью способа твердофазного синтеза, группа R₂ должна иметь и положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, и положение, соединяющееся с атомом Р в R₃. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в R₂ положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, образует амидную связь с атомом N, а положение, соединяющееся с атомом Р в R₃, образует сложную фосфоэфирную связь с атомом Р. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₂ может представлять собой В5, В6, В5 или В6:

в которых представляет собой положение, в котором группа присоединена ковалентно; q₂ может представлять собой целое число от 1 до 10; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q2 представляет собой целое число от 1 до 5.

L₁ применяется для соединения нацеливающей группы M₁ с атомом N на азотистом остове, что обеспечивает функцию нацеливания на печень для конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций одной или более из групп Формул (А1)-(А26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций одной или более из Формул Al, А4, А5, А6, А8, А10, А11 и А13. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формул (А1), (А4), (А8), (А10) и (А11). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ выбран из соединенных комбинаций по меньшей мере двух из Формул (А1), (А8) и (А10).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения длина L₁ может составлять от 3 до 25, от 3 до 20, от 4 до 15 или от 5 до 12 атомов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 атомов в длину.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1 представляет собой целое число от 2 до 10 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1 представляет собой целое число от 3 до 5. Согласно некоторым вариантам реализации j2 представляет собой целое число от 2 до 10 и согласно некоторым вариантам реализации j2 представляет собой целое число от 3 до 5. R' представляет собой С₁-С₄ алкил и согласно некоторым вариантам реализации R представляет собой метил, этил или изопропила. Ra представляет собой одну из Формул (А27), (А28), (А29), (А30) и (А31), и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Ra представляет собой Формулу (А27) или (А28). Rb представляет собой С₁-С₅ алкил и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой метил, этил, изопропил или бутил. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения j1, j2, R', Ra и Rb в Формулах (А1)-(А26), соответственно, выбраны, чтобы обеспечить соединение между нацеливающими группами M₁ и атомом N на азотистом остове, а также чтобы создать стерическое положение среди нацеливающих групп Mi, более подходящее для связывания нацеливающих групп M₁ с рецептором асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) или (422):

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым возможным положением в последовательности миРНК. Например, атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым нуклеотидом в смысловой или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле А59 соединен с любым нуклеотидом в смысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с концевой областью смысловой или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с концевой областью смысловой цепи миРНК. Указанная концевая область относится к первым 4 нуклеотидам, отсчитанным от одного конца смысловой или антисмысловой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле А59 соединен с любым концом смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле А59 соединен с 3''-концом смысловой цепи миРНК. В случае если атом Р в Формуле (А59) соединен с вышеуказанным положением смысловой цепи миРНК, после проникновения в клетки, конъюгат миРНК, как показано в Формуле (308), может высвобождать отдельную антисмысловую цепь миРНК во время раскручивания, что блокирует трансляцию мРНК FXI в белок и ингибирует экспрессию гена FXI.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) может быть соединен с любым возможным положением нуклеотида в миРНК, например, положением 5', положением 2', положением 3' или основанием нуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле А59 может быть соединен с положением 2'', 3'' или 5'' нуклеотида в миРНК путем образования сложной фосфодиэфирной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с атомом кислорода, образованным в результате депротонирования 3'-гидроксила нуклеотида на 3'-конце смысловой цепи в миРНК (в таком случае атом Р в Формуле (А59) также называют атомом Р в фосфатной группе миРНК), или атом Р в Формуле (А59) соединен с нуклеотидом путем замещения атома водорода в 2'-гидроксиле нуклеотида смысловой цепи в миРНК, или атом Р в Формуле (А59) соединен с нуклеотидом путем замещения атома водорода в 5'-гидроксиле нуклеотида на 5'-конце смысловой цепи в миРНК.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению проявляет значительно улучшенную стабильность в плазме и низкий нецелевой эффект и, кроме того, проявляет более высокую активность подавления в отношении мРНК FXI. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миРНК согласно настоящему изобретению может представлять собой одну из миРНК, как показано в Таблицах 1a-1i. Конъюгаты миРНК, содержащие такие миРНК, проявляют гораздо более высокую активность подавления в отношении мРНК FXI.

где С, G, U и А обозначают состав оснований нуклеотидов; m обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы т, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; f обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы f, представляет собой модифицированный фтором нуклеотид; s обозначает, что два нуклеотида по обеим сторонам от буквы s соединены тиофосфотиоатной связью; Р1 обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р1, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид или нуклеотид, модифицированный аналогом 5'-фосфата, в некоторых вариантах осуществления Р1 представляет собой специальным образом модифицированный нуклеотид VP, Ps или Р, где VP обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне VP, представляет собой нуклеотид, модифицированный винилфосфатом, Ps обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Ps, представляет собой тиофосфат-модифицированный нуклеотид, и Р обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид.

В миРНК или конъюгате миРНК согласно настоящему изобретению каждая пара смежных нуклеотидов соединена за счет сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи. Немостиковый атом кислорода или серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиоатдиэфирной связи заряжен отрицательно и может присутствовать в форме гидроксила или сульфгидрила. Кроме того, ион водорода в гидроксиле или сульфгидриле может быть частично или полностью замещен катионом. Катион может представлять собой любой катион, такой как один из катиона металла, катиона аммония NH4+или органического катиона аммония. Для того чтобы повысить растворимость, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, катион выбран из одного или более из катиона щелочного металла, катиона аммония, образованного третичным амином, и катиона четвертичного аммония. Ион щелочного металла может представлять собой K⁺ и/или Na⁺, а катион, образованный третичным амином, может представлять собой катион аммония, образованный триэтиламином, и/или катион аммония, образованный N,N-диизопропилэтиламином. Таким образом, миРНК и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению может по меньшей мере частично присутствовать в форме соли. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения немостиковый атом кислорода или атом серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи по меньшей мере частично связывается с ионом натрия, и, таким образом, миРНК и конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению присутствуют или частично присутствуют в форме натриевой соли.

Специалистам в данной области техники хорошо известно, что модифицированная нуклеотидная группа может быть введена в миРНК согласно настоящему изобретению с помощью нуклеозидного мономера с соответствующей модификацией. Способы получения нуклеозидного мономера, имеющего соответствующую модификацию, и способы введения модифицированной нуклеотидной группы в миРНК также хорошо известны специалистам в данной области техники. Все модифицированные нуклеозидные мономеры могут быть доступны коммерчески или получены с помощью известных способов.

Получение конъюгата чиРНК. представленного Формулой (308)

Конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), может быть получен с помощью любых соответствующих путей синтеза.

Согласно некоторым вариантам реализации конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), может быть получен с помощью следующего способа, включающего: последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов в смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК, соответственно, в условии твердофазного фосфоамидитного синтеза, причем стадия соединения каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации; выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК; и ренатурацию; при этом миРНК представляет собой указанную выше миРНК согласно настоящему изобретению.

Кроме того, способ дополнительно включает: приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт с нуклеозидным мономером или нуклеотидной последовательностью, соединенной с твердофазной подложкой, в условии реакции связывания и в присутствии связывающего агента, что приводит к связыванию соединения, представленного Формулой (321), с нуклеотидной последовательностью за счет реакции связывания. Далее по тексту соединение, представленное Формулой (321), также называют конъюгирующей молекулой.

где

R₄ представляет собой группу, способную связываться с миРНК, представленной Nu, в соединении, представленном Формулой (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ представляет собой группу, способную связываться с миРНК, представленной Nu, посредством ковалентной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R4 представляет собой группу, которая может быть конъюгирована с любой функциональной группой миРНК, представленной Nu, посредством сложной фосфодиэфирной связи с помощью реакции;

Каждый S₁ независимо представляет собой группу, образованную путем замещения всех активных гидроксилов в M₁ группой YCOO-, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и алкилфенила; в некоторых вариантах реализации изобретения Y представляет собой метил.

определения и варианты n1, n3, ml, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L₁ и M₁, соответственно, описаны выше.

R₄ выбран, чтобы обеспечить соединение с атомом N на азотистом остове и обеспечить подходящий реакционный сайт для синтеза конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит соединяющую группу R₂ или защищенную соединяющую группу R₂ и функциональную группу, которая может реагировать с миРНК с образованием структуры, представленной Формулой (А59).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит первую функциональную группу, которая может реагировать с группой на миРНК, представленной Nu, или нуклеозидном мономере с образованием сложного фосфитного эфира, и вторую функциональную группу, которая может образовывать ковалентную связь с гидроксигруппой или аминогруппой, или содержит твердофазную подложку, присоединенную за счет ковалентной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа представляет собой фосфоамидит, гидроксил или защищенный гидроксил. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа представляет собой фосфоамидит, карбоксил или карбоксилатную соль. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа представляет собой твердофазную подложку соединенную с остальной частью молекулы за счет ковалентной связи, которая образована гидроксигруппой или аминогруппой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка соединена за счет сложной фосфоэфирной связи, сложной карбоксиэфирной связи или амидной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка представляет собой смолу.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит гидрокси, -OR_k или группу, представленную Формулой (С3); вторая функциональная группа имеет структуру, представленную Формулой (C1), (С2), (С3), (С1') или (С3'):

в которых q₁ представляет собой целое число от 1 до 4, X представляет собой О или NH, М⁺ представляет собой катион, R_k представляет собой защищающую гидроксил группу, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит фосфоамидитную группу, такую как группа, представленная Формулой (С3). Фосфоамидитная группа может образовывать сложный фосфитный эфир с гидроксилом в любом положении на нуклеотиде (таком как 2'-гидрокси или 3'-гидрокси) с помощью реакции связывания, а сложный фосфитный эфир может образовывать сложную фосфодиэфирную связь или сложную фосфотиоэфирную связь, представленную Формулой (А59), за счет окисления или сульфуризации, так, чтобы конъюгировать конъюгирующую молекулу с миРНК. В настоящем документе, даже если вторая функциональная группа не существует, соединение, представленное Формулой (321), все еще может быть конъюгировано с нуклеотидом, не влияя при этом на получение конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). При таких обстоятельствах, после получения смысловой или антисмысловой цепи миРНК с помощью такого способа как твердофазный фосфоамидитный синтез, соединение, представленное Формулой (321), подвергают взаимодействию с гидроксилом на концевом нуклеотиде нуклеотидной последовательности и в последующем процессе окисления или сульфуризации образуется сложная фосфодиэфирная связь или связь с фосфотиоатным соединением, что приводит к конъюгации соединения, представленного Формулой (321), с миРНК.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит защищенную гидроксигруппу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа содержит группу, которая может реагировать с твердофазной подложкой, чтобы обеспечить конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая функциональная группа содержит карбоксил, карбоксилатную соль или фосфоамидит, например, функциональная группа, представленная Формулой (C1), (С2) или (С3). Если вторая функциональная группа содержит карбоксильную или карбоксилатную соль, соединение, представленное Формулой (321), может реагировать с гидрокси- или аминогруппой на твердофазной подложке (такой как смола) за счет реакции этерификации или амидирования с образованием конъюгирующей молекулы, содержащей твердофазную подложку, присоединенную за счет карбоксилатной сложноэфирной связи. Если вторая функциональная группа содержит фосфоамидитную функциональную группу, соединение, представленное Формулой (321), может быть связано с гидроксигруппой на универсальной твердофазной подложке (такой как смола) и путем окисления образует конъюгирующую молекулу, содержащую твердофазную подложку, присоединенную за счет фосфодиэфирной связи. Затем, начиная с указанного выше продукта, соединенного с твердофазной подложкой, нуклеозидные мономеры последовательно соединяют с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза с получением смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК, соединенной с конъюгирующей группой. Во время твердофазного фосфоамидитного синтеза снимают защиту с первой функциональной группы, а затем связывают ее с фосфоамидитной группой на нуклеозидном мономере в условии реакции связывания.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая функциональная группа содержит гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу; вторая функциональная группа содержит твердофазную подложку, присоединенную за счет сложной карбоксиэфирной связи, амидной связи или сложной фосфоэфирной связи, как представлено Формулой (С1'), или (С3'). При таких обстоятельствах, начиная с соединения, представленного Формулой (321), вместо твердофазной подложки, нуклеозидные мономеры последовательно соединяют с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза с получением смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК, соединенной с конъюгирующей группой.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения карбоксилат может быть представлен как -СОО^-М⁺, где М⁺ представляет собой катион, такой как выбранный из катиона металла, катиона аммония NH₄⁺ и органического катиона аммония. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения катион металла может представлять собой катион щелочного металла, такой как K⁺ или Na⁺. Чтобы повысить растворимость и облегчить реакцию, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, органический катион аммония представляет собой катион аммония, образованный третичным амином или катионом четвертичного аммония, таким как катион аммония, образованный триэтиламином, или катион аммония, образованный N,N-диизопропилэтиламином. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения карбоксилат представляет собой карбоксилат триэтиламина или карбоксилат N,N-диизопропилэтиламина.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R4 содержит структуру, представленную Формулой (В9), (B10), (В9'), (B10'), (B11), (В12), (В11') или В(12'):

в которых q₁ представляет собой целое число от 1 до 4, q₂ представляет собой целое число от 1 до 10, X представляет собой О или NH, М⁺ представляет собой катион, R_k представляет собой защищающую гидроксил группу, SPS представляет собой твердофазную подложку и представляет собой положение, в котором группа ковалентно присоединена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q₁ равно 1 или 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения q₂ представляет собой целое число от 1 до 5. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит структуру, представленную Формулой (В9) или (В10). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R₄ содержит структуру, представленную Формулой (В11) или (В12).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R_k представляет собой один или более из Tr (тритил), ММТг (4-метокситритил), DMTr (4,4'-диметокситритил) и TMTr (4,4',4''-триметокситритил). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R_k может представлять собой DMTr, т.е. 4,4''-диметокситритил.

Определение L₁ описано выше.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ применяют для соединения нацеливающей группы M₁ с атомом N на азотистом остове, что обеспечивает функцию нацеливания на печень для конъюгата миРНК, представленного Формулой (308). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения L₁ содержит любую из Формул (А1)-(А26) или их комбинацию.

В соответствии с вышеприведенным описанием, специалисты в данной области техники легко поймут, что по сравнению со способом твердофазного фосфоамидитного синтеза, хорошо известным в данной области техники, конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), в котором конъюгирующая молекула соединена с любым возможным положением нуклеотидной последовательности, может быть получен с помощью вышеуказанной первой функциональной группы и необязательной второй функциональной группы. Например, конъюгирующая молекула соединена с концевой областью нуклеотидной последовательности или с концом нуклеотидной последовательности. Соответственно, если не указано иное, в следующем описании, касающемся получения конъюгата и/или конъюгирующей молекулы, при ссылке на такие реакции как «снятие защиты», «связывание», «кэпирование», «окисление», «сульфуризация» следует понимать, что к этим реакциям также будут применимы условия реакции и агенты, участвующие в способе твердофазного фосфоамидитного синтеза, хорошо известном в данной области техники. Примерные условия реакции и агенты будут подробно описаны ниже.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо представляет собой М₁.Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый Si независимо представляет собой группу, образованную в результате защиты по меньшей мере одной активной гидроксильной группы в M₁ с применением защищающей гидроксил группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо представляет собой группу, образованную в результате защиты всех активных гидроксильных групп в M₁ с применением защищающих гидроксил групп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая защищающая гидроксил группа, известная специалисту в данной области техники, может применяться для защиты активной гидроксильной группы в М₁. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения защищенный гидроксил может быть выражен Формулой YCOO-, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из C₁-С₁₀ алкила и С₆-С₁₀ арила, которая необязательно замещена одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена и C₁-C₆ алкила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлор метила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и C₁-C₆ алкилфенила.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый S₁ независимо выбран из группы, состоящей из Формул (А46)-(А54):

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Si представляет собой А49 или А50.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый Y независимо выбран из одного из метила, трифторметила, дифторметила, монофторметила, трихлорметила, дихлорметила, монохлорметила, этила, н-пропила, изопропила, фенила, галогенфенила и алкилфенила. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Y представляет собой метил.

Как упоминалось ранее, способ получения конъюгата миРНК, представленного Формулой (308), дополнительно включает следующие стадии: синтез другой цепи миРНК (например, если смысловая цепь миРНК, соединенная с конъюгирующей молекулой, синтезируется на вышеуказанной стадии, способ дополнительно включает синтез антисмысловой цепи миРНК методом твердофазного синтеза, и наоборот), выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи и ренатурацию. В частности, на стадии выделения твердофазную подложку, соединенную с нуклеотидной последовательностью и/или конъюгирующей молекулой, отщепляют и удаляют необходимую защитную группу (в этом случае каждая группа S₁ в соединении Формулы (321) превращается в соответствующую нацеливающую группу M₁) с получением смысловой цепи (или антисмысловой цепи) миРНК, соединенной с конъюгирующей молекулой и соответствующей антисмысловой цепью (или смысловой цепью). Смысловую цепь и антисмысловую цепь ренатурируют с образованием двухцепочечной РНК-структуры, что обеспечивает конъюгат миРНК, представленный Формулой (308).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения конъюгата миРНК, представленного Формулой (308), включает следующие стадии: приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт с первым нуклеозидным мономером на 3'-конце смысловой цепи или антисмысловой цепью в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, что приводит к связыванию соединения, представленного Формулой (321), с первым нуклеотидом в последовательности; последовательное связывание нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5'для синтеза смысловой или антисмысловой цепи миРНК в соответствии с требуемым типом и последовательностью нуклеотидов смысловой или антисмысловой цепи в условии твердофазного фосфорамидитного синтеза, причем соединение, представленное Формулой (321), представляет собой соединение, в котором R₄ содержит первую функциональную группу и вторую функциональную группу, причем первая функциональная группа содержит защищенный гидроксил, а вторая функциональная группа имеет структуру, представленную Формулой (С1^-) или (С3'), при этом перед связыванием с первым нуклеозидным мономером с соединения Формулы (321) снимают защиту; и соединение каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации; с получением таким образом смысловой или антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, соединенной с конъюгирующей группой; последовательное соединение нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5'для синтеза антисмысловой или смысловой цепи нуклеиновой кислоты в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов в смысловой или антисмысловой цепи в условиях твердофазного фосфорамидитного синтеза; причем соединение каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации; удаление защитной группы и расщепление твердофазной подложки; выделение и очистку смысловой цепи и антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты; и ренатурацию.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения конъюгата миРНК, представленного Формулой (308), включает следующие стадии: последовательное связывание нуклеозидных мономеров в направлении от 3' к 5' для синтеза антисмысловой и смысловой цепи в соответствии с типом и последовательностью нуклеотидов в двухцепочечной миРНК; причем связывание каждого нуклеозидного мономера включает четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации с получением смысловой цепи, соединенной с твердофазной подложкой, и антисмысловой цепи, соединенной с твердофазной подложкой; приведение в контакт соединения, представленного Формула (321) со смысловой цепью, соединенной с твердофазной подложкой, или антисмысловой цепью, соединенной с твердофазной подложкой, в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, что приводит к связыванию соединения, представленного Формулой (321), со смысловой цепью или антисмысловой цепью; причем соединение, представленное Формулой (321), представляет собой соединение, в котором R₄ содержит первую функциональную группу, которая представляет собой фосфорамидитную группу; удаление защитной группы и расщепление твердофазной подложки; соответственно, выделение и очистку смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК; и ренатурацию, где смысловая или антисмысловая цепь миРНК связана с конъюгирующей группой.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения атом Р в Формуле (А59) соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК, и способ получения конъюгата миРНК, представленного Формулой (308), включает:

(1) удаление защищающей гидроксил группы P_k в соединении, представленном Формулой (321), где соединение, представленное Формулой (321), представляет собой соединение, в котором R₄ содержит первую функциональную группу, содержащую защищенную гидроксильную группу OR_k, и вторую функциональную группу, которая содержит структуру, представленную Формулами (С1') или (С3'); приведение продукта со снятой защитой в контакт с нуклеозидным мономером с получением нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, в условии реакции связывания;

(2) начиная с нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, синтез смысловой цепи миРНК в направлении от 3' к 5' с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза;

(3) синтез антисмысловой цепи миРНК с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза; и

(4) выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК и их ренатурацию с получением конъюгата миРНК, представленного Формулой (308).

При этом на стадии (1) способ удаления защитной группы R_k в соединении, представленном Формулой (321), включает приведение соединения, представленного Формулой (321), в контакт с агентом для снятия защиты в условии снятия защиты. Условие снятия защиты включает температуру 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 30-300 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для снятия защиты представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 10:1 до 1000:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 50:1 до 500:1.

Условие реакции связывания и связывающий агент могут представлять собой любое условие и агент, подходящие для вышеуказанной реакции связывания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять те же условия и агент, как и в реакции связывания в способе твердофазного синтеза.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции связывания включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С. Молярное отношение соединения, представленного Формулой (321), к нукпеозидному мономеру составляет от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:2 до 1:5. Молярное отношение соединения, представленного Формулой (321), к связывающему агенту может составлять от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:3 до 1:10. Время реакции составляет 200-3000 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 500-1500 секунд. Связывающий агент выбран из одного или более из 1H-тетразола, 5-этилтио-1H-тетразола и 5-бензилтио-1H-тетразола и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой 5-этилтио-1H-тетразол. Реакция связывания может быть выполнена в органическом растворителе. Органический растворитель выбран из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного ДМФА и безводного дихлорметана и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой безводный ацетонитрил. По отношению к соединению, представленному Формулой (321), количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-20 л/моль.

На стадии (2) смысловую цепь SS конъюгата миРНК синтезируют в направлении от 3' к 5' с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза, начиная с нуклеозидного мономера, соединенного с твердофазной подложкой за счет конъюгирующей молекулы, полученной на предшествующей стадии. В этом случае группа конъюгации соединена с 3'-концом полученной смысловой цепи.

В качестве других условий твердофазного синтеза на стадиях (2) и (3), включая условие снятия защиты с нуклеозидного мономера, тип и количество агента для снятия защиты, условие реакции связывания, тип и количество связывающего агента, условие реакции кэпирования, тип и количество кэпирующего агента, условие реакции окисления, тип и количество окисляющего агента, условие реакции сульфуризации, а также тип и количество агента для сульфуризации, можно применять различные агенты, количества и условия, обычно используемые в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, твердофазный синтез на стадиях (2) и (3), можно проводить с применением следующих условий:

Условие снятия защиты для нуклеозидного мономера включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 30-300 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к защитной группе 4,4' -диметокситритил на твердофазной подложке составляет от 2:1 до 100:1 и, согласно некоторым вариантам реализации, от 3:1 до 50:1.

