1. Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №62/700655, поданной 19 июля 2018 г, которая является тем самым включенной посредством ссылки во всей ее полноте.
2. Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан посредством файловой системы электронного архивирования EFS-Web EFS, от англ. electronic filing system) и тем самым является включенным посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия ASCII, созданная 16 июля 2019 г, называется 40319US_CRF_sequencelisting и имеет размер 125979 байт.
3. Предшествующий уровень техники
В настоящее время имеется существенное клиническое доказательство того, что генотерапия, включающая прямую доставку in vivo конструкций нуклеиновых кислот, которые не были упакованы в вирус или вирусоподобные частицы, - так называемых контрукций «голых» ДНК или РНК - может быть эффективной в лечении разных заболеваний. Например, было продемонстрировано, что прямая внутримышечная инъекция конструкции ДНК-плазмиды, которая экспрессирует две изоформы человеческого белка HGF (фактор роста гепатоцитов) (т.е. pCK-HGF-X7, также именуемая "VM202"), является эффективной в лечении невропатической боли. В клиническом испытании фазы II было показано, что инъекции VM202 в икроножную мышцу пациентов с диабетической периферической нейропатией значительно уменьшают боль - двое суток обработки с интервалом в две недели были достаточными для обеспечения симптоматического облегчения с улучшением качества жизни в течение 3 месяцев. Kessler et al., Annals Clin. Transl. Neurology 2(5): 465-478 (2015). Также было показано, что такая же конструкция ДНК-плазмиды является эффективной в лечении пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (ALS, от англ. amyotrophic lateral sclerosis). В клиническом испытании фазы I близкая к половине часть пациентов с ALS оставалась стабильной или демонстрировала улучшение после введения VM202 с 47%, 50% и 24% субъектов в месяцы 1, 2 и 3, соответственно, не испытывающих ни снижения, ни улучшения балла ALSFRS-R (пересмотренная шкала функционального рейтинга бокового амиотрофического склероза), указывая на физическое функционирование пациентов с ALS, что лучше, чем наблюдаемое у исторических контролен. Robert L. Sufit et al., Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontoemporal Degeneration 18: 269-278 (2017).
Однако, несмотря на недавнее одобрение двух антисмысловых олигонуклеотидных лекарственных средств для непосредственной инъекции - нусинерсена для подоболочечной инъекции и этеплирсена для внутривенной инъекции - для генотерапии человека фактически было одобрено мало конструкций голых ДНК или РНК. Таким образом, несмотря на десятилетия опыта приготовления голых нуклеиновых кислот в виде препаратов для лабораторного применения и более недавний опыт приготовления нуклеиновых кислот в виде препаратов для подходов генотерапии ex vivo, провели мало исследований по приготовлению ДНК в виде фармацевтического продукта для прямой терапевтической доставки. В частности, было мало исследований по стабильности активного ингредиента в виде нуклеиновой кислоты при разных условиях хранения или по эксципиентам, требующимся для обеспечения однородного растворения препарата для введения, или по способам уменьшения нагрузки примесей и т.д. Данные свойства являются важными для лучшей и более воспроизводимой терапевтической эффективности и безопасности лекарственных средств на основе ДНК, а также для экономически оправданной возможности масштабирования производства и распространения лекарственных средств.
Следовательно, существует потребность в приготовлении фармацевтического продукта лекарственного средства на основе голой ДНК, которое обеспечивает улучшенную стабильность, безопасность и экономическую обоснованность.
4. Краткое изложение сущности изобретения
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена новая лиофилизированная фармацевтическая композиция, которая поддерживает стабильность конструкции ДНК (например, плазмиды) во время лиофилизации. В частности, данный препарат уменьшает конформационное изменение конструкций ДНК во время лиофилизации от более стабильной суперспирализованной формы до менее стабильной открытой кольцевой и линейной формы. Данный новый лиофилизированный препарат дополнительно обеспечивает однородное растворение конструкций ДНК в фармацевтически приемлемом растворе, обеспечивая полное извлечение активных ингредиентов, минимизацию частичной потери эффективности и обеспечение введения активных ингредиентов точным и единообразным способом. Кроме того, новый лиофилизированный препарат дает однородный и первоклассный вид осадка после лиофилизации, таким образом, делая возможной визуальную проверку качества лекарственного средства на основе ДНК.
В некоторых воплощениях данный новый лиофилизированный препарат содержит плазмидную ДНК, где данную фармацевтическую композицию получают лиофилизацией жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды; b. калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 9,0; с. маннит в концентрации в интервале от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. % и е. NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %. Первую плазмиду можно выбрать из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Еа, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализоваиной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 80% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после 30 минут после растворения, где лиофилизированную фармацевтическую композицию хранили при 40°С в течение 10 недель перед растворением.
В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 90% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 92,5% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 95% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмидную ДНК в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит вторую плазмидную ДНК в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 5 мМ до 15 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации с интервале от 7,5 мМ до 12,5 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 9 мМ до 11 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации 10 мМ.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 1,5 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 2 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации 2 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации в интервале от 0,75 масс./об. % до 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации в интервале от 0,9 масс./об. % до 1,0 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,75 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,6 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации от 0,4 масс./об. % до 0,5 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %.
Некоторые воплощения настоящего изобретения относятся к лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, где данную фармацевтическую композицию получают осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды в концентрации 0,5 мг/мл; b. 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0; с. маннит в концентрации 2 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. % и е. NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %, где по меньшей мере 95% плазмидной ДНК является суперспирализованной и по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Еа. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к растворенной композиции, полученной растворением лиофилизированной фармацевтической композиции в воде.