Условие реакции связывания включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, 15-35°С. Молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к нуклеозидному мономеру составляет от 1:1 до 1:50 и, согласно некоторым вариантам реализации, от 1:5 до 1:15. Молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к связывающему агенту составляет от 1:1 до 1:100 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 1:50 до 1:80. Выбор времени реакции и связывающего агента является таким же, как указано выше.

Условие реакции кэпирования включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 5-500 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 10-100 секунд. Выбор кэпирующего агента такой же, как указано выше. Молярное отношение общего количества кэпирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, составляет от 1:100 до 100:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 1:10 до 10:1. В случае если в качестве кэпирующего агента применяют эквимолярное количество уксусного ангидрида и N-метилимидазола, молярное отношение уксусного ангидрида, N-метилимидазола и последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, может составлять 1:1:10-10: 10:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет 1:1:2:2:1.

Условие реакции окисления включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 1-100 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-50 секунд. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения окисляющий агент представляет собой йод (согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде раствора йода в воде). Молярное отношение окисляющего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, может составлять от 1:1 до 100:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 5:1 до 50:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию окисления выполняют в смешанном растворителе, в котором соотношение тетрагидрофуран:вода:пиридин составляет 3:1:1-1:1:3. Условие реакции сульфуризации включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 50-2000 секунд и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 100-1000 секунд. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для сульфуризации представляет собой ксантановый гидрид. Молярное отношение агента для сульфуризации к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, составляет от 10:1 до 1000:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 10:1 до 500:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию сульфуризации выполняют в смешанном растворителе, в котором соотношение ацетонитрил:пиридин составляет 1:3-3:1.

Способ дополнительно включает выделение смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК после соединения всех нуклеозидных мономеров и перед ренатурацией. Способы выделения хорошо известны специалистам в данной области техники и обычно включают отщепление синтезированной нуклеотидной последовательности от твердофазной подложки, удаление защитных групп на основаниях, фосфатных группах и лигандах, очистку и обессоливание.

Общепринятые способы отщепления и снятия защиты при синтезе миРНК можно применять для отщепления синтезированной нуклеотидной последовательности от твердофазной подложки и удаления защитных групп на основаниях, фосфатных группах и лигандах. Например, полученную нуклеотидную последовательность, связанную с твердофазной подложкой, приводят в контакт с концентрированным водным раствором аммиака; во время снятия защиты защитная группа YCOO- в группах А46-А54 превращается в гидроксильную группу, и, таким образом, группы S₁ превращаются в соответствующие группы M₁, что обеспечивает конъюгат миРНК, представленный Формулой (308); причем концентрированный водный раствор аммиака может представлять собой водный раствор аммиака с концентрацией 25-30 масс. %. По отношению к целевой последовательности миРНК количество концентрированного водного раствора аммиака может составлять от 0,2 мл/мкмоль до 0,8 мл/мкмоль.

Если на синтезированной нуклеотидной последовательности имеется по меньшей мере одна защита 2'-TBDMS, способ дополнительно включает приведение нуклеотидной последовательности, отщепленной от твердофазной подложки, в контакт с тригидрофторидом триэтиламина для снятия защиты 2'-TBDMS. В настоящем документе соответствующий нуклеозид в полученной целевой последовательности миРНК имеет свободный 2'-гидроксил. По отношению к целевой последовательности миРНК количество чистого тригидрофторида триэтиламина может составлять 0,4 мл/мкмоль - 1,0 мл/мкмоль. Таким образом, может быть получен конъюгат миРНК, представленный Формулой (308).

Способы очистки и обессоливания хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, очистку нуклеиновой кислоты можно выполнять с применением колонки для очистки методом препаративной ионной хроматографии с градиентным элюированием NaBr или NaCl; после сбора и объединения продукта обессоливание можно выполнять с применением колонки для очистки методом хроматографии с обращенной фазой.

Немостиковый атом кислорода или серы в сложной фосфодиэфирной связи или сложной фосфотиодиэфирной связи между нуклеотидами в полученном конъюгате миРНК Формулы (308) по существу связывается с ионом натрия, и конъюгат миРНК Формулы (308) по существу присутствует в форме натриевой соли. Можно применять хорошо известные ионообменные способы, в которых ион натрия может быть заменен ионом водорода и/или другими катионами, что обеспечивает другие формы конъюгатов миРНК, представленных Формулой (308). Катионы представляют собой те, которые описаны выше.

Во время синтеза чистоту и молекулярную массу последовательности нуклеиновой кислоты можно определить в любое время, чтобы лучше контролировать качество синтеза. Такие способы определения хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, чистоту нуклеиновой кислоты можно определить с помощью ионообменной хроматографии, а молекулярную массу можно определить с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Способы ренатурации также хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, синтезированная смысловая цепь (S-цепь) и антисмысловая цепь (AS-цепь) могут быть просто смешаны в воде для инъекции в эквимолярном отношении, нагреты до 70-95°С, а затем охлаждены при комнатной температуре с образованием двухцепочечной структуры за счет водородной связи. Следовательно, может быть получен конъюгат миРНК, представленный Формулой (308).

После получения конъюгат, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, синтезированный конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), также можно охарактеризовать с помощью средств, таких как определение молекулярной массы с применением таких способов как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия, чтобы подтвердить, что синтезированный конъюгат миРНК представляет собой конъюгат миРНК, представленный Формулой (308), представляющий интерес, и последовательность синтезированной миРНК представляет собой желаемую последовательность миРНК, например, представляет собой одну из последовательностей, перечисленных в Таблице 1.

Соединение, представленное Формулой (321), может быть получено с помощью следующего способа получения, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (313), в контакт с циклическим ангидридом в органическом растворителе в условии реакции этерификации в присутствии основания и катализатора этерификации; ионный обмен и выделение соединения, представленного Формулой (321):

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, L₁ и S₁, соответственно, описаны выше.

Re представляет собой группу для обеспечения R₄ Формулы (321); в некоторых вариантах реализации изобретения Re имеет структуру, представленную Формулой (А61):

где R; представляет собой любую группу, способную соединяться с атомом N на азотистом остове, соединяться с R_kO и соединяться со свободной гидроксигруппой; R_k представляет собой защищающую гидроксил группу. В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), где R₄ содержит первую функциональную группу в качестве защищающей гидроксил группы и вторую функциональную группу, которая содержит структуру, представленную Формулой (С1) или (С2).

Условие реакции этерификации включает температуру реакции 0-100 С и время реакции 8-48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции этерификации включает температуру реакции 10-40°С и время реакции 20-30 часов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель содержит один или более из эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида,

N,N-диметилформамида и N,N--диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран, простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир, а галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (313).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения циклический ангидрид представляет собой один из янтарного ангидрида, глутарового ангидрида, адипинового ангидрида или пимелинового ангидрида, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид. Молярное отношение циклического ангидрида к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2:1 до 5:1.

Катализатор этерификации может представлять собой любой катализатор, способный катализировать этерификацию, такой как 4-диметиламинопиридин. Молярное отношение катализатора к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 10:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составляет от 2:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основание может представлять собой любое неорганическое основание, органическое основание или их комбинацию. Учитывая растворимость и стабильность продукта, основание может представлять собой, например, третичный амин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения третичный амин представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (313), составляет от 1:1 до 20:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения от 3:1 до 10:1.

Ионный обмен выполняет функцию превращения соединения, представленного Формулой (321), в целевую форму карбоновой кислоты или соли карбоновой кислоты, и способы ионного обмена хорошо известны специалистам в данной области техники. Указанная выше конъюгирующая молекула, в которой катион представляет собой М⁺, может быть получена с применением подходящего ионообменного раствора и условия ионного обмена, которые не указаны в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в реакции ионного обмена применяют раствор фосфата триэтиламина, и концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,2-0,8 М. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения концентрация раствора фосфата триэтиламина составляет 0,4-0,6 М, и количество раствора фосфата триэтиламина составляет 3-6 л/моль, а в дополнительных вариантах реализации 4-5 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (313).

Соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено из реакционной смеси с применением любых подходящих способов выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено с помощью удаления растворителя за счет выпаривания с последующей хроматографией. Например, для выделения можно использовать следующие два хроматографических условия: (1) очистка силикагеля с обычной фазой: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование 1 масс. триэтиламином в дихлорметан: метанол = 100:18-100:20; или (2) очистка с обращенной фазой: наполнитель с обращенной фазой С18 и С8, градиентное элюирование метанол:ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (321), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает: дальнейшее приведение продукта, полученного в результате вышеуказанной реакции ионного обмена, в контакт с твердофазной подложкой с амино- или гидроксигруппами в органическом растворителе в условии реакции конденсации в присутствии конденсирующего агента, катализатора конденсации и третичного амина. В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), где R.4 содержит первую функциональную группу, содержащую защищающую гидроксил группу, и вторую функциональную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (С1').

Твердофазная подложка представляет собой одну из подложек, применяемых в твердофазном синтезе миРНК, некоторые из которых хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, твердофазная подложка может быть выбрана из твердофазных подложек, содержащих активную функциональную(ые) гидрокси- или аминогруппу(ы), и в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой амино или гидрокси-смолу. В некоторых вариантах реализации изобретения амино- или гидрокси-смола имеет следующие параметры: размер частиц 100-400 меш и поверхностное содержание аминогрупп или гидроксигрупп 0,2-0,5 ммоль/г.Отношение соединения, представленного Формулой (321), к твердофазной подложке составляет 10-400 мкмоль соединения на грамм твердофазной подложки (мкмоль/г). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение соединения, представленного Формулой (321), к твердофазной подложке составляет от 50 мкмоль/г до 200 мкмоль/г.

Органический растворитель может представлять собой любой подходящий растворитель или смешанный растворитель, известный специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран; простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир; галогеналкановый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 20-200 л/моль, и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 50-100 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (321).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент может представлять собой гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония (РуВор), 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4(3Н)-он (DEPBT) и/или гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент представляет собой гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония. Молярное отношение конденсирующего агента к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 1:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения третичный амин представляет собой триэтиламин и/или N,N-диизопропилэтиламин и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 1:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает: приведение полученного продукта конденсации в контакт с кэпирующим агентом и катализатором ацилирования в органическом растворителе в условии реакции кэпирования и выделение соединения, представленного Формулой (321). Реакция кэпирования используется для удаления любой активной функциональной группы, которая не вступает в реакцию полностью, чтобы избежать образования ненужных побочных продуктов в последующих реакциях. Условие реакции кэпирования включает температуру реакции 0-50°С и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15-35°С, а также время реакции 1-10 часов и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 3-6 часов. Кэпирующий агент может представлять собой кэпирующий агент, применяемый в твердофазном синтезе миРНК, который хорошо известен специалистам в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кэпирующий агент состоит из кэпирующего агента 1 (capl) и кэпирующего агента 2 (сар2). Cap1 представляет собой N-метилимидазол и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде смешанного раствора N-метилимидазола в пиридине/ацетонитриле, причем объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет от 1:10 до 1:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1:3 до 1:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение общего объема пиридина и ацетонитрила к объему N-метилимидазола составляет от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 3:1 до 7:1. Сар2 представляет собой уксусный ангидрид и в некоторых вариантах реализации изобретения обеспечен в виде раствора уксусного ангидрида в ацетонитриле, причем объемное отношение уксусного ангидрида к ацетонитрилу составляет от 1:1 до 1:10 и, в дополнительных вариантах реализации изобретения, от 1:2 до 1:6.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отношение объема смешанного раствора N-метилимидазола в пиридине/ацетонитриле к массе соединения, представленного Формулой (321), составляет 5 мл/г-50 мл/г и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 15 мл/г-30 мл/г.Отношение объема раствора уксусного ангидрида в ацетонитриле к массе соединения, представленного Формулой (321), составляет 0,5 мл/г-10 мл/г и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 1 мл/г-5 мл/г.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кэпирующий агент содержит эквимолярное количество уксусного ангидрида и N-метилимидазола. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил. Количество органического растворителя составляет 10-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-30 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (321).

В некоторых вариантах реализации изобретения катализатор ацилирования может быть выбран из любого катализатора, который можно применять для конденсации путем этерификации или амидной конденсации, такого как щелочные гетероциклические соединения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения катализатор ацилирования представляет собой 4-диметиламинопиридин. Массовое отношение катализатора к соединению, представленному Формулой (321), составляет от 0,001:1 до 1:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 0,01:1 до 0,1:1.

В некоторых вариантах реализации соединение, представленное Формулой (321), может быть выделено из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов разделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (321), может быть получено путем тщательной промывки органическим растворителем и фильтрации для удаления не вступивших в реакцию реагентов, избыточного кэпирующего агента и других примесей, при этом органический растворитель выбран из ацетонитрила, дихлорметана и метанола. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой ацетонитрил.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ получения конъюгирующей молекулы, представленной Формулой (321), включает приведение соединения, представленного Формулой (313), в контакт с фосфодиамидитом в органическом растворителе в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента, и выделение соединения, представленного Формулой (321). В этом случае получают соединение, представленное Формулой (321), в котором R₄ содержит первую функциональную группу, содержащую защищающую гидроксил группу, и вторую функциональную группу, содержащую структуру, представленную Формулой (C3).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции связывания включает: температуру реакции, составляющую 0-50°С, например, 15-35°С; молярное отношение соединения, представленного Формулой (313), к фосфодиамидиту, равное от 1:1 до 1: 50, например, от 1:5 до 1:15; молярное отношение соединения, представленного Формулой (313), к связывающему агенту, равное от 1:1 до 1:100, например, от 1: 50 до 1:80; и время реакции, составляющее от 200 до 3000 секунд, например, от 500 до 1500 секунд. Фосфодиамидит может представлять собой, например, бис(диизопропиламино)(2-цианоэтокси)фосфин, который может быть доступен коммерчески или синтезирован в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Связывающий агент выбран из одного или более из 1H-тетразола, 5-этилтио-1H-тетразола и 5-бензилтио-1H-тетразола, например, 5-этилтио-1H-тетразол. Реакция связывания может быть выполнена в органическом растворителе. Органический растворитель выбран из одного или более из безводного ацетонитрила, безводного ДМФА и безводного дихлорметана, например, безводного ацетонитрила. В некоторых вариантах реализации изобретения, количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль, например, 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (313). При реакции связывания гидрокси группа в соединении, представленном Формулой (313), реагирует с фосфодиамидитом с образованием фосфоамидитной группы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (321), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации способ получения соединения, представленного Формулой (321), дополнительно включает следующие стадии: дополнительное приведение выделенного продукта в контакт с твердофазной подложкой с гидроксильными группами в органическом растворителе в условии реакции связывания в присутствии связывающего агента с последующим кэпированием, окислением и выделением, чтобы получить соединение, представленное Формулой (321), где R₄ содержит первую функциональную группу, содержащую защищающую гидрокси группу, и вторую функциональную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (С3').

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения твердофазная подложка представляет собой твердую подложку, хорошо известную в области твердофазного синтеза нуклеиновой кислоты, такую как коммерчески доступная универсальная твердофазная подложка со снятой защитой (подложка для синтеза олигонуклеотидов NittoPhase^®HL UnyL₁nker™ 300, Kinovate Life Sciences, представленная Формулой В80):

Реакция снятия защиты хорошо известна специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие снятия защиты включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 30-300 секунд, например, 50-150 секунд. Агент для снятия защиты может быть выбран из одной или более из трифторуксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты и монохлоруксусной кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент для снятия защиты представляет собой дихлоруксусную кислоту. Молярное отношение агента для снятия защиты к защитной группе -DMTr (4,4'-диметокситритил) на твердофазной подложке составляет от 2:1 до 100:1, например, от 3:1 до 50:1. С помощью такого удаления защиты на поверхности твердофазной подложки получают реакционноспособные свободные гидроксигруппы, чтобы облегчить последующую реакцию связывания.

Условие реакции связывания и связывающий агент могут быть выбраны, как указано выше. При реакции связывания свободные гидроксигруппы, образованные при снятии защиты, реагируют с фосфоамидитными группами с образованием сложноэфирной фосфитной связи.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции кэпирования включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 5-500 секунд, например, 10-100 секунд. Реакцию кэпирования выполняют в присутствии кэпирующего агента. Выбор и количество кэпирующего агента описаны выше.

Условие реакции окисления включает температуру 0-50°С, например, 15-35°С, и время реакции 1-100 секунд, например, 5-50 секунд. Окисляющий агент может представлять собой, например, йод (согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обеспечен в виде раствора йода в воде). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молярное отношение окисляющего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, составляет от 1:1 до 100:1, например, может составлять от 5:1 до 50:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реакцию окисления выполняют в смешанном растворителе, в котором соотношение тетрагидрофуран: вода: пиридин=3:1:1-1:1:3.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения R6 представляет собой одну из групп Формулы В7 или В8:

где определение q₂ представляет собой то, которое описано выше.

В этом случае соединение, представленное Формулой (313), может быть получено с помощью следующего способа получения, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (314), в контакт с соединением, представленным Формулой (А-1) или (А-2), в органическом растворителе в условии реакции амидирования в присутствии конденсирующего агента для реакции амидирования и третичного амина с последующим выделением:

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, L₁, S₁, q₁ и R_k, соответственно, описаны выше.

Условие реакции амидирования может включать температуру реакции 0-100°С и время реакции 1-48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции амидирования включает температуру реакции 10-40°С и время реакции 2-16 часов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из спиртового растворителя, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спиртовой растворитель представляет собой один или более из метанола, этанола и пропанола и, в некоторых вариантах, представляет собой этанол. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гало геналкано вый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя составляет 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 3-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (314).

В некоторых вариантах реализации изобретения агент для конденсации для реакции амидирования представляет собой гексафторфосфатбензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония, 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4 (3Н)-он, гидрохлорид 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил) -4-метилморфолина, 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ) или гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония и в других вариантах реализации изобретения представляет собой 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4(3Н)-он. Молярное отношение агента для конденсации для реакции амидирования к соединению, представленному Формулой (314), может составлять от 1:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2,5:1 до 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения третичный амин представляет собой триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и согласно некоторым вариантам реализации изобретения представляет собой N,N-диизопропилэтиламин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (314), составляет от 3:1 до 20:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 5:1 до 10:1.

Соединения, представлнные Формулами (А-1) и (А-2), могут быть получены с помощью любых подходящих способов. Например, если R_k представляет собой группу DMTr, соединение, представленное Формулой (А-1), может быть получено путем взаимодействия глицерата кальция с DMTrCl. Аналогичным образом, соединение, представленное Формулой (А-2), может быть получено путем приведения 3-амино-1,2-пропандиола в контакт с циклическим ангидридом и последующей реакции с DMTrCl, причем циклический ангидрид может содержать 4-13 атомов углерода и, в некоторых вариантах реализации, 4-8 атомов углерода. Специалисты в данной области техники легко поймут, что наборы различных циклических ангидридов соответствуют различным значениям q₁ в соединении, представленном Формулой (А-2). Например, если циклический ангидрид представляет собой янтарный ангидрид, q₂=l; если циклический ангидрид представляет собой глутаровый ангидрид, q₂=2 и так далее.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (313), также может быть получено путем последовательного взаимодействия соединения, представленного Формулой (314), с циклическим ангидридом, 3-амино-1,2-пропандиолом и DMTrCl. Специалисты в данной области техники легко поймут, что эти варианты не будут влиять на структуру и функцию соединения, представленного Формулой (313), и эти варианты легко реализуются специалистами в данной области техники на основе вышеуказанных способов.

Аналогичным образом, соединение, представленное Формулой (313), может быть выделено из реакционной смеси с помощью любых подходящих способов выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (313), может быть выделено с помощью удаления растворителя путем выпаривания с последующей хроматографией. Например, для выделения можно использовать следующие два хроматографических условия: (1) очистка силикагеля с обычной фазой: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование простой петролейный эфир: этилацетат: дихлорметан: N,N-диметилформамид = 1:1:1:0,5-1:1:0,6; и (2) очистка с обращенной фазой: наполнители с обращенной фазой С18 и С8, градиентное элюирование метанол: ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (313), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (314), может быть получено с помощью следующего способа получения, включающего: приведение соединения, представленного Формулой (320), в контакт с соединением, представленным Формулой (316), в органическом растворителе в условии реакции конденсации в присутствии агента конденсации для реакции амидирования и третичного амина с последующим выделением:

при этом определения и варианты n1, n3, m1, m2, m3, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅, соответственно, описаны выше.

Соединение, представленное Формулой (316), может представлять собой, например, соединение, описанное в J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961. Согласно другому варианту соединения, представленные в Формуле (316), могут быть получены специалистами в данной области техники с помощью различных способов. Например, некоторые соединения, представленные Формулой (316), могут быть получены в соответствии со способом, описанным в Примере 1 патента США US8106022 В2, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условие реакции конденсации включает температуру реакции 0-100°С и время реакции 0,1-24 часа и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, температуру реакции 10-40°С и время реакции 0,5-16 часов.