В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм меньше, чем 0,002. В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм составляет 0,001 или меньше, чем 0,001. В некоторых воплощениях светопоглощение измеряют в сутки растворения. В некоторых воплощениях светопоглощение растворенной композиции при 450 нм измеряют после хранения лиофилизированной фармацевтической композиции в течение 10 недель.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, в разовой дозе, где данную фармацевтическую композицию получают осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая содержит перед лиофилизацией: а. ДНК первой плазмиды в концентрации 0,5 мг/мл; b. 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0; с. маннит в концентрации 2 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. % и е. NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %, где данная лиофилизированная фармацевтическая композиция находится во флаконе, и данный флакон содержит суммарно 2,5 мг плазмидной ДНК. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, рТх-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-Х7. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ес. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Еа. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК второй плазмиды, где данная вторая плазмида выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к растворенной композиции, полученной растворением лиофилизированной фармацевтической композиции.
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способу получения лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей плазмидную ДНК, причем данный способ включает: предоставление жидкой композиции, содержащей: а. ДНК первой плазмиды; b. калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 9,0; с. маннит в концентрации в интервале от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %; d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. % и е. NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %; и осуществление лиофилизации данной жидкой композиции, получая, посредством этого, лиофилизированную фармацевтическую композицию. Первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, рТх-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой VM202. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-HGF-X7. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X6. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ec. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pTx-IGF-1Ea. В некоторых воплощениях первая плазмида представляет собой pCK-SDF-1α.
В некоторых воплощениях стадия осуществления лиофилизации включает: (i) загрузку жидкой композиции; (ii) замораживание; (iii) первичную сушку и (iv) вторичную сушку.
В некоторых воплощениях стадия загрузки осуществляется при 5°С.
В некоторых воплощениях стадия замораживания проводится при повышении температур в интервале от -50°С до -20°С.
В некоторых воплощениях стадия первичной сушки проводится при -20°С.
В некоторых воплощениях стадия вторичной сушки проводится при повышении температур в интервале от -20°С до 20°С.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК в жидкой композиции является супе рспирализова иной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 97% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 98% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 92,5% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях по меньшей мере 95% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции.
В некоторых воплощениях по меньшей мере 80% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения лиофилизированной фармацевтической композиции, где данную лиофилизированную фармацевтическую композицию хранили при 40°С в течение 10 недель перед растворением.
В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 90% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 92,5% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции. В некоторых воплощениях лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 95% от общего количества суперспирализованной ДНК в жидкой композиции.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит плазмиду в концентрации в интервале от 0,1 до 1 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации в интервале от 0,25 до 0,75 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации в интервале от 0,4 до 0,6 мг/мл. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит первую плазмиду в концентрации 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 5 мМ до 15 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 7,5 мМ до 12,5 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 9 мМ до 11 мМ. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации 10 мМ.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 1,5 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 2 масс./об. % до 3 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит маннит в концентрации 2 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации больше, чем 0,75 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации больше, чем 0,9 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации 1,0 масс./об. %.
В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,75 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 масс./об. % до 0,6 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,4 масс./об. % до 0,5 масс./об. %. В некоторых воплощениях жидкая композиция содержит NaCl в концентрации 0,45 масс./об. %.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания, включающему стадию: введения эффективного количества растворенного лекарственного средства пациенту с заболеванием, где данное растворенное лекарственное средство получают посредством растворения лиофилизированной фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию растворения лиофилизированной фармацевтической композиции в воде, получая, посредством этого, растворенное лекарственное средство.
В некоторых воплощениях светопоглощение растворенного лекарственного средства при 450 нм (А450) составляет меньше, чем 0,003. В некоторых воплощениях светопоглощение составляет меньше, чем 0,002. В некоторых воплощениях светопоглощение составляет 0,001 или меньше, чем 0,001.
В некоторых воплощениях данное заболевание выбрано из группы, состоящей из нейропатии, ишемического заболевания, мышечной атрофии, сосудистого заболевания и сердечного заболевания. В некоторых воплощениях данное заболевание выбрано из ишемического заболевания конечностей, диабетической периферической нейропатии (DPN, от англ. diabetic peripheral neuropathy), бокового амиотрофического склероза (ALS), периферического сосудистого заболевания и заболевания коронарных артерий (CAD, от англ. coronary artery disease).
В некоторых воплощениях стадия введения включает внутримышечную инъекцию растворенного лекарственного средства.
5. Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 предложен типичный результат от капиллярного электрофореза (СЕ, от англ. capillary electrophoresis) VM202. Данный результат показывает два пика - один для суперспирализованной формы и другой для открытой кольцевой формы.
На Фиг. 2A-2D предложены результаты анализа ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) при условиях, близких к условиям окружающей среды, для жидкого состояния разных препаратов из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе со стадией отжига или без нее. В частности, на Фиг. 2А приведен результат для KP8M2SN, на Фиг. 2В приведен результат для KP8MS3N, на Фиг. 2С приведен результат для KP8MT3N, и на Фиг. 2D приведен результат для контроля. На графиках отмечены температура стеклования (Tg'), температура эвтектического плавления (Те) и температура расстеклования (Td).
На Фиг. 3 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 1-го раунда цикла лиофилизации KP8M2SN, KP8MS3N, KP8MT3N и контроля.
На Фиг. 4А-4С приведены изображения флаконов, содержащих разные препараты от 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, перед лиофилизацией (Фиг. 4А), после лиофилизации (Фиг. 4В) и после растворения (Фиг. 4С).
На Фиг. 5 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) препаратов VM202 от 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 6A-6D приведены результаты анализа ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды, для жидкого состояния разных препаратов из 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе со стадией отжига или без нее. В частности, на Фиг. 6А приведен результат для 4MSN, на Фиг. 6В приведен результат для 3MSN, на Фиг. 6С приведен результат для 2MSN, и на Фиг. 6D приведен результат для контроля.
На Фиг. 7 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 2-го раунда цикла лиофилизации первого набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля.
На Фиг. 8А-8С приведены изображения флаконов, содержащих первый набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, перед лиофилизацией (Фиг. 8А), после лиофилизации (Фиг. 8В) и после растворения (Фиг. 8С).
На Фиг. 9 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) первого набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 10 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время 2-го раунда цикла лиофилизации второго набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля.
На Фиг. 11А-11В приведены изображения флаконов, содержащих второй набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль, от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией (Фиг. 11А) и после лиофилизации (Фиг. 11В). На Фиг. 11С-11F показаны изображения флаконов, содержащих второй набор 4MSN (Фиг. 11 С), 3MSN (Фиг. 11D), 2MSN (Фиг. 11Е) и контроль (Фиг. 11F) после растворения.
На Фиг. 12 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) второго набора 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля от второго 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 13 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время цикла лиофилизации 2MSN и 2M1SN.
На Фиг. 14А-14В приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN и 2M1SN перед лиофилизацией (Фиг. 14А) и после лиофилизации (Фиг. 14В). На Фиг. 14C-14D показаны изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 14С) и 2M1SN (Фиг. 14D) после растворения.
На Фиг. 15 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN перед лиофилизацией или после растворения.
На Фиг. 16А-16В приведены изображения флаконов, содержащих 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль, после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 16А) или 7 суток (Фиг. 16В) после растворения в Т равно 0.
На Фиг. 17А-17В приведены результаты от капиллярного электрофореза (СЕ) 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 17А) или 7 суток (Фиг. 17В).
На Фиг. 18А-18С приведены изображения флаконов, содержащих 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль до и после растворения лиофилизированного препарата, хранящегося в течение 10 недель при 25°С (Фиг. 18А), при 40°С (Фиг. 18В) или при 5°С (Фиг. 18С).
На Фиг. 19 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля после хранения при 40°С в течение 10 недель.
На Фиг. 20А-20С приведена динамика изменений процентных содержаний суперспирализованной ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 20А), 25°С (Фиг. 20В) или 40°С (Фиг. 20С).
На Фиг. 21А-21С приведена динамика изменений процентных содержаний открытой кольцевой ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 21А), 25°С (Фиг. 21В) или 40°С (Фиг. 21С).
На Фиг. 22А-22В приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 22А) или 2M1SN (Фиг. 22В), хранящихся при 25°С в течение 3 суток после растворения. На Фиг. 22C-22D приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN (Фиг. 22С) или 2M1SN (Фиг. 22D), хранящихся при 25°С в течение 7 суток после растворения.
На Фиг. 23А-23В приведены результаты от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN после хранения при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 23А) или 7 суток (Фиг. 23В).
На Фиг. 24А-24С приведены изображения флаконов, содержащих 2MSN или 2M1SN до или после растворения лиофилизированного препарата, хранящегося в течение 10 недель при 25°С (Фиг. 24А), при 40°С (Фиг. 24В) или при 5°С (Фиг. 24С).
На Фиг. 25 приведен результат от капиллярного электрофореза (СЕ) 2MSN и 2M1SN после хранения при 40°С в течение 10 недель.
На Фиг. 26А-26С приведена динамика изменений процентных содержаний суперспирализованной ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 2MSN и 2M1SN при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 26А), 25°С (Фиг. 26В) или 40°С (Фиг. 26С).
На Фиг. 27А-27С приведена динамика изменений процентных содержаний открытой кольцевой ДНК, измеренных на основе результатов капиллярного электрофореза (СЕ) для 2MSN и 2M1SN при хранении данных препаратов при 5°С (Фиг. 27А), 25°С (Фиг. 27В) или 40°С (Фиг. 27С).
На Фиг. 28 приведена динамика изменения температур (ордината слева) и давлений (ордината справа) во время цикла лиофилизации, использованного в Примере 2.
На Фиг. 29 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 30 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 31 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 32 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 33 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 34 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 2 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 35 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4 и F5 Примера 2.
На Фиг. 36 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 37 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 38 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 39 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 40 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 41 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 42 приведены изображения флаконов, содержащих F7 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 43 приведены изображения флаконов, содержащих F8 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 44 приведены изображения флаконов, содержащих F9 Примера 3 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 45 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 и F9 Примера 3 (ТАБЛИЦА 40).
На Фиг. 46 приведены изображения флаконов, содержащих F1 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 47 приведены изображения флаконов, содержащих F2 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 48 приведены изображения флаконов, содержащих F3 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 49 приведены изображения флаконов, содержащих F4 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 50 приведены изображения флаконов, содержащих F5 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 51 приведены изображения флаконов, содержащих F6 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 52 приведены изображения флаконов, содержащих F7 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 53 приведены изображения флаконов, содержащих F8 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 54 приведены изображения флаконов, содержащих F9 Примера 4 до или после растворения лиофилизированного препарата относительно белого фона (слева) или черного фона (справа).