Учитывая структуру целевого соединения продукта, представленного Формулой (314), молярное отношение соединения, представленного Формулой (316), к соединению, представленному Формулой (320), следует определять на основе суммы n1 и n3 в Формуле (320). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, когда n1+n3=3, для того, чтобы реакция прошла полностью и при этом не осталось избытка какого-либо реагента, молярное отношение соединения, представленного Формулой (316), к соединению, представленному Формулой (320), может составлять от 3:1 до 3,5:1 и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения от 3,01:1 до 3,15:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой один или более из ацетонитрила, эпоксидного растворителя, простого эфирного растворителя, галогеналканового растворителя, диметилсульфоксида, N,N-диметилформамида и N,N-диизопропилэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпоксидный растворитель представляет собой диоксан и/или тетрагидрофуран. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения простой эфирный растворитель представляет собой простой диэтиловый эфир и/или простой трет-бутилметиловый эфир. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гало геналкано вый растворитель представляет собой один или более из дихлорметана, трихлорметана и 1,2-дихлорэтана. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения органический растворитель представляет собой дихлорметан. Количество органического растворителя может составлять 3-50 л/моль и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, 5-20 л/моль по отношению к соединению, представленному Формулой (320).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конденсирующий агент для реакции амидирования представляет собой один или более из гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония, 3-диэтоксифосфорилокси-1,2,3-бензотризин-4(3Н)-он (DEPBT), гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония или гидрохлорид 4-(4,6-диметокситриазин-2-ил)-4-метилморфолина или 1-гидроксибензотриазол и согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой смесь гексафторфосфата бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония с 1-гидроксибензотриазолом, где гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония и 1-гидроксибензотриазол применяют в эквимолярных количествах. Молярное отношение общего конденсирующего агента для амидной реакции к соединению, представленному Формулой (316), может составлять от 1:1 до 3:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 1,05:1 до 1,5:1.

Третичный амин может представлять собой N-метилморфолин, триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, N-метилморфолин. Молярное отношение третичного амина к соединению, представленному Формулой (316), может составлять от 2:1 до 10:1 и, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, от 2:1 до 5:1.

Аналогичным образом, соединение, представленное Формулой (314), может быть выделено из реакционной смеси с помощью любого подходящего способа выделения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, представленное Формулой (314), может быть выделено с помощью удаления растворителя путем выпаривания с последующей хроматографией, например, с применением следующих двух хроматографических условий для выделения: (1) очистка с обычной фазой силикагеля: силикагелевый наполнитель с 200-300 меш, градиентное элюирование дихлорметан: метанол = 100:5-100:7; и (2) очистка с обращенной фазой: наполнители с обращенной фазой Cis и Cs, градиентное элюирование метанол: ацетонитрил = 0,1:1-1:0,1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения растворитель может быть непосредственно удален с получением неочищенного продукта соединения, представленного Формулой (314), который может быть непосредственно использован в последующих реакциях.

Соединение, представленное Формулой (320), может быть доступно коммерчески или получено специалистами в данной области техники с помощью известных способов. Например, в случае если m1=m2=m3=3, n1=l, n3=2 и R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅ все представляют собой Н, соединение, представленное Формулой (320), может быть доступно коммерчески от Alfa Aesar Inc.

Конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению также можно применять в комбинации с другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые могут представлять собой один или более из различных составов или соединений, обычно применяемых в данной области техники. Подробная информация представлена в приведенном выше описании фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению.

Применение миРНК, фармацевтической композиции и конъюгата, содержащего миРНК, согласно настоящему изобретению

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ предотвращения и/или лечения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта, включающий введение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции, и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

Цель предотвращения и/или лечения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта может быть достигнута на основе механизма РНК-интерференции путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, миРНК согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Таким образом, миРНК и/или фармацевтическая композиция и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или лечения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта или для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта.

В настоящем документе термин «введение/вводить» относится к доставке миРНК и/или фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в организм субъекта с помощью способа или пути, который по меньшей мере частично локализует миРНК и/или фармацевтическую композицию и/или конъюгат миРНК согласно настоящему изобретению в целевом сайте для получения целевого эффекта. Подходящие пути введения для способов согласно настоящему изобретению включают местное введение и системное введение. Обычно местное введение приводит к доставке большего количества конъюгата миРНК в конкретный сайт по сравнению с системным кровообращением субъекта; тогда как системное введение приводит к доставке миРНК и/или фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в основной системный кровоток субъекта. Принимая во внимание, что настоящее изобретение предназначено для обеспечения средств для предотвращения и/или лечения тромботических заболеваний и/или ишемического инсульта, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применяется способ введения, способный доставлять лекарственное средство в печень.

Введение субъекту можно осуществлять с помощью любых подходящих путей, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный или парентеральный пути, такие как внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, трансдермальное введение, внутритрахеальное введение (аэрозоль), легочное введение, назальное введение, ректальное введение и местное введение (включая буккальное введение и подъязычное введение). Частота введения может составлять один или более раз в сутки, еженедельно, один раз в две недели, один раз в три недели, ежемесячно или ежегодно.

Используемая доза миРНК или фармацевтической композиции или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению может представлять собой обычную дозу в данной области техники, которая может быть определена в соответствии с различными параметрами, в частности, возрастом, массой и полом субъекта. Токсичность и эффективность могут быть определены в клеточных культурах или на экспериментальных животных с помощью стандартных фармацевтических процедур, например, путем определения LD50 (летальная доза, вызывающая гибель 50% популяции) и ED₅₀ (доза, которая может вызывать 50% от максимальной интенсивности ответа при количественном ответе и которая приводит к тому, что 50% экспериментальных субъектов имеют положительный ответ при качественном ответе). Диапазон доз для применения у человека может быть получен на основании данных, полученных из анализа клеточных культур и исследований на животных.

При введении миРНК, фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению, например, самцу или самке мышей C57BL/6N в возрасте от 6 до 12 недель и с массой тела от 18 до 25 г, в зависимости от количества миРНК: (i) для конъюгата миРНК, доза миРНК может составлять от 0,001 до 100 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,01 до 50 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,05 до 20 мг/кг массы тела, в дополнительных вариантах реализации от 0,1 до 15 мг/кг массы тела и в дополнительных вариантах реализации от 0,1 до 10 мг/кг массы тела; (ii) для фармацевтической композиции, образованной миРНК и фармацевтически приемлемым носителем, доза миРНК может составлять от 0,001 до 50 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, в некоторых вариантах реализации от 0,05 до 5 мг/кг массы тела, и в некоторых вариантах реализации от 0,1 до 3 мг/кг массы тела.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ ингибирования экспрессии гена FXI в гепатоцитах, включающий приведение эффективного количества миРНК и/или фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в контакт с гепатоцитами и введение миРНК и/или фармацевтической композиции и/или конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению в гепатоциты с целью ингибирования экспрессии гена FXI в гепатоцитах с помощью механизма РНК-интерференции. Гепатоциты могут быть выбраны из линий клеток гепатомы (таких как SMMC-7721, HepG2 и Huh7) или выделенных первичных клеток печени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гепатоциты представляют собой клетки гепатомы HepG2.

В случае если экспрессию гена FXI в клетке ингибируют с применением способа согласно настоящему изобретению, количество миРНК в модифицированной миРНК и/или фармацевтической композиции и/или конъюгате миРНК согласно настоящему изобретению, как правило, представляет собой такое количество, которое является достаточным для снижения экспрессии целевого гена и приводит к внеклеточной концентрации от 1 пМ до 1 мкМ или от 0,01 нМ до 100 нМ, или от 0,05 нМ до 50 нМ, или от 0,05 нМ до приблизительно 5 нМ на поверхности целевых клеток. Количество, требуемое для достижения этой локальной концентрации, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включая способ доставки, место доставки, количество клеточных слоев между местом доставки и целевыми клетками или тканями, путь доставки (местный или системный) и т.д. Концентрация в месте доставки может быть значительно выше, чем концентрация на поверхности целевых клеток или тканей.

Набор

Согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий эффективное количество по меньшей мере одного из модифицированной миРНК, фармацевтической композиции и конъюгата миРНК согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может обеспечивать модифицированную миРНК в контейнере. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может содержать контейнер, содержащий фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор может дополнительно содержать другие ингредиенты, такие как стабилизаторы или консерванты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент в другом контейнере, отличном от контейнера, для обеспечения модифицированной миРНК согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор может содержать инструкцию по смешиванию модифицированной миРНК с фармацевтически приемлемыми носителями и/или вспомогательными веществами или другими ингредиентами (если таковые имеются).

В наборе согласно настоящему изобретению модифицированная миРНК и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, а также модифицированная миРНК, фармацевтическая композиция, и/или конъюгат миРНК, и/или конъюгат, и/или фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество могут быть обеспечены в любой форме, например, в жидкой форме, сухой форме или лиофилизированной форме. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная миРНК и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество, а также фармацевтическая композиция и/или конъюгат и необязательное фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества) являются по существу чистыми и/или стерильными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в наборе согласно настоящему изобретению может содержаться стерильная вода.

Далее настоящее изобретение будет дополнительно описано далее с использованием примеров получения и экспериментальных примеров, но не ограничивается ими ни в каком отношении.

Примеры

Если не указано иное, агенты и культуральные среды, применяемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными, и все применяемые процедуры, такие как электрофорез нуклеиновых кислот и ПЦР в режиме реального времени, выполняют в соответствии со способами, описанными в Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Когда миРНК или конъюгат миРНК против гена FXI, синтезированный в настоящем изобретении, или миРНК или конъюгат миРНК в качестве отрицательного контроля использовали для трансфецирования клеток, в качестве трансфекционного реагента использовали L₁pofectamine™2000 (Invitrogen). Конкретные процедуры могут относиться к инструкции, предоставленной изготовителем.

Мыши C57BL/6N: в возрасте 6-8 недель, приобретенные у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., и далее именуемые мышами С57.

Еетерозиготные гуманизированные мыши: 6-8 недель, приобретенные у Cyagen Biosciences Inc.

Если не указано иное, все отношения реагентов, представленные ниже, рассчитаны как отношения по объему (об./об.).

Если не указано иное, все экспериментальные данные эффектов in vivo/in vitro выражены в виде X±SEM, и для анализа данных используют программное обеспечение для статистического анализа Graphpad Prism 5.0.

Пример получения 1: Получение конъюгата L10-siFXIf1M1S

В этом примере получения синтезировали конъюгат L10-siFXIf1M1S. Этот конъюгат представляет собой конъюгат миРНК, образованный путем конъюгирования конъюгирующей молекулы L-9 с миРНК № siFXIf1M1S. Последовательность миРНК, конъюгированной в этом конъюгате, представлена в Таблице 3.

(1-1) Синтез соединения L-10:

Соединение L-10 синтезировали в соответствии со следующим способом:

(1-1-1) Синтез концевого сегмента конъюгирующей молекулы GAL-5

(1-1-1a) Синтез GAL-2

100,0 г GAL-1 (гидрохлорида N-ацетил-О-галактозамина, №CAS 1772-03-8, приобретен у Ning Во hongxiang bio-chem Co., Ltd., 463,8 ммоль) растворяли в 1000 мл безводного пиридина, к которому добавляли 540 мл уксусного ангидрида (приобретен у Enox Inc., 5565,6 ммоль) на бане с ледяной водой для взаимодействия при перемешивании при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Полученный реакционный раствор выливали в 10 л ледяной воды и подвергали вакуумной фильтрации при пониженном давлении. Остаток промывали 2 л ледяной воды и затем добавляли смешанный растворитель ацетонитрил/толуол (отношение об./об. ацетонитрил: толуол = 1:1) до полного растворения. Растворитель выпаривали с получением 130,0 г продукта GAL-2 в виде белого твердого вещества.

(1-1-1b) Синтез GAL-3

GAL-2 (35,1 г, 90,0 ммоль), полученный на стадии (1-1-1 а), растворяли в 213 мл безводного 1,2-дихлорэтана, к которому добавляли 24,0 г TMSOTf (№ CAS 27607-77-8, приобретен у Macklin Inc., 108,0 ммоль) на бане с ледяной водой в атмосфере азота для взаимодействия при комнатной температуре в течение ночи.

400 мл дихлорметана добавляли к реакционному раствору для разбавления, фильтровали через диатомит, а затем добавляли 1 л насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и перемешивали до однородности. Выделяли органическую фазу. Оставшуюся водную фазу дважды экстрагировали, каждый раз с применением 300 мл дихлорэтана. Органические фазы объединяли и промывали с применением 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу выделяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия.

Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 26,9 г продукта GAL-3 в виде светло-желтого вязкого сиропа.

(1-1-1c) Синтез GAL-4

GAL-3 (26,9 г, 81,7 ммоль), полученный на стадии (1-1-1b), растворяли в 136 мл безводного 1,2-дихлорэтана, добавляли 30 г порошка сухого молекулярного сита 4А, а затем 9,0 г 5-гексен-1-ола (№ CAS 821-41-0, приобретен у Adamas-beta Inc., 89,9 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут.9,08 г TMSOTf (40,9 ммоль) добавляли на ледяной бане в атмосфере азота для взаимодействия при перемешивании при комнатной температуре в течение ночи. Порошок молекулярного сита 4А удаляли с помощью фильтрации. К фильтрату добавляли 300 мл дихлорэтана для разбавления, фильтровали через диатомит, а затем добавляли 500 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и перемешивали в течение 10 минут для промывки. Выделяли органическую фазу. Водную фазу экстрагировали один раз с применением 300 мл дихлорэтана. Органические фазы объединяли и промывали с применением 300 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 300 мл насыщенного рассола, соответственно. Органическую фазу выделяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия. Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 41,3 г продукта GAL-4 в виде желтого сиропа, который непосредственно использовали в следующей реакции окисления без очистки.

(1-1-1d) Синтез GAL-5

GAL-4 (14,9 г, 34,7 ммоль), полученный в соответствии со способом, описанным на стадии (1-1-1c), растворяли в смешанном растворителе из 77 мл дихлорметана и 77 мл ацетонитрила, добавляли 103 мл деионизированной воды и 29,7 г периодата натрия (№CAS 7790-28-5, приобретен у Aladdin Inc., 138,8 ммоль), соответственно, и перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут. Трихлорид рутения (№ CAS 14898-67-0, доступен у Energy Chemical, 238 мг, 1,145 ммоль) добавляли для взаимодействия при комнатной температуре в течение ночи. Полученный реакционный раствор разбавляли путем добавления 300 мл воды при перемешивании и доводили до рН приблизительно 7,5, добавляя насыщенный бикарбонат натрия. Органическую фазу выделяли и удаляли. Водную фазу трижды экстрагировали, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана, а органическую фазу удаляли. Водную фазу доводили до рН около 3 с применением сухого вещества лимонной кислоты, трижды экстрагировали, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана, и полученные органические фазы объединяли и высушивали с применением безводного сульфата натрия. Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 6,85 г продукта GAL-5 в виде белого пенистого твердого вещества. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 12,01 (br, 1Н), 7,83 (d, J=9,2 Гц, 1H), 5,21 (d, J=3,2 Гц, 1H), 4,96 (dd, J = 11,2, 3,2 Гц, 1Н), 4,49 (d, J=8,4 Гц, 1H), 4,07-3,95 (m, 3Н), 3,92-3,85 (m, 1H), 3,74-3,67 (m, 1H), 3,48-3,39 (m, 1H), 2,20 (t, J=6,8 Гц, 2Н), 2,11 (s, 3Н), 2,00 (s, 3Н), 1,90 (s, 3Н), 1,77 (s, 3Н), 1,55-1,45 (m, 4Н).

(1-1-2) Синтез L-8:

J-0 (9,886 г, 52,5 ммоль, приобретен у Alfa Aesar Inc.) и GAL-5 (72,819 г, 162,75 ммоль, полученный путем объединения нескольких партий продуктов), полученные на стадии (1-1-1), растворяли в 525 мл дихлорметана и добавляли диизопропилэтиламин (DIEA, 44,782 г, 346,50 ммоль), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат (РуВОР, 90,158 г, 173,25 ммоль) и гидроксибензотриазол (HOBt, 23,410 г, 173,25 ммоль) для взаимодействия при комнатной температуре в течение 4 часов. Полученный реакционный раствор промывали путем добавления 20 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 200 мл насыщенного рассола. Водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз с применением 100 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Затем растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали с применением колонки с силикагелем с обычной фазой (200-300 меш). В колонку вносили 10 масс. % триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали 1 масс. % триэтиламина и элюировали с помощью градиентного элюирования дихлорметан: метанол = 100:25-100:40. Элюат продукта собирали, и растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 38,8 г чистого продукта L-8. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,84 (d, J=9,0 Гц, 3Н), 7,27-7,23 (m, 1H), 7,13-7,18 (m, 1H), 5,22 (d, J=3,1 Гц, 3Н), 4,97 (dd, J = 11,3, 3,1 Гц, 3Н), 4,48 (d, J=8,4 Гц, 3Н), 4,09-3,98 (m, 9Н), 3,88 (dd, J = 19,3, 9,3 Гц, 3Н), 3,75-3,66 (m, 3Н), 3,44 -3,38 (m, 3Н), 3,17-3,30 (m, 4Н), 3,10-2,97 (m, 4Н), 2,35-2,20 (m, 6Н), 2,15-2,08 (m, 9Н), 2,07-1,98 (m, 13Н), 1,94-1,87 (m, 9Н), 1,81-1,74 (m, 9Н), 1,65-1,42 (m, 18Н). MS m/z: C₈₅H₁₁₉N₇O₃₀, [М+Н]⁺, вычислено: 1477,59, измерено: 1477,23.

(1-1-3) Синтез L-7

(1-1-3а) Синтез А-1

DMTrCl (хлорид 4,4' -диметокситритила, 101,65 г, 300 ммоль) растворяли в 1000 мл безводного пиридина и добавляли гидрат DL-глицерата кальция (28,63 г, 100 ммоль) для взаимодействия при 45°С в течение 20 часов. Полученный реакционный раствор фильтровали. Остаток промывали с применением 200 мл ДХМ, и фильтрат концентрировали до сухого состояния при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 500 мл дихлорметана и дважды промывали, каждый раз с применением 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина (рН=7-8). Водную фазу экстрагировали дважды, каждый раз с применением 200 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении, и остаток очищали с применением колонки с силикагелем с обычной фазой (200-300 меш). Колонку элюировали с помощью градиентного элюирования простой петролейный эфир: этилацетат: дихлорметан: метанол = 1:1:1:0,35-1:1:1:0,55. Элюат продукта собирали, и растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 600 мл дихлорметана и промывали один раз с применением 200 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу экстрагировали один раз с применением 200 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали досуха при пониженном давлении, и остаток подвергали пониженному давлению с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи с получением 50,7 г продукта А-1 в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,46 (ddd, J=6,5, 2,3, 1,1 Гц, 1H), 7,40-7,28 (m, 7Н), 6,89 -6,81 (m, 4Н), 4,84 (d, J=5,0 Гц, 1H), 4,36-4,24 (m, 1H), 4,29 (s, 6Н), 3,92 (dd, J = 12,4, 7,0 Гц, 1H), 3,67 (dd, J = 12,3, 7,0 Гц, 1H), 2,52 (q, J=6,3 Гц, 6Н), 1,03 (t, J=6,3 Гц, 9Н). MS m/z: С₂₄Н₂₃О₆, [N-Н]^-, вычислено: 407,15, измерено: 406,92.

(1-1-3b) Синтез L-7

L-8 (40 г, 27,09 ммоль, полученный путем объединения нескольких партий продуктов), полученный на стадии (1-1-2), и А-1 (41,418 г, 81,27 ммоль), полученный на стадии (1-1-3а), смешивали и растворяли в 271 мл дихлорметана, добавляли 3-диэтоксифосфорил-1,2,3-бензотризин-4 (3Н)-он (DEPBT) (24,318 г, 81,37 ммоль), а затем добавляли диизопропилэтиламин (21,007 г, 162,54 ммоль) для взаимодействия при перемешивании при 25°С в течение 1,5 часа. Органическую фазу промывали с применением 800 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали трижды, каждый раз с применением 50 мл дихлорметана. Органическую фазу промывали с применением 150 мл насыщенного рассола, водную фазу однократно экстрагировали с применением 50 мл дихлорметана, органические фазы объединяли, высушивали с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Растворитель выпаривали досуха при пониженном давлении, а остаток высушивали во вспененном состоянии с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке. Колонку заполняли 2 кг силикагеля с обычной фазой (200-300 меш), добавляли 200 мл триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали простым петролейным эфиром, содержащим 1 масс. % триэтиламина, и элюировали с помощью градиентного элюирования простой петролейный эфир: этилацетат: дихлорметан: N,N-диметилформамид = 1:1:0,6. Элюат продукта собирали, и растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 40,4 г чистого продукта L-7. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,90-7,78 (m, 4Н), 7,75-7,64 (m, 1H), 7,38-7,18 (m, 9Н), 6,91-6,83 (m, 4Н), 5,25-5,10 (m, 4Н), 4,97 (dd, J = 11,2, 3,2 Гц, 3Н), 4,48-4,30 (m, 4Н), 4,02 (s, 9Н), 3,93-3,84 (m, 3Н), 3,76-3,66 (m, 9Н), 3,45-3,35 (m, 3Н), 3,24-2,98 (m, 10Н), 2,30-2,20 (m, 2Н), 2,11-1,88 (m, 3Н), 1,80-1,40 (m, 28Н). MS m/z: C₉₀H₁₂₈N₇O₃₅, [M-DMTr]⁺, вычислено: 1564,65, измерено: 1564,88.

(1-1-4) Синтез L-9

L-7 (40 г, 21,4247 ммоль), полученный на стадии (1-1-3b), янтарный ангидрид (4,288 г, 42,8494 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 5,235 г, 42,8494 ммоль) смешивали и растворяли в 215 мл дихлорметана, затем добавляли диизопропилэтиламин (DIEA, 13,845 г, 107,1235 ммоль) и перемешивали при 25°С в течение 24 часов. Полученный реакционный раствор промывали с применением 800 мл 0,5 М фосфата триэтиламина. Водную фазу трижды экстрагировали, каждый раз с применением 5 мл дихлорметана. Органические фазы объединяли и выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт подвергали очистке на колонке. Колонку заполняли 1 кг силикагеля с обычной фазой (200-300 меш), добавляли 1 масс. % триэтиламина для нейтрализации кислотности силикагеля, уравновешивали дихлорметаном и элюировали с помощью градиентного элюирования 1 масс. триэтиламинсодержащего дихлорметан: метанол = 100:18-100:20. Элюат продукта собирали, и растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении с получением 31,0 г чистого продукта конъюгированной молекулы L-9. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 8,58 (d, J=4,2 Гц, 1H), 7,94 7,82 (m, 3Н), 7,41 7,29 (m, 5Н), 7,22 (d, J=8,1 Гц, 5Н), 6,89 (d, J=8,3 Гц, 4Н), 5,49-5,37 (m, 1H), 5,21 (d, J=3,0 Гц, 3Н), 4,97 (d, J = 11,1 Гц, 3Н), 4,49 (d, J=8,2 Гц, 3Н), 4,02 (s, 9Н), 3,88 (dd, J = 19,4, 9,4 Гц, 3Н), 3,77-3,65 (m, 9Н), 3,50-3,39 (m, 6Н), 3,11 2,90 (m, 5Н), 2,61-2,54 (m, 4Н), 2,47-2,41 (m, 2Н), 2,26-2,17 (m, 2Н), 2,15-1,95 (m, 22Н), 1,82-1,84 (m, 9Н), 1,80-1,70 (m, 1,35 1,35 (m, 1,35-1H), 1,35 (т), 1,31-4,16 (m, 4Н), 7,16 (t). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]⁺, вычислено: 1664,72, измерено: 1665,03.