На Фиг. 55 приведен результат капиллярного электрофореза (СЕ) F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 и F9 Примера 4 (ТАБЛИЦА 44).
На данных Фиг. описаны разные воплощения настоящего изобретения лишь в целях иллюстрации. Специалист в данной области легко поймет из следующего обсуждения, что можно применять альтернативные воплощения структур и способов, проиллюстрированных в данном документе, без отступления от принципов изобретения, описанного в данном документе.
6. Подробное описание изобретения
6.1 Определения
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение. Следующие термины в том виде, в котором они используются в данном документе, имеют значения, приписываемые им ниже.
Термин «жидкая композиция» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к композиции в жидкой форме, которая содержит плазмидную ДНК и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, и которая может быть лиофилизированной для получения лиофилизированной фармацевтической композиции, как описано в данном документе.
Термин «лиофилизированная композиция» или «лиофилизированная фармацевтическая композиция» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к любой композиции или фармацевтической композиции в сухой форме, которую получают лиофилизацией. Термины «осуществление лиофилизации» или «лиофилизация» имеют значения, понятные специалистам в данной области, относящиеся в широком смысле к любому способу замораживания, с последующей дегидратацией в замороженном состоянии под вакуумом. Лиофилизированные композиции могут быть растворены для инъекции.
Термин «растворенный» или «растворение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к восстановлению исходной формы вещества, ранее измененной для консервации и хранения, как, например, к регидрации, т.е. восстановлению жидкого состояния препарата плазмидной ДНК, который был ранее лиофилизирован и хранился. Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению можно растворять в любом водном растворе, который дает стабильный раствор, подходящий для фармацевтического введения. Такие водные растворы, включают стерильную воду, Tris-EDTA (ТЕ), фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), Tris буфер и нормальный физиологический раствор, но не ограничиваются ими.
Термин «выделенный» или «биологически чистый» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к веществу, которое по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают данное вещество в том виде, в котором оно находится в его природном состоянии. Таким образом, выделенная плазмидная ДНК в том виде, в котором она используется в данном документе, по существу не содержит компонентов, обычно ассоциированных с плазмидной ДНК в ее окружении in situ, таких как бактериальные белки, липиды или компоненты клеточной стенки.
Термин «VM202» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к плазмидной ДНК, также именуемой pCK-HGF-X7, содержащей вектор pCK (SEQ ID NO 5) и HGF-X7 (SEQ ID NO 13), клонированный в вектор pCK. VM202 была депонирована согласно условиям Будапештского соглашения в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) под номером доступа KCCM-10361 12 марта 2002 г.
Термин «изоформы HGF» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности встречающегося в природе полипептида HGF у животного. Данный термин включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной любому полноразмерному полипептиду HGF дикого типа, и включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной встречающемуся в природе аллельному варианту HGF, варианту, образовавшемуся в результате сплайсинга, или варианту, образовавшемуся в результате делеции. Изоформы HGF, предпочтительные для применения в настоящем изобретении, включают две или более чем две изоформы, выбранные из группы, состоящей из полноразмерного HGF (fIGF) (синонимично fHGF), варианта HGF с делецией (dHGF), NK1, NK2 и NK4. Согласно более предпочтительному воплощению настоящего изобретения изоформы HGF, используемые в способах, описанных в данном документе, включают fIHGF (SEQ ID NO 1) и dHGF (SEQ ID NO 2).
Термины «человеческий flHGF», «flHGF» и «fHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия белка, состоящего из аминокислот 1-728 человеческого белка HGF. Последовательность fIHGF приводится в SEQ ID NO 1.
Термины «человеческий dHGF» и «dHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия образовавшегося в результате делеции варианта белка HGF, продуцированного альтернативным сплайсингом человеческого гена HGH. В частности, «человеческий dHGF» или «dHGF» относится к человеческому белку HGF с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом домене «двойная петля» альфа-цепи из полноразмерной последовательности HGF. Человеческий dHGF имеет 723 аминокислоты в длину. Аминокислотная последовательность человеческого dHGF приводится в SEQ ID NO 2.
Термин «изоформа IGF-1 (инсули но подобный фактор роста-1)» или «изоформа человеческого IGF-1» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе полипептидов пре-про-IGF1 человека или их аллельному варианту, варианту, образующемуся в результате сплайсинга, или варианту, образующемуся в результате делеции. Встречающиеся в природе полипептиды пре-про-IGF1 включают изоформы Класса I, Ec (SEQ ID NO 25); Класса II, Еа (SEQ ID NO 27); Класса I, Eb (SEQ ID NO 29) и Класса I, Ea (SEQ ID NO 23).
Термины "Изоформа #1," "Изоформа класса I, Ec", "Изоформа класса I, IGF-1Ec" или "Класс I, IGF-1Ec" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 25.
Термины "Изоформа #2," "Изоформа класса II, Еа", "Изоформа класса II, IGF-1 Еа" или "Класс II, IGF-1 Еа" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 27.
Термины "Изоформа #3," "Изоформа класса I, Eb", "Изоформа класса I, IGF-1 Eb" или "Класс I, IGF-1 Eb" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 29.
Термины "Изоформа #4," "Изоформа класса I, Еа", "Изоформа класса I, IGF-1 Еа" или "Класс I, IGF-1 Еа" используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 23.
Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к по меньшей мере одному из следующих: (а) подавление симптома заболевания; (b) облегчение симптома заболевания; и (с) устранение симптома заболевания.