(1-1-5) Синтез соединения L-10:

На этой стадии соединение L-10 получали путем соединения конъюгирующей молекулы L-9 с твердофазной подложкой.

Конъюгирующую молекулу L-9 (22,751 г, 11 ммоль), полученную на стадии (1-1-4), гексафторфосфат О-бензотриазолтетраметилурония (HBTU, 6,257 г, 16,5 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIEA, 2,843 г, 22 ммоль) смешивали и растворяли в 900 мл ацетонитрила и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут.К полученному реакционному раствору добавляли аминометиловую смолу (88 г, 100-200 меш, нагрузка аминогруппами: 400 мкмоль/г, приобретена у Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd.). Реакцию выполняли на шейкере при 25°С и скорости вращения 150 об./мин в течение 18 часов с последующей фильтрацией. Остаток промывали дважды (каждый раз с применением 300 мл ДХМ) затем три раза (каждый раз с применением 300 мл ацетонитрила) и высушивали с помощью вакуумного масляного насоса в течение 18 часов. Затем выполняли реакцию кэпирования путем добавления исходных материалов (СарА, СарВ, 4-диметиламинопиридина (DMAP) и ацетонитрила) в соответствии с отношением зарядов, представленным в Таблице 2. Реакцию выполняли на шейкере при 25°С и скорости вращения 150 об./мин в течение 5 часов. Реакционную жидкость фильтровали. Остаток трижды промывали, каждый раз с применением 300 мл ацетонитрила. Растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении, а остаток высушивали при пониженном давлении с помощью вакуумного масляного насоса в течение ночи с получением 102 г соединения L-10 (т.е. конъюгирующей молекулы L-9, связанной с твердофазной подложкой) с нагрузкой 90,8 мкмоль/г.

В приведенной выше таблице Сар А и Сар В представляют собой растворы кэпирующих агентов. Сар А представляет собой смешанный раствор 20% по объему N-метилимидазола в пиридине/ацетонитриле, причем объемное отношение пиридина к ацетонитрилу составляет 3:5. Сар В представляет собой 20% раствор по объему уксусного ангидрида в ацетонитриле.

(1-2) Синтез смысловой цепи конъюгата L10-siFXIf1M1S

Смысловую цепь Конъюгата миРНК 1 в Таблице 3 синтезировали путем соединения нуклеозидных мономеров одного за другим в направлении от 3' к 5' в соответствии с последовательностью расположения нуклеотидов в смысловой цепи с помощью способа твердофазного фосфоамидитного синтеза, циклы начинали с соединения L-10, полученного на вышеуказанной стадии. Соединение каждого нуклеозидного мономера включало четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления или сульфуризации. При этом, если два нуклеотида соединены за счет фосфоэфирной связи, четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления включали во время присоединения последующего нуклеозидного мономера; и если два нуклеотида соединены за счет фосфотиоатной связи, четырехступенчатую реакцию снятия защиты, связывания, кэпирования и сульфуризации включали во время присоединения последующего нуклеозидного мономера. Условия синтеза заданы следующим образом.

Нуклеозидные мономеры обеспечены в 0,1 М растворе ацетонитрила. Условие реакции снятия защиты является идентичным на каждой стадии, т.е. температура 25°С, время реакции 70 секунд, в качестве агента для снятия защиты применяют раствор дихлоруксусной кислоты в дихлорметане (3% об./об.) и молярное отношение дихлоруксусной кислоты к защитной группе 4,4'-диметокситритил на твердофазной подложке 5:1.

Условие реакции связывания является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к нуклеозидным мономерам 1:10, молярное отношение последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, к связывающему реагенту 1:65, время реакции 600 секунд и 0,5 М раствор 5-этилтио-1H-тетразола (ЕТТ) в ацетонитриле в качестве связывающего агента.

Условие для реакции кэпирования является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 15 секунд, в качестве раствора кэпирующего агента применяют смешанный раствор СарА и СарВ в молярном отношении 1:1 и молярное отношение кэпирующего агента к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой, составляет 1:1:1 (уксусный ангидрид: N-метилимидазол: последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с твердофазной подложкой).

Условие реакции окисления является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 15 секунд и 0,05 М раствор йода в воде в качестве окисляющего агента; и молярное отношение йода к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, 30:1. Реакцию проводят в смешанном растворителе тетрагидрофуран: вода:пиридин=3:1:1.

Условие для реакции сульфуризации является идентичным на каждой стадии, включая температуру 25°С, время реакции 300 секунд и ксантановый гидрид в качестве агента сульфуризации; и молярное отношение агента сульфуризации к последовательности нуклеиновой кислоты, соединенной с твердофазной подложкой на стадии связывания, 120:1. Реакцию проводят в смешанном растворителе ацетонитрил: пиридин = 1:1.

После завершения связывания последнего нуклеозидного мономера последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с твердофазной подложкой, отщепляли, снимали защиту, очищали, обессоливали и затем лиофилизировали с получением смысловой цепи, где:

Условия отщепления и удаления защитной группы являются следующими: добавление синтезированной нуклеотидной последовательности, соединенной с подложкой, в 25 масс. % водный раствор аммиака для взаимодействия при 55°С в течение 16 часов, при этом количество водного раствора аммиака составляет 0,5 мл/мкмоль. Жидкость удаляли с помощью фильтрации, и супернатант концентрировали до сухого состояния в вакууме.

Условия очистки и обессоливания были следующими: очистку нуклеиновой кислоты осуществляли с помощью колонки для препаративной ионной хроматографии (Source 15Q) с градиентным элюированием NaCl. В частности, элюент А: 20 мМ фосфат натрия (рН=8,1), растворитель: вода/ацетонитрил=9:1 (об./об.); элюент В:1,5 М хлорид натрия, 20 мМ фосфат натрия (рН=8,1), растворитель: вода/ацетонитрил=9:1 (об./об.); градиент элюирования: соотношение элюент А: элюент В = 100:0-50:50. Элюат продукта собирали, объединяли и обессоливали, используя колонку для хроматографии с обращенной фазой. Конкретное условие включает: применение колонки с сефадексом для обессоливания с сефадексом-025 в качестве наполнителя и элюирование деионизированной водой.

Способ обнаружения заключается в следующем: чистоту вышеупомянутой смысловой цепи определяли методом ионообменной хроматографии (ИХ-ВЭЖХ); и молекулярную массу анализировали методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), причем расчетное значение составляло 7584,5, а измеренное значение составляло 7584,0. Тот факт, что измеренное значение соответствовало вычисленному значению, свидетельствует о том, что была синтезирована смысловая цепь SS, 3'-концевая часть которой конъюгирована с конъюгирующей молекулой L-9..

(1-3) Синтез антисмысловой цепи конъюгата L10-siFXIf1M1S

Антисмысловую цепь конъюгата ЫО-siFXIf1M1S синтезировали методом твердофазного фосфоамидитного синтеза, начиная циклы с универсальной твердофазной подложки (загруженные UnyL₁nker™ твердые подложки NittoPhase^®HL, Kinovate L₁fe Sciences Inc.). Условия реакции снятия защиты, связывания, кэпирования, окисления или сульфуризации, отщепления и снятия защиты, а также очистки и обессоливания в способе твердофазного синтеза были такими же, как и те, которые применяли для синтеза смысловой цепи. Антисмысловую цепь AS получали лиофилизацией.

Чистоту антисмысловой цепи определяли с помощью ионообменной хроматографии (ИХ-ВЭЖХ); и молекулярную массу антисмысловой цепи анализировали методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Тот факт, что измеренное значение соответствовало вычисленному значению, указывает на то, что была синтезирована антисмысловая цепь AS, имеющая целевую последовательность.

(1-4) Синтез конъюгата L10-siFXIf1M1S

Для конъюгата ЫО-siFXIf1M1S смысловую цепь и антисмысловую цепь, соответственно, растворяли в воде для инъекций с получением раствора 40 мг/мл. Их смешивали в эквимолярном отношении, нагревали при 50°С в течение 15 минут, охлаждали при комнатной температуре с образованием двухцепочечной структуры и затем лиофилизировали с получением лиофилизированного порошка. После того, как конъюгат разбавляли до концентрации 0,2 мг/мл ультрачистой водой (прибор для чистой воды Milli-Q, с удельным сопротивлением 18,2 МОм *см (25°С)), молекулярную массу определяли с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) (приобретен у Waters Corp., модель: LCT Premier). Тот факт, что измеренное значение соответствовало вычисленному значению, указывает на то, что синтезированный конъюгат миРНК представлял собой разработанную целевую двух цепочечную последовательность нуклеиновой кислоты с конъюгирующей молекулой L-9. Конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (403). МиРНК имеет последовательность, соответствующую конъюгату L10-siFXIf1M1S, как показано в Таблице 3.

где С, G, U, А и Т обозначают состав оснований нуклеотидов; буква m обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы т, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; f обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы f, представляет собой модифицированный фтором нуклеотид; s обозначает, что два нуклеотида по обеим сторонам от буквы s соединены тиофосфотиоатной связью; и Р обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид.

Примеры получения 2-10: Синтез конъюгатов миРНК согласно настоящему изобретению

Конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению: Конъюгаты L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIh1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP, L10-siFXIi1M1S и L10-siFXIi1M1SP (которые имели последовательности, соответствующие siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIg1M1SP, siFXIh1M1SP, siFXImlS и siFXIiMISP, как показано в Таблице 3, соответственно) были дополнительно синтезированы, соответственно, теми же способами, что и в Примере 1, за исключением того, что (1) последовательности смысловой цепи и антисмысловой цепи L₁F1M1S, siFXIb1M1S и siFXmilSP представляли собой последовательности смысловой цепи и антисмысловой цепи как показано в Таблице 3; и (2) в случае конъюгатов L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP и L10-siFXIi1M1SP первый нуклеотид с 5'-конца из антисмысловых цепей представлят собой 5'-фосфатный нуклеотид; соответственно, в ходе получения последовательностей антисмысловых цепей способом твердофазного фосфоамидитного синтеза, после связывания последнего нуклеозидного мономера, мономер Формулы (CPR-I) (полученный от Suzhou GenePharma Inc., Cat#13-2601-XX) связывали с 5'-концом антисмысловой цепи по четырехступенчатой реакции снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления с образованием 5'-фосфатного нуклеотида.

(CPR-I)

Во время связывания применяли условия снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления, аналогичные тем, которые применяли при синтезе смысловой цепи. После полного связывания последовательность дополнительно расщепляли, снимали защиту, очищали, обессоливали и, наконец, лиофилизировали с получением антисмысловой цепи AS.

После получения конъюгатов, их молекулярные массы определяли тем же способом, как и в Примере получения 1, соответственно. Результаты показали, что измеренные значения соответствовали вычисленным значениям, что свидетельствует о том, что синтезированные конъюгаты миРНК представляли собой разработанные целевые двухцепочечные последовательности нуклеиновой кислоты с молекулой конъюгации L-9 и имели структуру, представленную Формулой (403). МиРНК, содержащиеся в этих конъюгатах, имеют последовательности, соответствующие конъюгатам L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP, L10-siFXIi1M1S или L10-siFXIi1M1SP, как показано в Таблице 3.

Примеры получения 11-20: Синтез миРНК согласно настоящему изобретению

Последовательности миРНК, перечисленные в Таблице 4, синтезировали с помощью способа твердофазного синтеза, соответственно, и определяли их молекулярные массы. Смысловые цепи и антисмысловые цепи, которые присутствовали в равновесном соотношении и комплементарны друг другу, как показано в Таблице 4, растворяли в воде DEPC, а затем подвергали ренатурации с получением миРНК согласно настоящему изобретению: siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP, siFXIf1M1SP, siFXIg1M1SP, siFXIhIMISP, siFXIi1M1SP и siFXIe1, как показано в Таблице 4.

Во время получения последовательности siFXIe1 целевая последовательность содержит немодифицированный нуклеотид. В этом случае, в условиях расщепления и снятия защиты, после обработки водным раствором аммиака, продукт растворяли в 0,4 мл/мкмоль N-метилпирролидона с последующим добавлением 0,3 мл/мкмоль триэтиламина и 0,6 мл/мкмоль тригидрофторида триэтиламина, в расчете на количество одноцепочечной нуклеиновой кислоты, что приводило к удалению защитной группы 2'-TBDMS на рибозе.

Кроме того, в случае, когда первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи в целевой последовательности представлял собой 5' -фосфатный нуклеотид, во время получения антисмысловой цепи в соответствии со способом твердофазного фосфорамидитного синтеза, после связывания последнего нуклеозидного мономера в антисмысловой цепи, мономер Формулы (CPR-I) (приобретен у Suzhou GenePharma Inc. номер по каталогу 13-2601-ХХ) соединяли с 5'-концом антисмысловой цепи с помощью четырехступенчатой реакции снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления с образованием 5' -фосфатного нуклеотида. (CPR-I)

Во время связывания применяли условия снятия защиты, связывания, кэпирования и окисления, аналогичные тем, которые применяли при синтезе смысловой цепи. После полного связывания последовательность дополнительно расщепляли, снимали защиту, очищали, обессоливали и, наконец, лиофилизировали с получением антисмысловой цепи AS.

Сравнительный Пример получения 1: Синтез миРНК сравнения

Смысловую цепь и антисмысловую цепь миРНК, пронумерованные как NC в Таблице 4, синтезировали с помощью способа твердофазного синтеза, соответственно, и определяли их молекулярные массы. Смысловую цепь и антисмысловую цепь, которые присутствовали в равновесном соотношении, растворяли в воде DEPC, а затем подвергали ренатурации с получением миРНК сравнения, пронумерованной как NC.

где С, G, U, А и Т обозначают состав оснований нуклеотидов; буква m обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы т, представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; f обозначает, что нуклеотид, стоящий слева от буквы f, представляет собой модифицированный фтором нуклеотид; s обозначает, что два нуклеотида по обеим сторонам от буквы s соединены тиофосфотиоатной связью; и Р обозначает, что нуклеотид, примыкающий к правой стороне Р, представляет собой 5'-фосфатный нуклеотид.

После того, как вышеуказанные миРНК или конъюгаты согласно настоящему изобретению были полностью получены, их лиофилизировали в твердый порошок и хранили до применения. При использовании их можно восстанавливать водой для инъекций, физиологическим раствором (NS), фосфатным буфером (РВ) или фосфатным солевым буфером (PBS) до раствора с требуемой концентрацией.

Экспериментальный пример 1: Ингибирующая активность in vitro миРНК согласно настоящему изобретению

Клетки НЕК293А (приобретенные у Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD) культивировали в полной среде DMEM (компания Hyclone), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, компания Hyclone), и 0,2% (об./об./об.) пенициллина-стрептомицина (Gibco, компания mvitrogen), при 37°С в инкубаторе, содержащем 5% CO₂/95% воздуха.

В соответствии со способом, описанным Kumico Ui-Tei et. al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151, плазмиды для определения конструировали и совместно трансфецировали с миРНК (siFXIe1), подлежащей определению, в клетки НЕК293А; и уровни экспрессии двойного репортерного гена люциферазы отражают активность миРНК в отношении мишени и нецелевой эффект миРНК. Конкретные стадии описаны далее:

[1] Конструирование плазмиды для определения

Плазмиду для обнаружения конструировали с использованием плазмиды psiCHECK™-2 (Promega™). Эта плазмида содержит целевая последовательность, то есть целевая последовательность миРНК. МиРНК, подлежащие обнаружению, имеют целевую последовательность, показанную ниже. В частности, siFXIe1 (полученный из примера получения 20) имеет следующую целевую последовательность:

GAATCTCAAAGAAATCTT (SEQ ID NO: 565).

Целевую последовательность встраивали в сайт Xho Г/Not I плазмиды psiCHECK™-2. [2] Трансфецирование

Клетки НЕК293А инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 8×10³ клеток/лунку. Через 16 часов плотность роста клеток достигла 70-80%. При этом полные среды H-DMEM в культуральных лунках аспирировали. В каждую лунку добавляли 80 мкл среды Opti-MEM (компания GIBCO) и дополнительно культивировали в течение 1,5 ч.

Вышеуказанную плазмиду для обнаружения разбавляли водой, обработанной DEPC, с получением 200 нг/мкл рабочего раствора с плазмидой для обнаружения; siFXIe1 получали с водой, обработанной DEPC, в рабочие растворы миРНК в концентрациях 10 нМ и 3 нМ (на основе количества миРНК), соответственно.

Готовили раствор 1А1. Каждая порция раствора 1А1 содержит 1 мкл рабочего раствора миРНК с концентрацией 10 нМ, 0,05 мкл рабочего раствора с плазмидой для детектирования (содержащей 10 нг плазмиды для детектирования) и 10 мкл среды Opti-MEM.

Готовили раствор 1А2. Каждая порция раствора 1А2 содержит 1 мкл рабочего раствора миРНК с концентрацией 3 нМ, 0,05 мкл рабочего раствора с плазмидой для детектирования (содержащей 10 нг плазмиды для детектирования) и 10 мкл среды Opti-MEM.

Готовили раствор 1 В. Каждая порция раствора 1 В содержит 0,2 мкл L₁pofectamine™ 2000 и 10 мкл среды Opti-MEM.

Готовили раствор 1С.Каждая порция раствора 1С содержит 0,05 мкл рабочего раствора с плазмидой для детектирования (содержащей 10 нг плазмиды для детектирования) и 10 мкл среды Opti-MEM

Одну порцию раствора 1 В смешивали с одной порцией раствора 1А1 или с одной порцией раствора 1А2, соответственно. Смешанный раствор инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием трансфекционных комплексов 1X1 и 1X2. Одну порцию раствора 1 В смешивали с одной порцией раствора 1С, и смешанный раствор инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре с образованием трансфекционного комплекса 1X3.

Трансфекционный комплекс 1X1 добавляли в количестве 20 мкл/лунку в три культуральные лунки, соответственно, и затем равномерно перемешивали с получением смеси для совместной трансфекции при конечной концентрации миРНК 0,1 нМ (записанной как тестовая группа 1).

Трансфекц ионный комплекс 1X2 добавляли в количестве 20 мкл/лунку к трем дополнительным культуральным лункам, соответственно, и затем равномерно перемешивали с получением смеси для совместной трансфекции при конечной концентрации миРНК 0,03 нМ (записанной как тестовая группа 2).

Трансфекц ионный комплекс 1X3 добавляли в количестве 20 мкл/лунку к трем дополнительным культуральным лункам, соответственно, для получения трансфекционной смеси без миРНК (записанной как контрольная группа).

После того, как смеси для совместной трансфекции, содержащие миРНК, и смесь для трансфекции без миРНК были совместно трансфицированы в культуральных лунках в течение 4 часов, каждую лунку дополняли 100 мкл полной среды H-DMEM, содержащей 20% FBS. 96-луночный планшет помещали в СО₂ инкубатор и дополнительно культивировали в течение 24 часов.

[3] Определение

Среды в культуральных лунках аспирировали. 150 мкл смешанного раствора реагента Dual-Glo^® Luciferase и H-DMEM (в объемном отношении 1:1) добавляли в каждую лунку и тщательно перемешивали. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре 120 мкл смешанного раствора переносили в 96-луночный планшет для ИФА. Значение хемилюминесценции Firefly (Fir) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью многомодового планшет-ридера Synergy II (компания BioTek). Затем в каждую лунку планшета для ИФА добавляли 60 мкл реагента Dual-Glo^® Stop & Glo^® и тщательно перемешивали. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут значение хемилюминесценции Renilla (REN) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов в соответствии с процедурой считывания FIR.

Вычисляли коэффициент люминесценции (Ratio=REN/FIR) каждой лунки, а коэффициент люминесценции ((Ratio (test) или Ratio (control)) каждой тестовой группы или контрольной группы был средним значением коэффициентов трех лунок для культивирования. Используя отношение люминесценции контрольной группы в качестве эталонного значения, отношение люминесценции каждой тестируемой группы нормализовали для получения отношения R отношения (тест)/отношения (контроль), которое представляет собой уровень экспрессии, т.е. остаточную активность, репортер но го гена Renilla. Скорость ингибирования миРНК составляла (1-R) х 100%.

Результаты ингибирования активности siFXIe1 при различных концентрациях относительно целевой последовательности представлены в Таблице 5.

Сравнительный экспериментальный пример 1: Ингибирующая активность in vitro сравнительного NC миРНК

Ингибирующую активность сравнительного NC миРНК в системе psiCHECK исследовали с помощью того же способа, как описано в экспериментальном примере 1, за исключением того, что тестируемую миРНК заменяли сравнительным NC миРНК. Результаты приведены в Таблице 5.

Результаты показали, что siFXIe1 продемонстрировал хорошую зависимую от концентрации ингибирующую активность in vitro против целевой последовательности при соответствующей концентрации. В частности, скорость ингибирования siFXIe1 против целевой последовательности при концентрации миРНК 0,1 нМ составляла 72,43%, демонстрируя хороший эффект ингибирования экспрессии гена FXI.

Экспериментальный пример 2: Измерение IC₅₀ последовательностей миРНК против мРНК FXI в системе psiCHECK

В этом экспериментальном примере изучали значения IC₅₀ siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP и siFXIi1M1SP в системе psiCHECK in vitro.

В соответствии со способом, описанным Kumico Ui-Tei et. al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect Nucleic Acids Research,2008.36 (7), 2136-2151, плазмиды для определения конструировали и совместно трансфецировали с миРНК (siFXIe1), подлежащей определению, в клетки НЕК293А; и уровни экспрессии двойного репортерного гена люциферазы отражают активность миРНК в отношении мишени и нецелевой эффект миРНК. Конкретные стадии описаны далее:

[1] Конструирование плазмиды для определения

Плазмиду для обнаружения конструировали с использованием плазмиды psiCHECK™-2 (Promega™). Эта плазмида содержит целевую последовательность, которая была такой, как показано под номером доступа в Genbank NM 000128.3.