В некоторых воплощениях композиция по настоящему изобретению может лечить симптом, ассоциированный с нейропатией, ишемическим заболеванием, мышечной атрофией или сердечным заболеванием.
Термин «терапевтически эффективная доза» или «эффективное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к дозе или количеству, которое продуцирует желательный эффект, для которого его вводят. В контексте настоящих способов терапевтически эффективное количество представляет собой эффективное количество для лечения симптома заболевания. Точная доза или количество будет зависеть от цели лечения и будет устанавливаемым обычным специалистом в данной области с использованием известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Термин «достаточное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к достаточному количеству для получения желательного эффекта.
Термин «вырожденная последовательность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая может транслироваться с получением идентичной аминокислотной последовательности относительно последовательности, транслируемой от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты.
6.2. Другие интерпретируемые условные обозначения
Понятно, что интервалы, перечисленные в данном документе, представляют собой сокращение для всех значений в пределах данного интервала, включая перечисленные конечные точки. Например, понятно то, что интервал от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или под интервал из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50.
Если не указано иное, ссылка на соединение, которое имеет один или более чем один стереоцентр, подразумевает каждый стереоизомер и все комбинации его стереоизомеров.
6.3. Лиофилизированная фармацевтическая композиция
В первом аспекте представлена лиофилизированная фармацевтическая композиция. Данная лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит плазмидную ДНК и получается осуществлением лиофилизации жидкой композиции, которая перед лиофилизацией содержит:
a. плазмидную ДНК первой плазмиды;
b. калий-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 9,0;
c. маннит в концентрации от 0 масс./об. % до 3 масс./об. %;
d. сахарозу в концентрации больше, чем 0,5 масс./об. % и меньше, чем 1,1 масс./об. %; и
e. NaCl в концентрации от 0,1 масс./об. % до 0,9 масс./об. %.
Данная первая плазмида может быть выбрана из группы, состоящей из VM202, pTx-HGF-X7, pTx-IGF-1Ec, pTx-IGF-1Ea, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X10 и pCK-SDF-1α.
6.3.1. Плазмидная ДНК
Данная жидкая композиция включает плазмидную ДНК, которая представляет собой активный ингредиент фармацевтической композиции. Данная плазмидная ДНК может включать генетический материал для генотерапии. В частности, данная плазмидная ДНК может кодировать генетический продукт, который может корректировать функцию дефектного гена или транскрипта или кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды, или РНК (кодирующую или некодирующую; например, миРНК (малая интерферирующая РНК), кшРНК (короткая шпилечная РНК), микро-РНК и их антисмысловые эквиваленты (например, антагоMiR)). Препарат, содержащий любую плазмидную ДНК, известную в данной области для применения в генотерапии, попадает в пределы объема настоящего изобретения.
Данная жидкая композиция может содержать плазмидную ДНК в концентрации, которая обеспечивает последующее растворение лиофилизированной фармацевтической композиции с предоставлением эффективной концентрации для терапевтического применения растворенного лекарственного средства. Концентрация плазмидной ДНК может корректироваться, в зависимости от разных факторов, включающих количество композиции, подлежащее доставке, заболевания, подлежащие лечению, возраст и массу субъекта, способ доставки и путь введения, и т.д.
В частности, данная жидкая композиция может включать плазмидную ДНК в концентрации от 0,1 до 5 мг/мл, от 0,1 до 3 мг/мл, от 0,1 до 2 мг/мл, от 0,1 до 1 мг/мл, от 0,25 до 0,75 мг/мл, от 0,4 до 0,6 мг/мл или в концентрации 0,5 мг/мл.
Данная плазмидная ДНК может представлять собой полинуклеотид длины от 3000 до 15000 пар оснований, от 3000 до 10000 пар оснований, от 3000 до 9000 пар оснований, от 3000 до 8000 пар оснований, от 3000 до 7000 пар оснований, от 3000 до 6000 пар оснований, от 3000 до 5000 пар оснований, от 4000 до 8000 пар оснований, от 4000 до 7500 пар оснований, от 4000 до 6000 пар оснований, от 6000 до 9000 пар оснований или от 7000 до 8000 пар оснований. Данная плазмидная ДНК может представлять собой полинуклеотид длины, которая попадает в пределы предложенного в данном документе объема.
6.3.1.1. вектор
Плазмидная ДНК, используемая в способах по настоящему изобретению, типично содержит вектор с одной или более чем одной регуляторной последовательностью (например, промотор или энхансер), связанной функциональным образом с экспрессируемыми последовательностями. Данная регуляторная последовательность регулирует экспрессию белка (например, одной или более чем одной изоформы HGF или IGF-1).
Предпочтительным является то, что полинуклеотид, кодирующий белок, связан функциональным образом с промотором в экспрессионной конструкции. Термин «связанный функциональным образом» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор, сигнальная последовательность или чип с сайтами связывания транскрипционного фактора) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
В типичных воплощениях промотор, связанный с полинуклеотидом, является функциональным предпочтительно в животных клетках, более предпочтительно в клетках млекопитающих, для контроля транскрипции полинуклеотида, включая промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих или из вирусов млекопитающих, например, промотор CMV (цитомегаловирус), поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса осповакцины, промотор SV40, промотор tk HSV (вирус простого герпеса), промотор RSV (вирус саркомы Рауса), промотор фактора элонгации 1-альфа (EFI альфа), промотор металлотионеина, промотор бета-актина, промотор гена человеческого IL-2 (интерлейкин-2), промотор гена человеческого IFN (интерферон), промотор гена человеческого IL-4, промотор гена человеческого лимфотоксина и промотор гена человеческого GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирущий фактор), но не ограничиваясь ими. Более предпочтительно полезный в данном изобретении промотор представляет собой промотор, происходящий из IE (немедленный ранний) гена человеческого CMV (hCMV) или промотор EFI альфа, наиболее предпочтительно промотор/энхансер, происходящий из гена IE hCMV, и 5'-UTR (нетранслируемая область), содержащая всю последовательность последовательности экзона 1 и экзона 2, охватывающей последовательность непосредственно перед инициирующим кодоном ATG.