Целевую последовательность встраивали в сайт Xho I/Not I плазмиды psiCHECKTM-2. [2] Культура клеток и трансфекция

Клетки HepG2 (приобретенные у GuangZhou Jennio Biotech Co., Ltd) культивировали в полной среде DMEM (компания Hyclone), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, компания Hyclone), и 0,2% (об./об./об.) пенициллина-стрептомицина (Gibco, компания mvitrogen), при 37°С в инкубаторе, содержащем 5% СО₂/95% воздуха.

Клетки HepG2 инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 8×10³ клеток/лунку. Через 16 часов плотность роста клеток достигла 70-80%. При этом полные среды H-DMEM в культуральных лунках аспирировали. В каждую лунку добавляли 80 мкл среды Opti-MEM (компания GIBCO) и дополнительно культивировали в течение 1,5 ч.

Вышеуказанную плазмиду для обнаружения разбавляли водой, обработанной DEPC, с получением 200 нг/мкл рабочего раствора с плазмидой для обнаружения; каждую из следующих миРНК получали с помощью воды, обработанной DEPC, в рабочие растворы миРНК в 10 различных концентрациях 100 нМ, 33,3 нМ, 11,1 нМ, 3,70 нМ, 1,23 нМ, 4,12 нМ, 0,137 нМ, 0,0457 нМ, 0,0152 нМ и 0,00508 нМ, соответственно. Используемые миРНК представляют собой siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP, siFXId1M1SP, siFXIe1M1SP и siFXh1M1SP, соответственно.

Для каждой миРНК готовили растворы от 2А1 до 2А10, соответственно. Каждая порция растворов от 2А1 до 2А10 содержит 1 мкл каждого из рабочих растворов миРНК в указанных выше 10 концентрациях, 0,05 мкл рабочего раствора с плазмидой для детектирования (содержащей 10 нг плазмиды для детектирования) и 10 мкл среды Opti-MEM.

Одну порцию раствора 1 В смешивали с одной порцией полученных растворов 2А1-2А10 для каждой миРНК, соответственно. Смешанный раствор инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре с образованием трансфекционных комплексов от 2X1 до 2X10 для каждой миРНК.

Трансфекционные комплексы от 2X1 до 2X10 для каждой миРНК добавляли в количестве 20 мкл/лунку в культуральные лунки, соответственно, и затем равномерно перемешивали с получением трансфекционных комплексов в конечных концентрациях около 1 нМ, 0,333 нМ, 0,111 нМ, 0,0370 нМ, 0,0123 нМ, 0,00412 нМ, 0,00137 нМ, 0,000457 нМ, 0,000152 нМ и 0,0000508 нМ для каждой миРНК. Трансфекционные комплексы 2x1-2x10 для каждой миРНК трансфицировали соответственно в трех культуральных клетках с получением смесей для совместной трансфекции, содержащих миРНК (записанных как тестовые группы).

Трансфекц ионный комплекс 1X3 добавляли в количестве 20 мкл/лунку к трем дополнительным культуральным лункам, соответственно, для получения смеси для котрансфекции без миРНК (записанной как контрольная группа).

После того, как смеси для совместной трансфекции, содержащие миРНК, и смесь для совместной трансфекции, не содержащая миРНК, трансфицировали в культуральных лунках в течение 4 часов, каждую лунку дополняли 100 мкл полной среды H-DMEM, содержащей 20% FBS. 96-луночный планшет помещали в СО₂ инкубатор и дополнительно культивировали в течение 24 часов.

[3] Определение

Среды в культуральных лунках аспирировали. 150 мкл смешанного раствора реагента Dual-Glo^® Luciferase и H-DMEM (в объемном отношении 1:1) добавляли в каждую лунку и тщательно перемешивали. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре 120 мкл смешанного раствора переносили в 96-луночный планшет для ИФА. Значение хемилюминесценции Firefly (Fir) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью многомодового планшет-ридера Synergy II (компания BioTek). Затем в каждую лунку планшета для ИФА добавляли 60 мкл реагента Dual-Glo^® Stop & Glo^® и тщательно перемешивали. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут значение хемилюминесценции Renilla (REN) в каждой лунке планшета для ИФА считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов в соответствии с процедурой считывания FIR.

Вычисляли коэффициент люминесценции (Ratio=REN/FIR) каждой лунки, а коэффициент люминесценции ((Ratio (test) или Ratio (control)) каждой тестовой группы или контрольной группы был средним значением коэффициентов трех лунок для культивирования. Используя отношение люминесценции контрольной группы в качестве эталонного значения, отношение люминесценции каждой тестируемой группы нормализовали для получения отношения R отношения (тест)/отношения (контроль), которое представляет собой уровень экспрессии, т.е. остаточную активность, репортерного гена Renilla. Скорость ингибирования миРНК составляла (1-R) х 100%.

Кривые зависимости ответа от дозы аппроксимировали, используя функцию 1о§(ингибитор) в зависимости от ответа - переменный наклон программного обеспечения Graphpad 5.0. Значения IC₅₀ миРНК, нацеленной на GSCM, вычисляли на основании кривой зависимости ответа от дозы. В частности, установленные кривые зависимости ответа от дозы соответствовали приведенной ниже формуле:

,

в которой:

Y - отношение R, т.е. остаточная активность,

X представляет собой логарифм концентрации трансфецированных миРНК,

Bot представляет собой значение Y в нижней части стационарной стадии,

Тор представляет собой значение Y в верхней части стационарной стадии,

X' представляет собой значение X, полученное путем подгонки, при котором Y представляет собой медианное значение между низом и верхом, a HillSlope представляет собой наклон кривой путем подгонки на X'.

Когда Y=50%, соответствующее значение Х50 определяли на основании кривой зависимости ответа от дозы и соответствующей формулы расчета. Было рассчитано, что значение IC₅₀ каждой миРНК составляет 10^Х₅₀.

Конкретные значения IC₅₀ обобщены в таблице 6.

Как следует из результатов Таблицы 6 выше, миРНК согласно настоящему изобретению проявляют очень высокую ингибирующую активность в отношении целевой последовательности 1 in vitro в клетках HepG2, причем значение IC₅₀ находится в диапазоне от 0,013 до ОД 19 нМ.

Экспериментальный пример 3: Измерение IC₅₀ миРНК против мРНК FXI в клетках HepG2

Клетки HepG2 инокулировали в 24-луночный планшет в количестве 7×10⁴ клеток/лунку. Через 16 часов плотность роста клеток достигла 70-80%. При этом полные среды H-DMEM в культуральных лунках аспирировали. В каждую лунку добавляли 500 мкл среды Opti-MEM (компания GIBCO) и дополнительно культивировали в течение 1,5 ч.

Каждая из следующих миРНК была получена с DEPC -обработанной водой в рабочие растворы миРНК в 7 различных концентрациях 20 мкМ, 6,67 мкМ, 2,22 мкМ, 0,741 мкМ, 0,247 мкМ, 0,0823 мкМ и 0,0274 мкМ, соответственно. Используемые миРНК представляют собой siFXIa1M1SP, siFXIb1M1SP, siFXIc1M1SP или siFXId1M1SP, соответственно.

Для каждой миРНК были получены растворы от 3А1 до 3А7, соответственно. Каждая порция растворов 3А1-3А7 содержит, в свою очередь, 3 мкл каждого из рабочих растворов миРНК в указанных выше 7 концентрациях и 50 мкл среды Opti-MEM.

Готовили раствор 3В. Каждая порция раствора 3В содержит 1 мкл L₁pofectamine™2000 и 50 мкл среды Opti-MEM.

Одну порцию раствора 3В смешивали с одной порцией полученных растворов 3А1-3А7 для каждой миРНК, соответственно. Смешанный раствор инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре с образованием трансфекционных комплексов от 3X1 до 3X7 для каждой миРНК.

Одну порцию раствора 3В смешивали с 50 мкл среды Opti-MEM. Смешанный раствор инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием трансфекционного комплекса 3X8.

Трансфекц ионные комплексы от 3X1 до 3×7 для каждой миРНК добавляли в количестве 100 мкл/лунку в культуральные лунки, соответственно, и затем равномерно перемешивали с получением трансфекционных смесей в конечных концентрациях около 100 нМ, 33,3 нМ, 11,1 нМ, 3,70 нМ, 1,23 нМ, 0,412 нМ и 0,137 нМ для каждой миРНК. Трансфекц ионные комплексы от 3X1 до 3X7 для каждой миРНК трансфицировали соответственно в трех культуральных клетках с получением трансфекционных смесей, содержащих миРНК (записанных как тестовые группы).

Трансфекц ионный комплекс 3X8 добавляли в количестве 100 мкл/лунку к трем дополнительным культуральным лункам, соответственно, для получения трансфекционной смеси без миРНК (записанной как контрольная группа).

После того, как трансфекционные смеси, содержащие миРНК, и трансфекционную смесь, не содержащую миРНК, трансфицировали в культуральных лунках в течение 4 часов, каждую лунку дополняли 1 мл полной среды H-DMEM, содержащей 20% FBS. 24-луночный планшет помещали в СО₂ инкубатор и дополнительно культивировали в течение 24 часов.

Для клеток каждой лунки брали 1 мкг общей РНК и реагент, предоставленный в наборе для синтеза кДНК Goldenstar™ RT6 (приобретен у Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd., кат.№TSK301M), в котором в качестве праймера был выбран Goldenstar™ Oligo (dT)i7. 20 мкл реакционной системы обратной транскрипции получали в соответствии с процедурами обратной транскрипции в инструкциях набора для обратной транскрипции общей РНК клеток в каждой лунке. Условия обратной транскрипции были следующими: каждую реакционную систему обратной транскрипции помещали и инкубировали при 50°С в течение 50 минут, затем инкубировали при 85°С в течение 5 минут и, наконец, инкубировали при 4°С в течение 30 секунд; после завершения реакции 80 мкл воды DEPC добавляли к каждой реакционной системе обратной транскрипции с получением кДНК-содержащего раствора.

Для каждой системы реакции обратной транскрипции в качестве матрицы брали 5 мкл вышеупомянутого раствора, содержащего кДНК, и реагент, представленный в наборе NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus (приобретенный у Novoprotein Scientific Co., Ltd., кат. № E096-01B) использовали для получения 20 мкл реакционной системы кПЦР, где последовательности праймеров ПЦР, используемых для амплификации целевого гена FXI и внутреннего эталонного гена GAPDH, были такими, как показано в Таблице 7, и конечная концентрация каждого праймера составляла 0,25 мкМ. Каждую реакционную систему кПЦР помещали на прибор для ПЦР в реальном времени ABI StepOnePlus и амплифицировали с использованием трехэтапного метода. Процедуры амплификации включали предварительную денатурацию при 95°С в течение 10 минут с последующей денатурацией при 95°С в течение 30 с и ренатурацией при 60°С в течение 30 с и продлением при 72°С в течение 30 с. После повторения вышеупомянутого процесса денатурации, ренатурации и удлинения 40 раз был получен продукт W, содержащий амплифицированный целевой ген FXI и внутренний референсный ген GAPDH. Затем продукт W инкубировали при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин и 95°С в течение 15 с. Кривые плавления целевого гена FXI и внутреннего эталонного гена GAPDH в продукте W были собраны соответственно с использованием флуоресцентного прибора для кПЦР в реальном времени, и были получены значения Ct целевого гена FXI и внутреннего эталонного гена GAPDH.

Относительные уровни экспрессии целевого гена FXI в каждой из тестовых групп и контрольной группе количественно рассчитывали методом сравнения Ct (ΔΔCt). Метод расчета был описан следующим образом:

ΔCt (тестовая группа)=Ct (целевой ген в тестовой группе) - Ct (внутренний референсный ген в тестовой группе)

ΔCt (контрольная группа)=Ct (целевой ген в контрольной группе) - Ct (внутренний референсный ген в контрольной группе)

ΔCt (тестовая группа)=ΔCt (тестовая группа) - ΔCt (среднее значение в контрольной группе)

ΔCt (контрольная группа)=ΔCt (контрольная группа) - ΔCt (среднее значение в контрольной группе)

где ΔCt (среднее значение в контрольной группе) представляет собой среднее арифметическое значение ΔCt (контрольная группа) каждой из трех культуральных лунок в контрольной группе. Таким образом, каждая культуральная лунка в тестовой группе или контрольной группе соответствует одному значению ΔΔCt.

Уровни экспрессии мРНК FXI в испытываемых группах нормализовали на основании уровня экспрессии в контрольной группе, при этом уровень экспрессии мРНК FXI в контрольной группе определяли как 100%;

Относительный уровень экспрессии мРНК FXI в испытываемой группе=2-ΔΔCt (испытываемая группа) × 100%.

Для миРНК в той же тестируемой группе среднее значение относительных уровней экспрессии мРНК FXI в тестируемой группе при каждой концентрации представляло собой среднее арифметическое значение относительных уровней экспрессии трех культуральных лунок при этой концентрации.

Кривые зависимости ответа от дозы аппроксимировали, используя функцию log (ингибитор) в зависимости от ответа - переменный наклон программного обеспечения Graphpad 5.0. Значения IC₅₀ каждой миРНК против мРНК FXI вычисляли на основании кривой зависимости ответа от дозы. В частности, кривые зависимости ответа от дозы, полученные с помощью аппроксимации, соответствовали следующей формуле:

,

в которой:

Y представляет собой относительный уровень экспрессии мРНК FXI в каждой тестируемой группе,

X представляет собой логарифм конечной концентрации миРНК, используемой в соответствующей тестовой группе,

Bot представляет собой значение Y в нижней части стационарной стадии,

Тор представляет собой значение Y в верхней части стационарной стадии,

X' представляет собой значение X, полученное путем подгонки, при котором Y представляет собой медианное значение между минимальным и максимальным значениями, a HillSlope представляет собой наклон кривой, полученный путем подгонки на Х'.

Когда Y=50%, соответствующее значение Х50 определяли на основании кривой зависимости ответа от дозы и соответствующей формулы расчета. Было рассчитано, что значение IC₅₀ каждой миРНК составляет 10^Х₅₀ (нМ).

Значения IC₅₀ каждой миРНК против мРНК FXI обобщены в Таблице 8.

Как следует из Таблицы 8, миРНК согласно настоящему изобретению проявляют очень высокую ингибирующую активность в отношении мРНК FXI in vitro в клеточных линиях HepG2, при этом значение IC₅₀ находится в диапазоне от 1,49 до 11,1 нМ.

Экспериментальный пример 4: Измерение IC₅₀ миРНК против мРНК FXI в первичных гепатоцитах мыши

Первичные гепатоциты мыши экстрагировали из свежих тканей печени нормальных мышей C57BL/6N. Гепатоциты соответствующей плотности инокулировали в стеклянную, пластиковую или тканевую чашу с покрытием из коллагена типа I, культивировали в среде RPMI 1460, содержащей 1хдвойное антитело и 10% FBS, и дополнительно культивировали в инкубаторе, содержащем 5% СО₂/95% воздуха, при 37°С в течение 30 минут.

Ингибирующую активность и значение IC₅₀ миРНК против мРНК FXI измеряли с помощью тех же способов, как описано в экспериментальном Примере 3, за исключением того, что миРНК, подлежащая обнаружению, представляла собой siFXIf1M1SP; использованные клетки представляли собой мышиные первичные гепатоциты; и конечные концентрации миРНК включали в себя в общей сложности 8 концентраций (100 нМ, 25 нМ, 6,25 нМ, 1,56 нМ, 0,391 нМ, 0,098 нМ, 0,0244 нМ и 6,1хЮ"3 нМ), соответственно. Результаты приведены в Таблице 9.

Как следует из Таблицы 9, siFXIf1M1SP проявлял очень высокую ингибирующую активность в отношении мРНК FXI in vitro в первичных гепатоцитах мышей причем значение IC₅₀ составляло 0,021 нМ.

Экспериментальный Пример 5: Измерение эффективности ингибирования миРНК в отношении уровней экспрессии мРНК FXI в клетках HepG2

Скорости ингибирования миРНК против уровней экспрессии мРНК FXI измеряли с помощью того же способа, как описано в экспериментальном Примере 3, за исключением того, что использованные миРНК представляли собой siFXIg1M1SP и siFXIh1M1SP; для каждой миРНК конечные концентрации миРНК включали в общей сложности 3 концентрации (50 нМ, 5 нМ и 0,5 нМ), соответственно; и 2 культуральные лунки использовали в каждой концентрации. Результаты приведены в Таблице 10.

Как следует из Таблицы 10, миРНК согласно настоящему изобретению проявляют очень высокую ингибирующую активность in vitro в клетках HepG2; и степень ингибирования в отношении мРНК FXI до 83% может быть достигнута при концентрации миРНК 50 нМ.

Экспериментальный Пример 6: Обнаружение ингибирующей эффективности конъюгатов L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIi1M1S и L10-siFXIi1M1SP в отношении уровней экспрессии мРНК FXI у мышей in vivo

Мышей C57BL/6N (все самки) случайным образом разделяли на группы (по 5 мышей в каждой группе) и нумеровали, соответственно. Исследуемый конъюгат (т.е. L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIi1M1S или L10-siFXIi1M1SP) вводили подкожно в двух различных дозах 5 мг/кг и 1 мг/кг (в зависимости от количества миРНК) мышам в каждой группе, соответственно. Каждый конъюгат миРНК вводили в концентрациях 1 мг/мл и 0,2 мг/мл в форме 0,9 масс. % водного раствора NaCl и объеме введения 5 мл/кг.

Одной из групп мышей вводили 1хфСБ в объеме введения 5 мл/кг и регистрировали в качестве контрольной группы.

Мышей умерщвляли на 7 день после введения. Затем ткань печени каждой из мышей собирали и хранили с РНК (компания Sigma Aldrich), а ткань печени гомогенизировали с помощью гомогенизатора ткани. Затем общую РНК экстрагировали и получали с применением тризола в соответствии с процедурами, описанными в инструкциях.

Уровни экспрессии мРНК FXI измеряли с помощью флуоресцентной кПЦР, а уровни ингибирования в отношении мРНК FXI рассчитывали с применением тех же методов, что и в экспериментальном примере 3, за исключением того, что экстрагированную общую РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК с применением набора для обратной транскрипции ImProm-IITM (Promega company) в соответствии с инструкциями для получения кДНК-содержащего раствора. Затем измеряли уровень экспрессии мРНК FXI в ткани печени с применением набора для флуоресцентной кПЦР (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd). В способе флуоресцентной кПЦР в качестве внутреннего эталонного гена применяли ген GAPDH (mGAPDH) мыши, FXI и GAPDH мыши определяли с применением праймеров для FXI и GAPDH мыши, соответственно. Последовательности праймеров для определения были такими, как показано в Таблице 11.

В ходе измерения уровней экспрессии мРНК FXI и расчета скорости ингибирования против мРНК FXI мышам в контрольной группе этого эксперимента вводили PBS; и мышам в испытываемых группах вводили разные конъюгаты миРНК, соответственно. Уровень экспрессии мРНК FXI в контрольной группе регистрировали как 100%; и, соответственно, уровень ингибирования против этого уровня экспрессии мРНК FXI регистрировали как 0%. Результаты теста нормализовали на основании уровня экспрессии мРНК FXI в контрольной группе, как показано в Таблице 12.

Как можно видеть из Таблицы 12, конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению продемонстрировали скорость ингибирования в диапазоне от 56,8 до 78,4% в отношении мРНК FXI в дозе миРНК 1 мг/кг; и скорость ингибирования до 95,0% может быть достигнута при концентрации миРНК 5 мг/кг, что свидетельствует о превосходной эффективности ингибирования в отношении мРНК FXI.

Экспериментальный Пример 7: Обнаружение ингибирования конъюгатов L10-siFXIf1M1S и L10-siFXIi1M1SP в отношении экспрессии мРНК FXI и продления активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) в различных временных точках после введения мышам in vivo

Мышей C57BL/6N (все самцы) случайным образом разделяли на 7 групп (по 5 мышей в каждой группе) и нумеровали, соответственно. Конъюгаты L10-siFXIf1M1S и L10-siFXIi1M1SP вводили каждым трем группам мышей, соответственно. Остальной группе мышей вводили физиологический раствор в качестве контрольной группы. Способ введения - подкожная инъекция. Конъюгаты вводили в концентрации 1,8 мг/мл (на основе миРНК) в форме 0,9% водного раствора NaCl и в дозировке 9 мг/кг.Нормальный физиологический раствор представлял собой 0,9% водный раствор NaCl. Объем введения составлял 5 мл/кг.Образцы плазмы собирали на 8, 15 и 29 день после введения, соответственно. Группы мышей, которым вводили конъюгаты, умерщвляли на 29 день после введения; и группу мышей, которым вводили NS, умерщвляли на 8 день после введения. Затем ткань печени каждой из мышей собирали и хранили с РНК (компания Sigma Aldrich), а ткань печени гомогенизировали с помощью гомогенизатора ткани. Затем общую РНК экстрагировали и получали с применением тризола в соответствии с процедурами, описанными в инструкциях.

Уровни экспрессии мРНК FXI измеряли с помощью флуоресцентной кПЦР, а уровни ингибирования в отношении мРНК FXI рассчитывали с применением тех же методов, что и в экспериментальном Примере 3, за исключением того, что экстрагированную общую РНК подвергали обратной транскрипции с получением кДНК с применением набора для обратной транскрипции ImProm-IITM (Promega company) в соответствии с инструкциями для получения кДНК-содержащего раствора. Затем измеряли уровень экспрессии мРНК FXI в ткани печени с применением набора для флуоресцентной кПЦР (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd). В способе флуоресцентной кПЦР в качестве внутреннего эталонного гена применяли ген GAPDH (mGAPDH) мыши, FXI и GAPDH мыши определяли с применением праймеров для FXI и GAPDH мыши, соответственно.

Последовательности праймеров для определения были такими, как показано в Таблице 11.

В ходе измерения уровней экспрессии мРНК FXI и расчета уровней ингибирования против мРНК FXI мышам в контрольной группе этого эксперимента вводили физиологический раствор; и мышам в испытываемых группах вводили разные конъюгаты миРНК, соответственно, причем образцы брали в различных временных точках после введения. Уровень экспрессии мРНК FXI в контрольной группе регистрировали как 100%; и, соответственно, уровень ингибирования против этого уровня экспрессии мРНК FXI регистрировали как 0%. Результаты теста нормализовали на основании уровня экспрессии мРНК FXI в контрольной группе, как показано в Таблице 13. В этой таблице скорость ингибирования относительно уровня экспрессии мРНК FXI представляет собой среднее арифметическое значение скорости ингибирования относительно уровней экспрессии мРНК FXI, измеренное у 5 мышей той же группы в соответствующие дни после введения соответствующего конъюгата миРНК.

Как следует из результатов Таблицы 13, после однократного подкожного введения мышам конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению проявляли превосходный уровень ингибирования против мРНК FXI в печени в различные моменты времени в течение длительного периода времени и проявляли уровень ингибирования по меньшей мере 89,18% или даже до 92,89%.

Кроме того, для образцов плазмы, собранных выше, использовали набор АРТТ (компания Rayto, кат. № 20190402М) для измерения значения АЧТВ в плазме каждой мыши с помощью турбидиметрического анализа в полуавтоматическом анализаторе гемостаза (компания Rayto, модель №RT-2202). Конкретный метод обнаружения проводят, как описано в инструкциях к набору АРТТ. Сравнивая измеренные значения АЧТВ с таковыми в контрольной группе, относительное удлинение АЧТВ на мышь=(измеренное значение АЧТВ в испытываемой группе - измеренное среднее значение АЧТВ в контрольной группе)/ (измеренное среднее значение АЧТВ в контрольной группе) × 100%. Измеренные результаты представлены в Таблице 14. В этой таблице относительное повышение АЧТВ относится к среднему значению относительных повышений АЧТВ, измеренных у 5 мышей той же группы в соответствующие дни после введения соответствующего конъюгата миРНК.

Как следует из результатов Таблицы 14, измеренное значение АЧТВ было значительно повышено у мышей, которым вводили конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению в течение длительного периода времени; и может быть достигнуто повышение до 64,9%. Очевидно, что конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению могут эффективно продлевать время коагуляции у мышей, что означает, что они имеют многообещающую перспективу применения для лечения и/или предотвращения тромботического заболевания и/или ишемического инсульта.

Экспериментальный Пример 8: Измерение активности конъюгатов миРНК согласно настоящему изобретению у гуманизированных мышей in vivo

Гуманизированные мыши, использованные в этом эксперименте, были приобретены у Cyagen Biosciences Inc. Мышей случайным образом разделяли на группы, по 4 мыши (2 самца мышей и 2 самки мышей) в каждой группе. Конъюгаты L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP и L10-siFXIi1M1S вводили отдельно мышам в каждой группе; и в качестве контроля использовали физиологический раствор. Дозировки лекарственного средства для всех животных вычисляли в соответствии с массой тела (однократное введение (подкожно). Каждый конъюгат вводили в концентрациях 0,3 мг/мл (на основе миРНК) в виде 0,9 масс. % водного раствора NaCl и объема введения 10 мл/кг, то есть дозировка каждого конъюгата составляла 3 мг/кг (на основе миРНК). Мышей умерщвляли на 8 день после введения. Образцы плазмы собирали. 3,2 масс. % (0,109 моль/л) водного раствора цитрата натрия дигидрата добавляли при объемном соотношении антикоагулянта и плазмы 1:9 (об./об.) для предотвращения свертывания крови; и образцы плазмы отделяли центрифугированием.

Затем принимали около 100 мг/мышь левой доли печени и хранили с РНК (Sigma Aldrich). Затем ткань печени каждой мыши гомогенизировали с помощью гомогенизатора ткани. Затем общую РНК ткани печени каждой мыши экстрагировали и получали с применением тризола (компания Thermo Fisher) в соответствии с процедурой, описанной в инструкциях.

В соответствии с тем же способом, как описано в экспериментальном Примере 6, уровни экспрессии мРНК FXI в ткани печени у мышей, которым вводили различные конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению, или у мышей в контрольной группе, измеряли с помощью флуоресцентного метода кПЦР в реальном времени, за исключением того, что последовательности праймеров для амплификации FXI человека и GAPDH мыши в качестве внутреннего эталонного гена были такими, как показано в Таблице 15.

Измеряли уровни экспрессии мРНК FXI и рассчитывали уровни ингибирования против мРНК FXI с помощью тех же способов, как описано в экспериментальном Примере 3. Уровень экспрессии мРНК FXI в контрольной группе регистрировали как 100%; и, соответственно, уровень ингибирования против этого уровня экспрессии мРНК FXI регистрировали как 0%. Результаты теста нормализовали на основании уровня экспрессии мРНК FXI в контрольной группе, как показано в Таблице 16. В этой таблице степень ингибирования против мРНК FXI человека представляет собой среднее значение степени ингибирования против мРНК FXI человека, рассчитанное у мышей той же группы, которым вводили соответствующий конъюгат миРНК, и его стандартное отклонение.

Как следует из результатов Таблицы 16, конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению проявляли хорошие ингибирующие эффекты в отношении мРНК FXI человека в гуманизированной гетерозиготной печени мыши и демонстрировали степень ингибирования в отношении мРНК FXI в пределах от около 71 до 93%.

Кроме того, указанную выше группу мышей (включая мышей в тестовых группах, которым вводили конъюгат L10-siFXIf1M1S, L10-siFXIa1M1SP, L10-siFXIb1M1SP, L10-siFXIc1M1SP, L10-siFXId1M1SP, L10-siFXIe1M1SP, L10-siFXIg1M1SP, L10-siFXIh1M1SP или L10-siFXIi1M1S, соответственно, и мышей в контрольной группе, которой вводили физиологический раствор, испытывали с использованием набора ELIS А фактора свертывания крови X человека (компания Sigma, партия №0926F2350, артикул № RAB1385-1KT) для определения концентраций белка FXI в плазме.

Разбавитель образца (помеченный как ItemE2 в наборе) в наборе для ИФА был в 5 раз разведен деионизированной водой для получения разбавителя разбавленного образца.

Для плазмы мышей, которым вводили конъюгат L10-siFXIa1M1SP или L10-siFXIg1M1SP, 108 мкл разбавленного разбавителя образца добавляли к 12 мкл плазмы для образования испытуемого раствора образца, который выдерживали до использования.

Для плазмы мышей, которым вводили другие конъюгаты или физиологический раствор, 108 мкл разбавленного разбавителя образца добавляли к 12 мкл плазмы с получением 10-кратного разбавленного плазмы; 45 мкл разбавленного разбавителя образца добавляли к 5 мкл 10-кратного разбавленного плазмы с получением 100-кратного разбавленного плазмы; а затем 108 мкл разбавленного разбавителя образца добавляли к 12 мкл 100-кратного разбавленного плазмы с получением 1000-кратного разбавленного разбавителя образца в качестве испытуемого раствора образца, который выдерживали до использования.

Обнаруженное антитело FXI (обозначенное как ItemF в наборе) в наборе растворяли 100 мкл разбавленного растворителя образца в образце антитела, а затем отбирали 75 мкл образца антитела и добавляли к 5925 мкл разбавленного растворителя образца для 80-кратного разведения с образованием раствора для обнаружения антитела.

Концентрат стрептомицина (обозначенный как ItemG в наборе) в наборе разбавляли разбавителем разбавленного образца в 250 раз с образованием раствора для разведения стрептомицина.

Промывочный буфер (помеченный как ItemB в наборе) в наборе разбавляли деионизированной водой в 20 раз с образованием разбавленного промывочного раствора.

Были предоставлены растворы с 8 стандартными градиентами концентрации; одним из растворов был разбавленный растворитель образца (который можно рассматривать как стандартный раствор в концентрации 0 пг/мл), а остальными семью растворами были стандартные растворы с 7 концентрациями 2500 пг/мл, 1000 пг/мл, 400 пг/мл, 160 пг/мл, 64 пг/мл, 25,6 пг/мл и 10,24 пг/мл, полученные путем последовательного разведения стандартного продукта (помеченного как позиция С в наборе) в наборе с разбавленным растворителем образца, описанным выше.

Анализ ИФА

Набор для ИФА фактора свертывания крови X человека (SIGMA Company, номер по каталогу RAB1385-1KT). Стандартные лунки и лунки для образцов располагали в соответствии с инструкцией по применению. Растворы с разными градиентами концентрации стандарта или испытуемые растворы образцов высевали по отдельности в количестве 100 мкл на лунку, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. После удаления из нее раствора добавляли 300 мкл разбавленного промывочного раствора на лунку для промывки лунок в течение 1 минуты, а затем промывочный раствор удаляли. На лунку добавляли 100 мкл раствора для обнаружения антител, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После удаления из нее раствора добавляли 300 мкл разбавленного промывочного раствора на лунку для промывки лунок в течение 1 минуты, а затем промывочный раствор удаляли. Эту процедуру промывки повторяли три раза (т.е. промывали в общей сложности четыре раза). На лунку добавляли 100 мкл раствора для разведения стрептомицина, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 45 минут.После удаления из нее раствора добавляли 300 мкл разбавленного промывочного раствора на лунку для промывки лунок в течение 1 минуты, а затем промывочный раствор удаляли. Эту процедуру промывки повторяли три раза (т.е. промывали в общей сложности четыре раза). На лунку добавляли 100 мкл ТМБ (помеченного как ItemH в наборе), а затем инкубировали в течение 30 минут.50 мкл стоп-раствора (поставляемого в наборе) добавляли на лунку для остановки реакции. Абсорбцию при 450 нм немедленно считывали с помощью полностью автоматического считывателя микропланшетов (компания BioTek, Biotck SYNERGY MX). Результаты каждой тестовой группы с определенной концентрацией конъюгата миРНК сравнивали с контрольной группой с физиологическим раствором.

Согласно результатам измерения активности в растворах со стандартными градиентами концентрации, стандартные кривые зависимости ответа от дозы аппроксимировали, используя функцию log(ингибитор) в зависимости от ответа - переменный наклон программного обеспечения Graphpad 6.0. Концентрацию белка в плазме вычисляли на основании кривой зависимости ответа от дозы, и установленные кривые соответствовали приведенной ниже формуле расчета:

,

в которой:

Y - соответствующее значение оптической плотности, считанное при 450 нм,

X - логарифмическое значение (мкг/мл) концентрации на стандартной кривой,

Bot представляет собой значение Y в нижней части стационарной стадии,

Тор представляет собой значение Y в верхней части стационарной стадии,

Х' представляет собой значение X, полученное путем подгонки, при которой Y представляет собой медианное значение между низом и верхом, a HillSlope представляет собой наклон кривой на X'.

Логарифмическое значение X соответствующей концентрации каждого образца получали путем размещения значения оптической плотности, измеренного в каждом образце плазмы, в формуле на основании соответствующей стандартной кривой; и рассчитывали значение концентрации белка FXI в плазме каждого образца, вводимого с различным конъюгатом миРНК = 10АХ (мкг/мл).

По значению концентрации белка FXI в плазме рассчитывали степень ингибирования против белка FXI=(концентрация белка в контрольной группе концентрация белка в испытываемой группе)/концентрацию белка в контрольной группе × 100% на основании концентрации белка в контрольной группе. Полученные результаты концентрации и данные скорости ингибирования представлены в Таблице 17. В этой таблице концентрация белка FXI и степень ингибирования в отношении белка FXI представляли собой среднее арифметическое значение концентраций белка FXI и степени ингибирования в отношении белка FXI в той же группе мышей, которым вводили соответствующий конъюгат миРНК, соответственно.

Как следует из результатов Таблицы 17, все конъюгаты миРНК согласно настоящему изобретению проявляли превосходный эффект ингибирования экспрессии белка FXI человека в плазме гуманизированных гетерозиготных мышей; в частности, конъюгаты L10-siFXIa1M1SP и L10- siFXIg1M1SP продемонстрировали высокую степень ингибирования в отношении белка FXI до около 99%.

Некоторые варианты реализации настоящего изобретения подробно описаны выше, но настоящее изобретение не ограничено конкретными подробностями вышеприведенных вариантов реализации. Различные простые изменения технического решения настоящего изобретения могут быть выполнены в пределах объема технической концепции настоящего изобретения, и эти простые изменения находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Следует отметить, что каждый из конкретных технических признаков, описанных в вышеупомянутых вариантах реализации, может быть объединен любым подходящим способом, при условии, что не возникает противоречие. Чтобы избежать ненужного повторения, различные возможные способы комбинирования далее не будут описаны в настоящем изобретении.

Кроме того, различные варианты реализации настоящего изобретения также могут быть выполнены в любой комбинации, при условии, что не возникает противоречие идее настоящего изобретения, это также следует рассматривать как раскрытие настоящего изобретения.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящую заявку посредством ссылки в той степени, как если бы каждая публикация, патент и заявка на патенты была специально и по отдельности включена в настоящую заявку посредством ссылки.

--->

Перечень последовательностей

<110> SU ZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO.,LTD

<120> НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОНЪЮГАТ, СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

<130> FP1200353P

<150> CN 2019104305887

<151> 2019-5-22

<160> 577

<210> 1

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z1, Z1 представляет собой U

<400> 1

ggguauucuu ucaagcaan 19

<210> 2

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z2, Z2 представляет собой A

<400> 2

nuugcuugaa agaauaccc 19

<210> 3

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z3, Z3 представляет собой A, U, G или C

<400> 3

ggguauucuu ucaagcaan 19

<210> 4

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z4, Z4 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z3, Z3 выбран из A, U, G или C

<400> 4

nuugcuugaa agaauaccc 19

<210> 5

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z3, Z3 представляет собой A, U, G или C

<400> 5

ggguauucuu ucaagcaan 19

<210> 6

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z4, Z4 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z3, Z3 выбран из A,U,G или C

<400> 6

nuugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 7

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z3, Z3 представляет собой A, U, G или C

<400> 7

cuggguauuc uuucaagcaa n 21

<210> 8

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z4, Z4 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z3, Z3 выбран из A,U,G или C

<400> 8

nuugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 9

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1

<400> 9

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 10

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1

<400> 10

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 11

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2

<400> 11

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 12

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2

<400> 12

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 13

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M1

<400> 13

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 14

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M1

<400> 14

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 15

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M2

<400> 15

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 16

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M2

<400> 16

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 17

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M3

<400> 17

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 18

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M3

<400> 18

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 19

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M1

<400> 19

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 20

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M1

<400> 20

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 21

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M2

<400> 21

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 22

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M2

<400> 22

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 23

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M3

<400> 23

cuggguauuc uuucaagcaau 21

<210> 24

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M3

<400> 24

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 25

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M1S

<400> 25

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 26

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M1S

<400> 26

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 27

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M2S

<400> 27

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 28

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M2S

<400> 28

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 29

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M3S

<400> 29

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 30

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M3S

<400> 30

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 31

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M1S

<400> 31

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 32

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M1S

<400> 32

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 33

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M2S

<400> 33

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 34

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M2S

<400> 34

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 35

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M3S

<400> 35

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 36

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M3S

<400> 36

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 37

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M1P1

<400> 37

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 38

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M1P1

<400> 38

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 39

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M2P1

<400> 39

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 40

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M2P1

<400> 40

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 41

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M3P1

<400> 41

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 42

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M3P1

<400> 42

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 43

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M1P1

<400> 43

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 44

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M1P1

<400> 44

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 45

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M2P1

<400> 45

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 46

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M2P1

<400> 46

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 47

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M3P1

<400> 47

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 48

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M3P1

<400> 48

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 49

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M1SP1

<400> 49

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 50

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M1SP1

<400> 50

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 51

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M2SP1

<400> 51

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 52

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M2SP1

<400> 52

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 53

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa1-M3SP1

<400> 53

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 54

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa1-M3SP1

<400> 54

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 55

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M1SP1

<400> 55

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 56

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M1SP1

<400> 56

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 57

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M2SP1

<400> 57

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 58

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M2SP1

<400> 58

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 59

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIa2-M3SP1

<400> 59

cuggguauuc uuucaagcaa u 21

<210> 60

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIa2-M3SP1

<400> 60

auugcuugaa agaauaccca gaa 23

<210> 61

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z5, Z5 представляет собой U

<400> 61

ggcauaaacu auaacagcn 19

<210> 62

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z6, Z6 представляет собой A

<400> 62

ngcuguuaua guuuaugcc 19

<210> 63

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z7, Z7 представляет собой A, U,G или C

<400> 63

ggcauaaacu auaacagcn 19

<210> 64

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z8, Z8 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z7, Z7 выбран из A, U, G или C

<400> 64

ngcuguuaua guuuaugcc 19

<210> 65

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z7, Z7 представляет собой A, U, G или C

<400> 65

ggcauaaacu auaacagcn 19

<210> 66

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z8, Z8 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z7, Z7 выбран из A, U, G или C

<400> 66

ngcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 67

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z7, Z7 представляет собой A, U, G или C

<400> 67

agggcauaaa cuauaacagc n 21

<210> 68

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z8, Z8 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z7, Z7 выбран из A, U, G или C

<400> 68

ngcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 69

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1

<400> 69

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 70

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1

<400> 70

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 71

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2

<400> 71

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 72

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2

<400> 72

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 73

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M1

<400> 73

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 74

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M1

<400> 74

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 75

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M2

<400> 75

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 76

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M2

<400> 76

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 77

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M3

<400> 77

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 78

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M3

<400> 78

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 79

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M1

<400> 79

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 80

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M1

<400> 80

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 81

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M2

<400> 81

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 82

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M2

<400> 82

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 83

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M3

<400> 83

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 84

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M3

<400> 84

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 85

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M1S

<400> 85

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 86

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M1S

<400> 86

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 87

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M2S

<400> 87

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 88

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M2S

<400> 88

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 89

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M3S

<400> 89

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 90

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M3S

<400> 90

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 91

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M1S

<400> 91

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 92

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M1S

<400> 92

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 93

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M2S

<400> 93

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 94

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M2S

<400> 94

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 95

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M3S

<400> 95

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 96

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M3S

<400> 96

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 97

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M1P1

<400> 97

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 98

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M1P1

<400> 98

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 99

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M2P1

<400> 99

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 100

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M2P1

<400> 100

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 101

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M3P1

<400> 101

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 102

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M3P1

<400> 102

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 103

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M1P1

<400> 103

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 104

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M1P1

<400> 104

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 105

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M2P1

<400> 105

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 106

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M2P1

<400> 106

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 107

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M3P1

<400> 107

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 108

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M3P1

<400> 108

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 109

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M1SP1

<400> 109

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 110

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M1SP1

<400> 110

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 111

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M2SP1

<400> 111

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 112

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M2SP1

<400> 112

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 113

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb1-M3SP1

<400> 113

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 114

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb1-M3SP1

<400> 114

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 115

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M1SP1

<400> 115

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 116

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M1SP1

<400> 116

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 117

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M2SP1

<400> 117

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 118

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M2SP1

<400> 118

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 119

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIb2-M3SP1

<400> 119

agggcauaaa cuauaacagc u 21

<210> 120

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIb2-M3SP1

<400> 120

agcuguuaua guuuaugccc uuc 23

<210> 121

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z9, Z9 представляет собой A

<400> 121

gcucaagaau gccaagaan 19

<210> 122

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z10, Z10 представляет собой U

<400> 122

nuucuuggca uucuugagc 19

<210> 123

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z11, Z11 представляет собой A, U, G или C

<400> 123

gcucaagaau gccaagaan 19

<210> 124

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z12, Z12 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z11, Z11 выбран из A, U, G или C

<400> 124

nuucuuggca uucuugagc 19

<210> 125

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z11, Z11 представляет собой A, U, G или C

<400> 125

gcucaagaau gccaagaan 19

<210> 126

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z12, Z12 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z11, Z11 выбран из A, U, G или C

<400> 126

nuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 127

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z11, Z11 представляет собой A, U, G или C

<400> 127

gugcucaaga augccaagaa n 21

<210> 128

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z12, Z12 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z11, Z11 выбран из A, U, G или C

<400> 128

nuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 129

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1

<400> 129

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 130

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1

<400> 130

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 131

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2

<400> 131

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 132

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2

<400> 132

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 133

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M1

<400> 133

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 134

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M1

<400> 134

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 135

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M2

<400> 135

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 136

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M2

<400> 136

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 137

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M3

<400> 137

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 138

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M3

<400> 138

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 139

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M1

<400> 139

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 140

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M1

<400> 140

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 141

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M2

<400> 141

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 142

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M2

<400> 142

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 143

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M3

<400> 143

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 144

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M3

<400> 144

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 145

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M1S

<400> 145

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 146

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M1S

<400> 146

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 147

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M2S

<400> 147

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 148

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M2S

<400> 148

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 149

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M3S

<400> 149

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 150

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M3S

<400> 150

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 151

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M1S

<400> 151

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 152

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M1S

<400> 152

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 153

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M2S

<400> 153

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 154

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M2S

<400> 154

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 155

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M3S

<400> 155

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 156

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M3S

<400> 156

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 157

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M1P1

<400> 157

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 158

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M1P1

<400> 158

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 159

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M2P1

<400> 159

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 160

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M2P1

<400> 160

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 161

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M3P1

<400> 161

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 162

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M3P1

<400> 162

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 163

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M1P1

<400> 163

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 164

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M1P1

<400> 164

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 165

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M2P1

<400> 165

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 166

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M2P1

<400> 166

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 167

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M3P1

<400> 167

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 168

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M3P1

<400> 168

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 169

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M1SP1

<400> 169

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 170

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M1SP1

<400> 170

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 171

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M2SP1

<400> 171

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 172

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M2SP1

<400> 172

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 173

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc1-M3SP1

<400> 173

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 174

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc1-M3SP1

<400> 174

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 175

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M1SP1

<400> 175

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 176

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M1SP1

<400> 176

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 177

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M2SP1

<400> 177

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 178

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M2SP1

<400> 178

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 179

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIc2-M3SP1

<400> 179

gugcucaaga augccaagaa a 21

<210> 180

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIc2-M3SP1

<400> 180

uuucuuggca uucuugagca cuc 23

<210> 181

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z13, Z13 представляет собой U