Экспрессионная кассета, используемая в данном изобретении, может содержать последовательность полиаденилирования, например, включающую терминатор коровьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), последовательность полиаденилирования, происходящую из SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), полиА ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека) (Klasens, В.I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26: 1870-1876 (1998)), полиА β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49: 399-406 (1987)), полиА TK HSV (Cole, C.N. and T.P. Stacy, Mol. Cell. 5 Biol. 5: 2104-2113 (1985)) или полиА вируса полиомы (Batt, D. Band G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)), но не ограничивающуюся ими.
В предпочтительных в настоящее время воплощениях вектор представляет собой pCK, рСР, pVAXI, рТх или pCY. В особенно предпочтительных воплощениях данный вектор представляет собой pCK, подробности о котором могут быть найдены в WO 2000/040737 и Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 230-235 (2000), которые обе включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Е. coli, трансформированную pCK (Тор10-pCK), депонировали в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) согласно условиям Будапештского соглашения 21 марта 2003 г. (№ доступа: KCCM-10476). Е. coli, трансформированную pCK-VEGF165 (т.е. вектор pCK с кодирующей последовательностью VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) - Тор10-pCK/VEGF165'), депонировали в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) согласно условиям Будапештского соглашения 27 декабря 1999 г. (№ доступа: KCCM-10179).
Вектор pCK конструируется таким образом, что экспрессия гена, например, гена HGF или гена IGF-1, регулируется под энхансером/промотором человеческого цитомегаловируса (HCMV), как подробно раскрыто в Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737, которые обе включены посредством ссылки во всей их полноте. Вектор pCK использовали для клинических испытаний на человеческом организме, и подтвердили его безопасность и эффективность (Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)).
В других предпочтительных воплощениях данный вектор представляет собой рТх (SEQ ID NO 15) - плазмидный вектор, полученный из pCK. рТх был получен двумя последовательными циклами мутагенеза pCK. Первую кампанию делетацио иного мутагенеза проводили для удаления ненеобходимой последовательности между геном устойчивости к канамицину и ColE1 pCK. В частности, делеционный ПЦР-мутагенез проводили с использованием первой пары праймеров (SEQ ID NO: 17 и 18). Делецию 228 пар оснований между геном устойчивости к канамицину и ColE1 подтверждали секвенированием плазмиды. Затем проводили вторую кампанию делетационного мутагенеза с использованием второй пары праймеров (SEQ ID NO: 19 и 20) для оптимизации размера последовательности интрона HCMV. Последовательность интрона HCMV (421 пар оснований) между экзоном 1 и экзоном 2 IE1 подвергали делеции, и данную делецию подтверждали секвенированием.
6.3.1.2. плазмидная ДНК, кодирующая человеческий HGF
В некоторых воплощениях плазмидная ДНК кодирует человеческий HGF или его вариант.
Фактор роста гепатоцитов (HGF) предсталяет собой гепаринсвязывающий гликопротеин, также известный как фактор рассеивания или гепатопоэтин-А. Эндогенный ген, кодирующий человеческий HGF, локализуется в хромосоме 7q21.1 и содержит 18 экзонов и 17 интронов (Seki Т., et al., Gene 102: 213-219 (1991)). Транскрипт примерно в 6 т.п.н. транскрибируется от гена HGF, и затем от него синтезируется полипептидный предшественник HGF (fIHGF), состоящий из 728 аминокислот. Одновременно полипептид предшественника dHGF, состоящий из 723 аминокислот, также синтезируется альтернативным сплайсингом гена HGF. Биологически неактивные предшественники могут превращаться в активные формы связанного дисульфидом гетеродимера посредством протеазы в сыворотке. В данных гетеродимерах альфа цепь, имеющая высокую молекулярную массу, образует четыре домена «двойная петля» и N-концевую шпиль ко подобную предактивационную пептидную область плазминогена. Домены «двойная петля» тройной связанной дисульфидами петлевой структуры, состоящей из примерно 80 аминокислот, могут играть важную роль во взаимодействии белок-белок. Низкомолекулярная бета-цепь образует неактивный домен, подобный сериновой протеазе. dHGF, состоящий из 723 аминокислот, представляет собой полипептид с делецией пяти аминокислот в 1-ом домене «двойная петля» альфа-цепи, т.е. F, L, Р, S и S.
HGF имеет разные биологические функции, например, 1) индуцирование эпителиальных клеток в трубчатую структуру; 2) стимулирование васкуляризации от эндотелиальных клеток in vitro и in vivo; 3) регенерация печени и почки, благодаря его антиапоптозной активности; 4) органогенез почки, яичника и яичка; 5) обеспечение контроля остеогенеза; 6) стимулирование роста и дифференциации эритроидных гематопоэтических клеток-предшественников; и 7) спраутинг аксонов нейронов (Stella, М.С. and Comoglio, P.М., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31: 1357-1362 (1999)). На основе данных разных функций HGF или ген, кодирущий HGF или его вариант, может быть разработан в качестве терапевтического средства.