<400> 181

gcaacaaaga cauuuaugn 19

<210> 182

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z14, Z14 представляет собой A

<400> 182

ncauaaaugu cuuuguugc 19

<210> 183

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z15, Z15 представляет собой A, U, G или C

<400> 183

gcaacaaaga cauuuaugn 19

<210> 184

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z16, Z16 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z15, Z15 выбран из A, U, G или C

<400> 184

ncauaaaugu cuuuguugc 19

<210> 185

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z15, Z15 представляет собой A, U, G или C

<400> 185

gcaacaaaga cauuuaugn 19

<210> 186

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z16, Z16 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z15, Z15 выбран из A, U, G или C

<400> 186

ncauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 187

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z15, Z15 представляет собой A, U, G или C

<400> 187

uugcaacaaa gacauuuaug n 21

<210> 188

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z16, Z16 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z15, Z15 выбран из A, U, G или C

<400> 188

ncauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 189

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1

<400> 189

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 190

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1

<400> 190

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 191

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2

<400> 191

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 192

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2

<400> 192

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 193

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M1

<400> 193

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 194

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M1

<400> 194

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 195

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M2

<400> 195

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 196

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M2

<400> 196

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 197

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M3

<400> 197

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 198

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M3

<400> 198

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 199

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M1

<400> 199

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 200

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M1

<400> 200

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 201

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M2

<400> 201

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 202

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M2

<400> 202

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 203

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M3

<400> 203

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 204

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M3

<400> 204

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 205

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M1S

<400> 205

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 206

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M1S

<400> 206

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 207

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M2S

<400> 207

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 208

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M2S

<400> 208

acauaaaugu cuuuguugca a 23

<210> 209

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M3S

<400> 209

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 210

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Anr представляет собой ense sequence f или siFXId1-M3S

<400> 210

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 211

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M1S

<400> 211

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 212

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M1S

<400> 212

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 213

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M2S

<400> 213

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 214

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M2S

<400> 214

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 215

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M3S

<400> 215

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 216

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M3S

<400> 216

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 217

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M1P1

<400> 217

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 218

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M1P1

<400> 218

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 219

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M2P1

<400> 219

gcaacaaaga cauuuaugu 21

<210> 220

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M2P1

<400> 220

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 221

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M3P1

<400> 221

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 222

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M3P1

<400> 222

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 223

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M1P1

<400> 223

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 224

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M1P1

<400> 224

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 225

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M2P1

<400> 225

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 226

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M2P1

<400> 226

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 227

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M3P1

<400> 227

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 228

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M3P1

<400> 228

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 229

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M1SP1

<400> 229

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 230

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M1SP1

<400> 230

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 231

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M2SP1

<400> 231

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 232

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M2SP1

<400> 232

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 233

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId1-M3SP1

<400> 233

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 234

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId1-M3SP1

<400> 234

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 235

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M1SP1

<400> 235

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 236

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M1SP1

<400> 236

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 237

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M2SP1

<400> 237

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 238

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M2SP1

<400> 238

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 239

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXId2-M3SP1

<400> 239

uugcaacaaa gacauuuaug u 21

<210> 240

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXId2-M3SP1

<400> 240

acauaaaugu cuuuguugca agc 23

<210> 241

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z17, Z17 представляет собой U

<400> 241

gaaucucaaa gaaaucuun 19

<210> 242

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z18, Z18 представляет собой A

<400> 242

naagauuucu uugagauuc 19

<210> 243

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z19，Z19 представляет собой A, U, G или C

<400> 243

gaaucucaaa gaaaucuun 19

<210> 244

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z20, Z20 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z19, Z19 выбран из A, U, G или C

<400> 244

naagauuucu uugagauuc 19

<210> 245

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z19，Z19 представляет собой A, U, G или C

<400> 245

gaaucucaaa gaaaucuun 19

<210> 246

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z20, Z20 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z19, Z19 выбран из A, U, G или C

<400> 246

naagauuucu uugagauucu u 21

<210> 247

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z19，Z19 представляет собой A, U, G или C

<400> 247

aagaaucuca aagaaaucuu n 21

<210> 248

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z20, Z20 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z19, Z19 выбран из A, U, G или C

<400> 248

naagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 249

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1

<400> 249

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 250

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1

<400> 250

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 251

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2

<400> 251

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 252

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2

<400> 252

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 253

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M1

<400> 253

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 254

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M1

<400> 254

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 255

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M2

<400> 255

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 256

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M2

<400> 256

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 257

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M3

<400> 257

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 258

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M3

<400> 258

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 259

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M1

<400> 259

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 260

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M1

<400> 260

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 261

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M2

<400> 261

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 262

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M2

<400> 262

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 263

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M3

<400> 263

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 264

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M3

<400> 264

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 265

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M1S

<400> 265

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 266

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M1S

<400> 266

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 267

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M2S

<400> 267

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 268

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M2S

<400> 268

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 269

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M3S

<400> 269

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 270

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M3S

<400> 270

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 271

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M3S

<400> 271

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 272

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M3S

<400> 272

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 273

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M2S

<400> 273

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 274

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M2S

<400> 274

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 275

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M3S

<400> 275

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 276

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M3S

<400> 276

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 277

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M1P1

<400> 277

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 278

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M1P1

<400> 278

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 279

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M2P1

<400> 279

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 280

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M2P1

<400> 280

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 281

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M3P1

<400> 281

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 282

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M3P1

<400> 282

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 283

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M1P1

<400> 283

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 284

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M1P1

<400> 284

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 285

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M2P1

<400> 285

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 286

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M2P1

<400> 286

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 287

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M3P1

<400> 287

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 288

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M3P1

<400> 288

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 289

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M1SP1

<400> 289

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 290

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M1SP1

<400> 290

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 291

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M2SP1

<400> 291

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 292

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M2SP1

<400> 292

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 293

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1-M3SP1

<400> 293

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 294

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1-M3SP1

<400> 294

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 295

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M1SP1

<400> 295

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 296

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M1SP1

<400> 296

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 297

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M2SP1

<400> 297

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 298

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M2SP1

<400> 298

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 299

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe2-M3SP1

<400> 299

aagaaucuca aagaaaucuu u 21

<210> 300

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe2-M3SP1

<400> 300

aaagauuucu uugagauucu uug 23

<210> 301

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z21, Z21 представляет собой G

<400> 301

guacguggac uggauucun 19

<210> 302

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z22, Z22 представляет собой C

<400> 302

nagaauccag uccacguac 19

<210> 303

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z23, Z23 представляет собой A, U, G или C

<400> 303

guacguggac uggauucun 19

<210> 304

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z24, Z24 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z23, Z23 выбран из A, U, G или C

<400> 304

nagaauccag uccacguac 19

<210> 305

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z23, Z23 представляет собой A, U, G или C

<400> 305

guacguggac uggauucun 19

<210> 306

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z24, Z24 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z23, Z23 выбран из A, U, G или C

<400> 306

nagaauccag uccacguacu c 21

<210> 307

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z23, Z23 представляет собой A, U, G или C

<400> 307

gaguacgugg acuggauucu n 21

<210> 308

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z24, Z24 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z23, Z23 выбран из A, U, G или C

<400> 308

nagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 309

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1

<400> 309

guacguggacu ggauucug 19

<210> 310

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1

<400> 310

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 311

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2

<400> 311

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 312

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2

<400> 312

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 313

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M1

<400> 313

guacguggac uggauucug 19

<210> 314

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M1

<400> 314

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 315

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M2

<400> 315

guacguggac uggauucug 19

<210> 316

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M2

<400> 316

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 317

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M3

<400> 317

guacguggac uggauucug 19

<210> 318

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M3

<400> 318

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 319

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M1

<400> 319

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 320

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M1

<400> 320

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 321

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M2

<400> 321

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 322

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M2

<400> 322

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 323

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M3

<400> 323

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 324

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M3

<400> 324

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 325

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M1S

<400> 325

guacguggac uggauucug 19

<210> 326

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M1S

<400> 326

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 327

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M2S

<400> 327

guacguggac uggauucug 19

<210> 328

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M2S

<400> 328

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 329

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M3S

<400> 329

guacguggac uggauucug 19

<210> 330

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M3S

<400> 330

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 331

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M1S

<400> 331

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 332

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M1S

<400> 332

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 333

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M2S

<400> 333

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 334

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M2S

<400> 334

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 335

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M3S

<400> 335

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 336

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M3S

<400> 336

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 337

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M1P1

<400> 337

guacguggac uggauucug 19

<210> 338

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M1P1

<400> 338

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 339

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M2P1

<400> 339

guacguggac uggauucug 19

<210> 340

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M2P1

<400> 340

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 341

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M3P1

<400> 341

guacguggac uggauucug 19

<210> 342

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M3P1

<400> 342

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 343

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M1P1

<400> 343

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 344

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M1P1

<400> 344

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 345

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M2P1

<400> 345

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 346

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M2P1

<400> 346

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 347

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M3P1

<400> 347

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 348

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M3P1

<400> 348

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 349

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M1SP1

<400> 349

guacguggac uggauucug 19

<210> 350

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M1SP1

<400> 350

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 351

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M2SP1

<400> 351

guacguggac uggauucug 19

<210> 352

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M2SP1

<400> 352

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 353

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf1-M3SP1

<400> 353

guacguggac uggauucug 19

<210> 354

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf1-M3SP1

<400> 354

cagaauccag uccacguacu c 21

<210> 355

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M1SP1

<400> 355

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 356

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M1SP1

<400> 356

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 357

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M2SP1

<400> 357

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 358

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M2SP1

<400> 358

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 359

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIf2-M3SP1

<400> 359

gaguacgugg acuggauucu g 21

<210> 360

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIf2-M3SP1

<400> 360

cagaauccag uccacguacu cga 23

<210> 361

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z25, Z25 представляет собой A

<400> 361

auuucugggu auucuuucn 19

<210> 362

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z26, Z26 представляет собой U

<400> 362

ngaaagaaua cccagaaau 19

<210> 363

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z27,Z27 представляет собой A, U, G или C

<400> 363

auuucugggu auucuuucn 19

<210> 364

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z28, Z28 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z27, Z27 выбран из A, U, G или C

<400> 364

ngaaagaaua cccagaaau 19

<210> 365

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z27,Z27 представляет собой A, U, G или C

<400> 365

auuucugggu auucuuucn 19

<210> 366

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z28, Z28 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z27, Z27 выбран из A, U, G или C

<400> 366

ngaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 367

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z27,Z27 представляет собой A, U, G или C

<400> 367

cgauuucugg guauucuuuc n 21

<210> 368

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z28, Z28 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z27, Z27 выбран из A, U, G или C

<400> 368

ngaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 369

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1

<400> 369

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 370

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1

<400> 370

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 371

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2

<400> 371

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 372

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2

<400> 372

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 373

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M1

<400> 373

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 374

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M1

<400> 374

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 375

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M2

<400> 375

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 376

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M2

<400> 376

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 377

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M3

<400> 377

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 378

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M3

<400> 378

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 379

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M1

<400> 379

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 380

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M1

<400> 380

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 381

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M2

<400> 381

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 382

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M2

<400> 382

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 383

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M3

<400> 383

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 384

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M3

<400> 384

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 385

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M1S

<400> 385

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 386

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M1S

<400> 386

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 387

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M2S

<400> 387

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 388

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M2S

<400> 388

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 389

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M3S

<400> 389

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 390

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M3S

<400> 390

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 391

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M1S

<400> 391

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 392

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M1S

<400> 392

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 393

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M2S

<400> 393

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 394

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M2S

<400> 394

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 395

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M3S

<400> 395

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 396

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M3S

<400> 396

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 397

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M1P1

<400> 397

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 398

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M1P1

<400> 398

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 399

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M2P1

<400> 399

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 400

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M2P1

<400> 400

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 401

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M3P1

<400> 401

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 402

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M3P1

<400> 402

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 403

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M1P1

<400> 403

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 404

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M1P1

<400> 404

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 405

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M2P1

<400> 405

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 406

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M2P1

<400> 406

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 407

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M3P1

<400> 407

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 408

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M3P1

<400> 408

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 409

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M1SP1

<400> 409

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 410

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M1SP1

<400> 410

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 411

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M2SP1

<400> 411

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 412

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M2SP1

<400> 412

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 413

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg1-M3SP1

<400> 413

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 414

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg1-M3SP1

<400> 414

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 415

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M1SP1

<400> 415

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 416

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M1SP1

<400> 416

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 417

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M2SP1

<400> 417

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 418

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M2SP1

<400> 418

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 419

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIg2-M3SP1

<400> 419

cgauuucugg guauucuuuc a 21

<210> 420

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIg2-M3SP1

<400> 420

ugaaagaaua cccagaaauc gcu 23

<210> 421

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z29, Z29 представляет собой U

<400> 421

caugaagggc auaaacuan 19

<210> 422

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z30, Z30 представляет собой A

<400> 422

nuaguuuaug cccuucaug 19

<210> 423

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z31, Z31 представляет собой A, U, G или C

<400> 423

caugaagggc auaaacuan 19

<210> 424

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z32, Z32 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z31, Z31 выбран из A, U, G или C

<400> 424

nuaguuuaug cccuucaug 19

<210> 425

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z31, Z31 представляет собой A, U, G или C

<400> 425

caugaagggc auaaacuan 19

<210> 426

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z32, Z32 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z31, Z31 выбран из A, U, G или C

<400> 426

nuaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 427

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z31, Z31 представляет собой A, U, G или C

<400> 427

gacaugaagg gcauaaacua n 21

<210> 428

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z32, Z32 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z31, Z31 выбран из A, U, G или C

<400> 428

nuaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 429

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1

<400> 429

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 430

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1

<400> 430

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 431

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2

<400> 431

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 432

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2

<400> 432

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 433

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M1

<400> 433

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 434

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M1

<400> 434

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 435

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M2

<400> 435

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 436

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M2

<400> 436

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 437

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M3

<400> 437

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 438

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M3

<400> 438

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 439

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M1

<400> 439

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 440

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M1

<400> 440

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 441

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M2

<400> 441

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 442

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M2

<400> 442

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 443

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M3

<400> 443

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 444

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M3

<400> 444

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 445

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M1S

<400> 445

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 446

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M1S

<400> 446

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 447

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M2S

<400> 447

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 448

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M2S

<400> 448

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 449

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M3S

<400> 449

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 450

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M3S

<400> 450

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 451

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M1S

<400> 451

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 452

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M1S

<400> 452

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 453

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M2S

<400> 453

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 454

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M2S

<400> 454

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 455

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M3S

<400> 455

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 456

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M3S

<400> 456

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 457

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M1P1

<400> 457

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 458

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M1P1

<400> 458

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 459

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M2P1

<400> 459

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 460

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M2P1

<400> 460

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 461

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M3P1

<400> 461

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 462

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M3P1

<400> 462

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 463

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M1P1

<400> 463

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 464

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M1P1

<400> 464

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 465

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M2P1

<400> 465

gacaugaaggg cauaaacua u 21

<210> 466

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M2P1

<400> 466

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 467

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M3P1

<400> 467

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 468

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M3P1

<400> 468

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 469

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M1SP1

<400> 469

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 470

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M1SP1

<400> 470

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 471

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M2SP1

<400> 471

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 472

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M2SP1

<400> 472

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 473

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh1-M3SP1

<400> 473

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 474

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh1-M3SP1

<400> 474

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 475

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M1SP1

<400> 475

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 476

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M1SP1

<400> 476

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 477

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M2SP1

<400> 477

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 478

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M2SP1

<400> 478

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 479

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIh2-M3SP1

<400> 479

gacaugaagg gcauaaacua u 21

<210> 480

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIh2-M3SP1

<400> 480

auaguuuaug cccuucaugu cua 23

<210> 481

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z33, Z33 представляет собой A

<400> 481

ggauucugga gaaaacucn 19

<210> 482

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z34, Z34 представляет собой U

<400> 482

ngaguuuucu ccagaaucc 19

<210> 483

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z35, Z35 представляет собой A, U, G или C

<400> 483

ggauucugga gaaaacucn 19

<210> 484

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z36, Z36 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z35, Z35 выбран из A, U, G или C

<400> 484

ngaguuuucu ccagaaucc 19

<210> 485

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (19)..(19)

<223> n представляет собой Z35, Z35 представляет собой A, U, G или C

<400> 485

ggauucugga gaaaacucn 19

<210> 486

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z36, Z36 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z35, Z35 выбран из A, U, G или C

<400> 486

ngaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 487

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (21)..(21)

<223> n представляет собой Z35, Z35 представляет собой A, U, G или C

<400> 487

cuggauucug gagaaaacuc n 21

<210> 488

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> неясный признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой Z36, Z36 представляет собой нуклеотид,

комплементарный Z35, Z35 выбран из A, U, G или C

<400> 488

ngaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 489

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1

<400> 489

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 490

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1

<400> 490

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 491

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2

<400> 491

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 492

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2

<400> 492

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 493

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M1

<400> 493

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 494

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M1

<400> 494

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 495

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M2

<400> 495

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 496

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M2

<400> 496

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 497

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M3

<400> 497

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 498

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M3

<400> 498

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 499

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M1

<400> 499

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 500

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M1

<400> 500

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 501

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M2

<400> 501

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 502

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M2

<400> 502

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 503

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M3

<400> 503

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 504

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M3

<400> 504

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 505

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M1S

<400> 505

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 506

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M1S

<400> 506

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 507

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M2S

<400> 507

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 508

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M2S

<400> 508

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 509

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M3S

<400> 509

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 510

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M3S

<400> 510

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 511

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M1S

<400> 511

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 512

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M1S

<400> 512

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 513

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M2S

<400> 513

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 514

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M2S

<400> 514

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 515

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M3S

<400> 515

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 516

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M3S

<400> 516

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 517

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M1P1

<400> 517

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 518

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M1P1

<400> 518

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 519

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M2P1

<400> 519

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 520

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M2P1

<400> 520

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 521

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M3P1

<400> 521

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 522

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M3P1

<400> 522

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 523

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M1P1

<400> 523

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 524

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M1P1

<400> 524

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 525

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M2P1

<400> 525

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 526

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M2P1

<400> 526

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 527

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M3P1

<400> 527

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 528

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M3P1

<400> 528

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 529

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M1SP1

<400> 529

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 530

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M1SP1

<400> 530

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 531

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M2SP1

<400> 531

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 532

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M2SP1

<400> 532

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 533

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi1-M3SP1

<400> 533

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 534

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi1-M3SP1

<400> 534

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 535

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M1SP1

<400> 535

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 536

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M1SP1

<400> 536

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 537

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M2SP1

<400> 537

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 538

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M2SP1

<400> 538

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 539

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIi2-M3SP1

<400> 539

cuggauucug gagaaaacuc a 21

<210> 540

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIi2-M3SP1

<400> 540

ugaguuuucu ccagaaucca guc 23

<210> 541

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIf1M1S

<400> 541

guacguggac uggauucug 19

<210> 542

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIf1M1S

<400> 542

cagaauccag uccacguacu u 21

<210> 543

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIa1M1SP

<400> 543

ggguauucuu ucaagcaau 19

<210> 544

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIa1M1SP

<400> 544

auugcuugaa agaauaccca g 21

<210> 545

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIb1M1SP

<400> 545

ggcauaaacu auaacagcu 19

<210> 546

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIb1M1SP

<400> 546

agcuguuaua guuuaugccc u 21

<210> 547

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIc1M1SP

<400> 547

gcucaagaau gccaagaaa 19

<210> 548

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIc1M1SP

<400> 548

uuucuuggca uucuugagca c 21

<210> 549

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXId1M1SP

<400> 549

gcaacaaaga cauuuaugu 19

<210> 550

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXId1M1SP

<400> 550

acauaaaugu cuuuguugca a 21

<210> 551

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIe1M1SPP

<400> 551

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 552

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIe1M1SP

<400> 552

aaagauuucu uugagauucu u 21

<210> 553

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIg1M1SP

<400> 553

auuucugggu auucuuuca 19

<210> 554

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIg1M1SP

<400> 554

ugaaagaaua cccagaaauc g 21

<210> 555

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIh1M1SP

<400> 555

caugaagggc auaaacuau 19

<210> 556

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIh1M1SP

<400> 556

auaguuuaug cccuucaugu c 21

<210> 557

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIi1M1S

<400> 557

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 558

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIi1M1S

<400> 558

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 559

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для L10-siFXIi1M1SP

<400> 559

ggauucugga gaaaacuca 19

<210> 560

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для L10-siFXIi1M1SP

<400> 560

ugaguuuucu ccagaaucca g 21

<210> 561

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для siFXIe1

<400> 561

gaaucucaaa gaaaucuuu 19

<210> 562

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для siFXIe1

<400> 562

aaagauuucu uugagauuc 19

<210> 563

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая последовательность для NC

<400> 563

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 564

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая последовательность для NC

<400> 564

acgugacacg uucggagaac u 21

<210> 565

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> The target sequence f или siFXIe1

<400> 565

gaatctcaaa gaaatcttt 19

<210> 566

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для FXI человека

<400> 566

tcacggcgga atcaccatc 19

<210> 567

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для FXI человека

<400> 567

tgtcctattc actcttggca gt 22

<210> 568

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для GAPDH человека

<400> 568

ggtcggagtc aacggattt 19

<210> 569

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для GAPDH человека

<400> 569

ccagcatcgc cccacttga 19

<210> 570

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для FXI человека

<400> 570

tcacggcgga atcaccatc 19

<210> 571

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для FXI человека

<400> 571

tgtcctattc actcttggca gt 22

<210> 572

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для GAPDH мыши

<400> 572

aactttggca ttgtggaagg gctc 24

<210> 573

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для GAPDH мыши

<400> 573

tggaagagtg ggagttgctg ttga 24

<210> 574

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для FXI мыши

<400> 574

gccctgttaa aactggaatc agc 23

<210> 575

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для FXI мыши

<400> 575

cgtttctatc tcctttggaa ggc 23

<210> 576

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для GAPDH мыши

<400> 576

tgcaccacca actgcttag 19

<210> 577

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для GAPDH мыши

<400> 577

ggatgcaggg atgatgttc 19

<---

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована в медицине. Изобретение раскрывает новые миРНК, способные к ингибированию экспрессии гена фактора свертывания крови XI (FXI) в плазме, а также конъюгаты на их основе. Изобретение может быть использовано при получении лекарственного средства, применяемого для лечения или предотвращения тромботических заболеваний и ишемических инсультов. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 пр., 17 табл.

1. МиРНК, способная ингибировать экспрессию гена фактора свертывания крови XI, содержащая смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем каждый нуклеотид в миРНК независимо представляет собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, причем смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность I и антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность II; нуклеотидная последовательность I и нуклеотидная последовательность II обратно комплементарны, что позволяет образовывать двухцепочечную область;

причем смысловая цепь и антисмысловая цепь имеют одинаковую или разную длину, где смысловая цепь содержит 19-23 нуклеотида в длину и антисмысловая цепь содержит 19-26 нуклеотидов в длину; и

нуклеотидная последовательность I содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 303, и нуклеотидная последовательность II содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 304:

5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ₂₃-3' (SEQ ID NO: 303);

5'-Z₂₄AGAAUCCAGUCCACGUAC-3' (SEQ ID NO: 304),

в которых Z₂₃ выбран из A, U, G или C и Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид на 5’-конце антисмысловой цепи, комплементарный Z₂₃;

предпочтительно Z₂₃ представляет собой G и Z₂₄ представляет собой C.

2. МиРНК по п. 1, в которой смысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность III, антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность IV и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV независимо имеют длину от 1 до 4 нуклеотидов;

нуклеотидная последовательность III соединена с 5’-концом нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303;

нуклеотидная последовательность IV соединена с 3’-концом нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304;

и нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV имеют одинаковую длину и являются обратно комплементарными;

предпочтительно нуклеотидная последовательность I имеет ту же длину, что и нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 303, и отличается от нее не более чем 3 нуклеотидами; и

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 1 нуклеотид и основание нуклеотидной последовательности III представляет собой A; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 2 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой GA; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 3 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой CGA; или

нуклеотидная последовательность III и нуклеотидная последовательность IV обе имеют длину 4 нуклеотида и в направлении от 5’-конца к 3’-концу состав оснований нуклеотидной последовательности III представляет собой UCGA.

3. МиРНК по п. 1 или 2, в которой антисмысловая цепь дополнительно содержит нуклеотидную последовательность V; нуклеотидная последовательность V имеет длину 1-3 нуклеотида и соединена с 3’-концом антисмысловой цепи с образованием 3’-липкого конца антисмысловой цепи;

предпочтительно нуклеотидная последовательность V имеет длину 2 нуклеотида;

предпочтительно нуклеотидная последовательность V представляет собой 2 последовательных тиминовых дезоксирибонуклеотида или 2 последовательных урацильных рибонуклеотида; или нуклеотидная последовательность V является комплементарной нуклеотидам в соответствующих положениях целевой мРНК;

более предпочтительно смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 305, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 306:

5'-GUACGUGGACUGGAUUCUZ₂₃-3' (SEQ ID NO: 305);

5'-Z₂₄AGAAUCCAGUCCACGUACUC-3' (SEQ ID NO: 306),

или смысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 307, и антисмысловая цепь миРНК содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 308:

5'-GAGUACGUGGACUGGAUUCUZ₂₃-3' (SEQ ID NO: 307);

5'-Z₂₄AGAAUCCAGUCCACGUACUCGA-3' (SEQ ID NO: 308),

в которых Z₂₄ представляет собой первый нуклеотид с 5'-конца антисмысловой цепи; Z₂₃ выбран из A, U, G или C и Z₂₄ представляет собой нуклеотид, комплементарный Z₂₃;

еще более предпочтительно миРНК представляет собой siFXIf1 или siFXIf2;

где смысловая цепь siFXIf1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 309, и антисмысловая цепь siFXIf1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 310:

5'-GUACGUGGACUGGAUUCUG-3' (SEQ ID NO: 309);

5'-CAGAAUCCAGUCCACGUACUC-3' (SEQ ID NO: 310);

где смысловая цепь siFXIf2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 311, и антисмысловая цепь siFXIf2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 312:

5'-GAGUACGUGGACUGGAUUCUG-3' (SEQ ID NO: 311);

5'-CAGAAUCCAGUCCACGUACUCGA-3' (SEQ ID NO: 312).

4. МиРНК по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что по меньшей мере один нуклеотид в смысловой цепи или антисмысловой цепи представляет собой модифицированный нуклеотид и/или по меньшей мере одна фосфатная группа представляет собой фосфатную группу с модифицированной(ыми) группой(ами).

5. МиРНК по любому из пп. 1-4, в которой каждый нуклеотид в смысловой цепи и антисмысловой цепи независимо представляет собой модифицированный фтором нуклеотид или нуклеотид с нефторной модификацией; где «модифицированный фтором нуклеотид» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы атомом фтора; и «нуклеотид с нефторной модификацией» относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы группой, отличной от фтора, или к аналогу нуклеотида;

предпочтительно модифицированные фтором нуклеотиды расположены в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, и нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, по меньшей мере, нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу, по меньшей мере, нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304, представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды;

более предпочтительно в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 или в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, в смысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 или в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304, в антисмысловой цепи представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи представляют собой нуклеотиды с нефторной модификацией;

более предпочтительно нуклеотид, образованный путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы группой, отличной от фтора, представляет собой нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из 2'-алкоксимодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных алкоксимодифицированных нуклеотидов, 2'-алкилмодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных алкилмодифицированных нуклеотидов, 2'-аминомодифицированных нуклеотидов, 2'-замещенных аминомодифицированных нуклеотидов и 2'-дезоксинуклеотидов; и аналог нуклеотида представляет собой аналог, выбранный из группы, состоящей из изонуклеотида, LNA, ENA, cET, UNA и GNA;

еще более предпочтительно каждый нуклеотид с нефторной модификацией представляет собой метокси-модифицированный нуклеотид; и метокси-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, образованному путем замещения 2'-гидроксила рибозной группы метоксигруппой.

6. МиРНК по п. 5, в которой в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 8, 9, 14 и 16 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304, в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; или

в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 5, 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304, в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; или

в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 7, 8 и 9 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 303, в смысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в смысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды; и в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеотиды в положениях 2, 6, 14 и 16 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 304, в антисмысловой цепи миРНК представляют собой модифицированные фтором нуклеотиды и нуклеотиды в остальных положениях в антисмысловой цепи миРНК представляют собой метокси-модифицированные нуклеотиды;

предпочтительно миРНК представляет собой любую из: siFXIf1-M1, siFXIf1-M2, siFXIf1-M3, siFXIf2-M1, siFXIf2-M2 и siFXIf2-M3;

где смысловая цепь siFXIf1-M1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 313, и антисмысловая цепь siFXIf1-M1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 314:

5'-GmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 313);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 314);

где смысловая цепь siFXIf1-M2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 315, и антисмысловая цепь siFXIf1-M2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 316:

5'-GmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 315);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 316);

где смысловая цепь siFXIf1-M3 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 317, и антисмысловая цепь siFXIf1-M3 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 318:

5'-GmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 317);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 318);

где смысловая цепь siFXIf2-M1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 319, и антисмысловая цепь siFXIf2-M1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 320:

5'-GmAmGmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 319);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 320);

где смысловая цепь siFXIf2-M2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 321, и антисмысловая цепь siFXIf2-M2 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 322:

5'-GmAmGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 321);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 322);

где смысловая цепь siFXIf2-M3 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 323, и антисмысловая цепь siFXIf2-M3 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 324:

5'-GmAmGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 323);

5'-CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 324); или

миРНК представляет собой любую из: siFXIf1-M1S, siFXIf1-M2S, siFXIf1-M3S, siFXIf2-M1S, siFXIf2-M2S и siFXIf2-M3S;

где смысловая цепь siFXIf1-M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 325, и антисмысловая цепь siFXIf1-M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 326:

5'-GmsUmsAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 325);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 326);

где смысловая цепь siFXIf1-M2S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 327, и антисмысловая цепь siFXIf1-M2S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 328:

5'-GmsUmsAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 327);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 328);

где смысловая цепь siFXIf1-M3S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 329, и антисмысловая цепь siFXIf1-M3S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 330:

5'-GmsUmsAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 329);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 330);

где смысловая цепь siFXIf2-M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 331, и антисмысловая цепь siFXIf2-M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 332:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 331);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 332);

где смысловая цепь siFXIf2-M2S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 333, а антисмысловая цепь siFXIf2-M2S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 334:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 333);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 334);

где смысловая цепь siFXIf2-M3S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 335, и антисмысловая цепь siFXIf2-M3S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 336:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 335);

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 336); или

миРНК представляет собой любую из: siFXIf1-M1P1, siFXIf1-M2P1, siFXIf1-M3P1, siFXIf2-M1P1, siFXIf2-M2P1, siFXIf2-M3P1, siFXIf1-M1SP1, siFXIf1-M2SP1, siFXIf1-M3SP1, siFXIf2-M1SP1, siFXIf2-M2SP1 и siFXIf2-M3SP1;

где смысловая цепь siFXIf1-M1P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 337, и антисмысловая цепь siFXIf1-M1P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 338:

5'-GmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 337);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 338);

где смысловая цепь siFXIf1-M2P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 339, и антисмысловая цепь siFXIf1-M2P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 340:

5'-GmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 339);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 340);

где смысловая цепь siFXIf1-M3P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 341, и антисмысловая цепь siFXIf1-M3P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 342:

5'-GmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 341);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCm-3' (SEQ ID NO: 342);

где смысловая цепь siFXIf2-M1P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 343, и антисмысловая цепь siFXIf2-M1P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 344:

5'-GmAmGmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 343);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 344);

где смысловая цепь siFXIf2-M2P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 345, и антисмысловая цепь siFXIf2-M2P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 346:

5'-GmAmGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 345);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 346);

где смысловая цепь siFXIf2-M3P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 347, и антисмысловая цепь siFXIf2-M3P1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 348:

5'-GmAmGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 347);

5'-P1CmAfGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmGmAm-3' (SEQ ID NO: 348);

где смысловая цепь siFXIf1-M1SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 349, и антисмысловая цепь siFXIf1-M1SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 350:

5'-GmsUmsAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 349);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 350);

где смысловая цепь siFXIf1-M2SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 351, и антисмысловая цепь siFXIf1-M2SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 352:

5'-GmsUmsAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 351);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 352);

где смысловая цепь siFXIf1-M3SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 353, и антисмысловая цепь siFXIf1-M3SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 354:

5'-GmsUmsAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 353);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsCm-3' (SEQ ID NO: 354);

где смысловая цепь siFXIf2-M1SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 355, и антисмысловая цепь siFXIf2-M1SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 356:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 355);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 356);

где смысловая цепь siFXIf2-M2SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 357, и антисмысловая цепь siFXIf2-M2SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 358:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 357);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCfAfGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 358);

где смысловая цепь siFXIf2-M3SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 359, и антисмысловая цепь siFXIf2-M3SP1 имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 360:

5'-GmsAmsGmUmAmCmGfUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 359);

5'-P1CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmUmCmsGmsAm-3' (SEQ ID NO: 360).

7. МиРНК по п. 4, отличающаяся тем, что фосфатная группа с модифицированной группой (группами) представляет собой фосфотиоатную группу, образованную путем замещения по меньшей мере одного атома кислорода в сложной фосфодиэфирной связи в фосфатной группе атомом серы;

предпочтительно фосфатная группа с модифицированной группой (группами) представляет собой фосфотиоатную группу, имеющую структуру, представленную Формулой (1)

;

Формула (1)

более предпочтительно фосфотиоатная связь присутствует в по меньшей мере одной из групп, состоящих из следующих положений:

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи;

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи;

положение между первым и вторым нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи; и

положение между вторым и третьим нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи.

8. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения тромботических заболеваний или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI, отличающаяся тем, что фармацевтическая композиция содержит эффективное количество миРНК по любому из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель;

предпочтительно массовое отношение миРНК к фармацевтически приемлемому носителю составляет 1: (1-500),

более предпочтительно массовое отношение миРНК к фармацевтически приемлемому носителю составляет 1: (1-50).

9. Конъюгат миРНК для лечения или предотвращения тромботических заболеваний или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI, содержащий миРНК по любому из пп. 1-7 и присоединенную к ней конъюгирующую группу, причем конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (308)

,

Формула (308)

где n1 представляет собой целое число от 1 до 3 и n3 представляет собой целое число от 0 до 4;

m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляют собой целые числа от 2 до 10;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄ и R₁₅ независимо друг от друга представляют собой H или выбраны из группы, состоящей из C₁-C₁₀ алкила, C₁-C₁₀ галогеналкила и C₁-C₁₀ алкокси,

R₃ представляет собой группу, имеющую структуру, представленную Формулой (A59)

,

Формула (A59)

где E₁ представляет собой OH, SH или BH₂; и Nu представляет собой миРНК;

R₂ представляет собой линейный алкилен от 1 до 20 атомов углерода в длину, причем один или более атомов углерода необязательно замещены любой одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)₂, C₂-C₁₀ алкенилен, C₂-C₁₀ алкинилен, C₆-C₁₀ арилен, C₃-C₁₈ гетероциклилен и C₅-C₁₀ гетероарилен, и при этом R₂ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: C₁-C₁₀ алкил, C₆-C₁₀ арил, C₅-C₁₀ гетероарил, C₁-C₁₀ галогеналкил, ­OC₁-C₁₀ алкил, ­OC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкил­OH, ­OC₁-C₁₀ галогеналкил, ­SC₁-C₁₀ алкил, ­SC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкил­SH, ­SC₁-C₁₀ галогеналкил, галоген, ­OH, -SH, ­NH₂, ­C₁-C₁₀ алкил­NH₂, ­N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), ­NH(C₁-C₁₀ алкил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкилфенил), ­NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, ­CO₂H, ­C(O)O(C₁-C₁₀ алкил), ­CON(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), ­CONH(C₁-C₁₀ алкил), ­CONH₂, ­NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), ­NHC(O)(фенил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(C₁-C₁₀ алкил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(фенил), ­C(O)C₁-C₁₀ алкил, ­C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, ­C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, ­OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, ­SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), ­SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и ­NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

каждый L₁ представляет собой линейный алкилен от 1 до 70 атомов углерода в длину, причем один или более атом углерода необязательно замещен любой одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)₂, C₂-C₁₀ алкенилен, C₂-C₁₀ алкинилен, C₆-C₁₀ арилен, C₃-C₁₈ гетероциклилен и C₅-C₁₀ гетероарилен, и при этом L₁ необязательно содержит любой один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из: C₁-C₁₀ алкил, C₆-C₁₀ арил, C₅-C₁₀ гетероарил, C₁-C₁₀ галогеналкил, ­OC₁-C₁₀ алкил, ­OC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкил­OH, ­OC₁-C₁₀ галогеналкил, ­SC₁-C₁₀ алкил, ­SC₁-C₁₀ алкилфенил, -C₁-C₁₀ алкил­SH, ­SC₁-C₁₀ галогеналкил, галоген, ­OH, -SH, ­NH₂, ­C₁-C₁₀ алкил­NH₂, ­N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), ­NH(C₁-C₁₀ алкил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкилфенил), ­NH(C₁-C₁₀ алкилфенил), циано, нитро, ­CO₂H, ­C(O)O(C₁-C₁₀ алкил), ­CON(C₁-C₁₀ алкил)(C₁-C₁₀ алкил), ­CONH(C₁-C₁₀ алкил), ­CONH₂, ­NHC(O)(C₁-C₁₀ алкил), ­NHC(O)(фенил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(C₁-C₁₀ алкил), ­N(C₁-C₁₀ алкил)C(O)(фенил), ­C(O)C₁-C₁₀ алкил, ­C(O)C₁-C₁₀ алкилфенил, ­C(O)C₁-C₁₀ галогеналкил, ­OC(O)C₁-C₁₀ алкил, -SO₂(C₁-C₁₀ алкил), -SO₂(фенил), -SO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил), -SO₂NH₂, ­SO₂NH(C₁-C₁₀ алкил), ­SO₂NH(фенил), -NHSO₂(C₁-C₁₀ алкил), -NHSO₂(фенил) и ­NHSO₂(C₁-C₁₀ галогеналкил);

представляет собой положение, в котором указанная группа присоединена ковалентно;

M₁ представляет собой нацеливающую группу.

10. Конъюгат миРНК по п. 9, отличающийся тем, что каждый L₁ независимо выбран из группы, состоящей из групп Формул (A1)-(A26) и любой их комбинации:

где каждый j1 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;

каждый j2 независимо представляет собой целое число от 1 до 20;

каждый R' независимо представляет собой C₁-C₁₀ алкил;

каждый Ra выбран из группы, состоящей из групп Формул (A27)-(A45) и любой их комбинации:

каждый Rb независимо представляет собой C₁-C₁₀ алкил; и

представляет собой положение, в котором группа присоединена ковалентно;

предпочтительно L₁ выбран из группы, состоящей из групп Формул (A1), (A4), (A5), (A6), (A8), (A10), (A11) и (A13) и их соединенных комбинаций;

более предпочтительно L₁ представляет собой соединенные комбинации по меньшей мере двух групп Формул (A1), (A4), (A8), (A10) и (A11);

еще более предпочтительно L₁ представляет собой соединенные комбинации по меньшей мере двух групп Формул (A1), (A8) и (A10);

или предпочтительно j1 представляет собой целое число от 2 до 10; j2 представляет собой целое число от 2 до 10; R' представляет собой C₁-C₄ алкил; Ra представляет собой одну из Формул (A27), (A28), (A29), (A30) и (A31); и Rb представляет собой C₁-C₅ алкил;

более предпочтительно j1 представляет собой целое число от 3 до 5; j2 представляет собой целое число от 3 до 5; R' представляет собой один из метила, этила и изопропила; Ra представляет собой Формулу (A27) или (A28); Rb представляет собой один из метила, этила, изопропила и бутила.

11. Конъюгат миРНК по п. 9 или 10, отличающийся тем, что L₁ имеет длину от 3 до 25 атомов;

предпочтительно L₁ имеет длину от 4 до 15 атомов;

или предпочтительно n1 представляет собой целое число от 1 до 2; n3 представляет собой целое число от 0 до 1; и n1+n3 = от 2 до 3;

или предпочтительно каждый m1, m2 и m3 независимо друг от друга представляют собой целое число от 2 до 5;

или предпочтительно m1 = m2 = m3;

или предпочтительно каждая из нацеливающих групп независимо представляет собой лиганд, который имеет аффинность к рецепторам асиалогликопротеина на поверхности гепатоцитов млекопитающего;

более предпочтительно каждая из нацеливающих групп независимо представляет собой асиалогликопротеин или сахарид;

более предпочтительно каждая из нацеливающих групп независимо выбрана из группы, состоящей из D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-трифторацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-n-бутирилгалактозамина, N-изобутирилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-трис-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюкогептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы;

еще более предпочтительно по меньшей мере одна или каждая из нацеливающих групп представляет собой галактозу или N-ацетилгалактозамин;

предпочтительно R₁₀, R₁₁, R₁₂, R ₁₃, R₁₄ и R₁₅ независимо друг от друга выбраны из H, метила и этила.

12. Конъюгат миРНК по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что группа R₂ содержит и положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, и положение, соединяющееся с атомом P в R₃;

предпочтительно в R₂ положение, соединяющееся с атомом N на азотистом остове, образует амидную связь с атомом N, а положение, соединяющееся с атомом P в R₃, образует сложную фосфоэфирную связь с атомом P;

более предпочтительно R₂ выбран из B5, B6, B5' или B6':

в которых представляет собой положение, в котором группа присоединена ковалентно;

q₂ представляет собой целое число от 1 до 10;

предпочтительно q₂ представляет собой целое число от 1 до 5.

13. Конъюгат миРНК по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что конъюгат миРНК имеет структуру, представленную Формулой (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) или (422):

,

Формула (403)

,

Формула (404)

,

Формула (405)

,

Формула (406)

,

Формула (407)

,

Формула (408)

,

Формула (409)

,

Формула (410)

,

Формула (411)

,

Формула (412)

,

Формула (413)

,

Формула (414)

,

Формула (415)

,

Формула (416)

,

Формула (417)

,

Формула (418)

,

Формула (419)

,

Формула (420)

,

Формула (421)

.

Формула (422)

14. Конъюгат миРНК по любому из пп. 9-13, отличающийся тем, что атом P в Формуле (A59) соединен с концевой областью смысловой или антисмысловой цепи миРНК; и концевая область относится к первым 4 нуклеотидам, отсчитанным от одного конца смысловой или антисмысловой цепи;

предпочтительно атом P в Формуле (A59) соединен с любым концом смысловой или антисмысловой цепи миРНК;

более предпочтительно атом P в Формуле (A59) соединен с 3'-концом смысловой цепи миРНК;

или предпочтительно атом P в Формуле (A59) соединен с положением 2', 3' или 5' нуклеотида в миРНК путем образования сложной фосфодиэфирной связи.

15. Конъюгат миРНК по п. 14, отличающийся тем, что конъюгат миРНК представляет сообой L10-siFXIf1M1S, где L10 имеет структуру, представленную в Формуле (403), и смысловая цепь siFXIf1M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 541, и антисмысловая цепь siFXIf1M1S имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 542:

5'-GmsUmsAmCmGmUmGfGfAfCmUmGmGmAmUmUmCmUmGm-3' (SEQ ID NO: 541)

5'-CmsAfsGmAmAmUfCmCmAmGmUmCmCmAfCmGfUmAmCmsUmsUm-3' (SEQ ID NO: 542).

16. Применение миРНК по любому из пп. 1-7, или фармацевтической композиции по п. 8, или конъюгата миРНК по любому из пп. 9-15 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения тромботических заболеваний или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI.

17. Способ лечения или предотвращения тромботических заболеваний или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI, включающий введение эффективного количества миРНК по любому из пп. 1-7, или фармацевтической композиции по п. 8, или конъюгата миРНК по любому из пп. 9-15 субъекту, страдающему от тромботических заболеваний или ишемического инсульта, вызванных повышенной экспрессией гена FXI.

18. Способ ингибирования экспрессии гена фактора свертывания крови XI, включающий приведение эффективного количества миРНК по любому из пп. 1-7, или фармацевтической композиции по п. 8, или конъюгата миРНК по любому из пп. 9-15 в контакт с клетками.