На самом деле, разработали плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого HGF и использовали для лечения разных заболеваний, как описано в патентах США №7812146, 8338385 и 8389492, и публикациях США №20140296142 и 20160250291, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Данные плазмиды можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия.
В частности, данная плазмида может экспрессировать две или более чем две изоформы HGF посредством включения последовательности регуляции экспрессии для каждой последовательности, кодирующей изоформу (CDS, от англ. coding sequence). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит внутренний участок посадки рибосомы (IRES, от англ. internal ribosomal entry site) между двумя кодирующими последовательностями, например, в следующем порядке: (1) последовательность регуляции экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспрессию двух интресующих генов от одной конструкции. В других воплощениях для индукции экспрессии более чем одной изоформы HGF у субъекта, которому осуществляется введение, вместе используют целый ряд конструкций, причем каждая кодирует одну изоформу HGF.
В предпочтительных воплощениях данных способов используется конструкция, которая одновременно экспрессирует два или более чем два разных типа изоформ HGF - т.е. fIHGF и dHGF - посредством включения сайта альтернативного сплайсинга. Ранее в патенте США №7812146, включенном в данный документ посредством ссылки, продемонстрировали то, что конструкция, кодирующая две изоформы HGF (fIHGF и dHGF) через альтернативный сплайсинг, имеет значительно более высокую (почти в 250 раз большую) эффективность экспрессии, чем конструкция, кодирующая одну изоформу HGF (либо fIHGF, либо dHGF). В типичных воплощениях данная конструкция содержит (i) первую последовательность, содержащую экзоны 1-4 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 3), или вырожденную последовательность первой последовательности; (ii) вторую последовательность, содержащую интрон 4 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 6) или фрагмент второй последовательности; и (iii) третью последовательность, содержащую экзоны 5-18 человеческого гена HGF (SEQ ID NO 4), или вырожденную последовательность данной третьей последовательности. Из данной конструкции могут быть получены две изоформы HGF (fIHGF и dHGF) посредством альтернативного сплайсинга между экзоном 4 и экзоном 5.
В некоторых воплощениях данная конструкция содержит полную последовательность интрона 4. В некоторых воплощениях данная конструкция содержит фрагмент интрона 4. В предпочтительных воплощениях данная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 7 - SEQ ID NO 14. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO 7 соответствует 7113 п. н. полинуклеотиду, кодирующему fIHGF и dHGF, и включая полную последовательность интрона 4. Нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8-14 соответствуют полинуклеотидам, кодирующим fIHGF и dHGF, и включающим разные фрагменты интрона 4.
Разные конструкции нуклеиновых кислот, содержащих кДНК, соответствующую экзонам 1-18 человеческого HGF и интрону 4 человеческого гена HGF или его фрагментам, называются «HGF-Х», с последующим уникальным номером, как описано в патенте США №7812146. HGF-Х, проанализированные заявителем, включают HGF-X1 (SEQ ID NO 7), HGF-X2 (SEQ ID NO 8), HGF-X3 (SEQ ID NO 9), HGF-X4 (SEQ ID NO 10), HGF-X5 (SEQ ID NO 11), HGF-X6 (SEQ ID NO 12), HGF-X7 (SEQ ID NO 13) и HGF-X8 (SEQ ID NO 14), но не ограничиваются ими.
Ранее было продемонстрировано то, что две изоформы HGF (т.е. fIHGF и dHGF) могут быть получены альтернативным сплайсингом между экзоном 4 и экзоном 5 каждой из конструкций. Кроме того, среди разных конструкций HGF HGF-Х7 показала наивысший уровень экспрессии двух изоформ HGF (т.е. fIHGF и dHGF), как раскрыто в патенте США №7812146, включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Соответственно, конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую HGF-X7, можно использовать в предпочтительных воплощениях способов по настоящему изобретению.
В особенно предпочтительных воплощениях плазмида pCK, содержащая экспрессионные последовательности HGF-X7, используется в способах по настоящему изобретению в качестве конструкции нуклеиновой кислоты. В частности, можно использовать pCK-HGF-X7 (также именуемую "VM202"). pCK-HGF-X7 представляет собой конструкцию, содержащую вектор pCK (SEQ ID NO 5) и HGF-X7 (SEQ ID NO 13), клонированную в вектор pCK. pCK-HGF-X7 депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейском центре культуры микроорганизмов (KCCM) под номером доступа KCCM-10361 12 марта 2002 г.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности изоформ HGF, использованных в способах, описанных в данном документе, могут дополнительно включать аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, по существу идентичные последовательностям изоформ человеческого HGF дикого типа. Существенная идентичность включает последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью, где аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность изоформы человеческого HGF дикого типа выравнивается с последовательностью максимальным образом. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. В частности, алгоритм выравнивания, раскрытый на сайте Средства поиска основного локального выравнивания (BLAST - от англ. Basic Local Alignment Search Tool) NCBI национального центра биотехнологической информации (NBCI - от англ. National Center for Biotechnological Information, Bethesda, Md.) и используемый в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx, можно использовать для определения процента идентичности.
6.3.1.3. плазмидная ДНК, кодирующая IGF-1
В некоторых воплощениях плазмидная ДНК кодирует человеческий IGF-1 или его вариант.
Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) представляет собой гормон, аналогичный по молекулярной структуру инсулину, который играет важную роль в росте в детстве и имеет анаболические эффекты у взрослых. Человеческий ген IGF-1 содержит шесть экзонов (экзоны 1, 2, 3, 4, 5 и 6 (6-1 и 6-2)), охватывающих почти 90 т.п.н. геномной ДНК. Экзоны 1 и 2 являются взаимоисключающими лидерными экзонами, причем каждый имеет множественные промоторные сайты, которые используются по-разному. Кроме того, ген IGF-1 может подвергаться дифференциальному сплайсингу с созданием множества вариантов транскриптов. Каждый вариант транскрипта кодирует другой пре-про-IGF-1 белок («изоформа IGF-1»), обладающий вариабельными лидерными последовательностями сигнальных пептидов. Тем не менее, все изоформы транскрипта приводят к тому же самому 70-аминокислотному пептиду IGF-1, который использует тот же самый рецептор после процессинга.
Пре-про-IGF-1 пептиды отличаются по их лидерным или сигнальным последовательностям и по их карбокси (С)-концу. Включение экзона 1 или экзона 2 является взаимоисключающим, и один из них служит в качестве лидерной последовательности пре-про-IGF-1 пептида; разные лидерные экзоны создают разные 5'-UTR. Пре-про-IGF-1 полипептиды подвергаются посттранскрипционному протеолитическому расщеплению с удалением лидера и карбокси-конца Е-пептида, приводя к зрелому 70-аминокислотному IGF-1.
Транскрипты, содержащие экзон 1, называются транскриптами Класса 1 (например, Класс I, Ec; Класс II, Eb и Класс I, Еа), тогда как транскрипты, содержащие экзон 2, называются транскриптами Класса 2 (например, Класс II, Еа). Почти все пре-пропептиды включают 27 аминокислот в сигнальном пептиде, происходящем из экзона 3, причем остальные сигнальные последовательности поисходят от включения экзона 1 или 2. У меньшинства транскриптов используется другой сайт инициации транскрипции в пределах экзона 3, генерируя более короткий сигнальный пептид из 22 аминокислот. Экзоны 3 и 4 являются неизменными и кодируют домены В, С, А и D зрелого пептида IGF-1; экзон 4 кодирует две третьих зрелого пептида IGF-1. Человеческий пептид Eb состоит только из экзонов 4 и 5, тогда как Ec содержит экзоны 4, 5 и 6.
Альтернативный сплайсинг и взаимоисключающая инициация транскрипции приводит к образованию разных полипептидов пре-про-IGF-1 (т.е. изоформ IGF-1). В частности, изоформа IGF-1 Класса I, Ec (SEQ ID NO 25), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4, 5 и 6, образуется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 26. Изоформа IGF-1 Класса II, Еа (SEQ ID NO 27), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 2, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 28. Изоформа IGF-1 Класса I, Eb (SEQ ID NO 29), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 5, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 30. Изоформа IGF-1 Класса I, Еа (SEQ ID NO 23), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 24.
Хотя зрелый белок IGF-1, происходящий из разных транскриптов, и не отличается, предполагали, что разные изоформы транскриптов имеют разные регуляторные функции. Варианты форм обладают разными стабильностями, партнерами связывания и активностью, указывая на ключевую регуляторную роль данных изоформ. Биологическое значение данных изоформ остается не ясным, хотя предполагали то, что изоформы Класса I с экзоном 1 являются аутокринными/паракринными формами, тогда как изоформы класса II с экзоном 2 представляют собой секретируемые эндокринные формы. Это основывается на данных о том, что транскрипты Класса II включают типичный мотив сигнального пептида, ассоциированный с эффективной секрецией, тогда как транскрипты Класса I имеют более длинный сигнальный пептид, который возможно может препятствовать секреции.
Были разработаны плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого IGF-1, и проанализированы на лечение нейропатии, как описано в заявках США №16/513560 и/или 16/513564, которые включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Данные плазмиды можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия.
В частности, в некоторых воплощениях данная плазмида содержит кодирующую последовательность одной из изоформ IGF-1. Например, конструкция ДНК может содержать последовательность, кодирующую Класс I, Еа (SEQ ID NO 24); Класс I, Eb (SEQ ID NO 30); Класс I, Ec (SEQ ID NO 26) или Класс II, Еа (SEQ ID NO 28).
В некоторых воплощениях конструкция ДНК представляет собой двойную экспрессионную конструкцию - конструкцию ДНК, которая экспресирует более чем одну изоформу IGF-1, посредством включения последовательности, регулирующей экспрессию, для кодирующей последовательности каждой изоформы (CDS). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) между двумя кодирующими последовательностями, например, в в следующем порядке: (1) последовательность регуляции экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспресию двух белковых продуктов от одного транскрипта. В других воплощениях для индукции экспрессии более чем одной изоформы IGF-1 у субъекта, которому осуществляется введение, совместно используют целый ряд конструкций, причем каждая кодирует одну изоформу IGF-1.
В предпочтительных воплощениях конструкция ДНК способна одновременно экспрессировать две или более чем две следующие изоформы IGF-1: например, (i) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Еа, Класс II (изоформа №2); (ii) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (iii) изоформа Ec, Класс I (изоформа №1) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4); (iv) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (iv) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Eb, Класс I (изоформа №3); (v) изоформа Еа, Класс II (изоформа №2) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4); (vi) изоформа Eb, Класс I (изоформа №3) и изоформа Еа, Класс I (изоформа №4) -посредством содержания сайта альтернативного сплайсинга.
Например, конструкция ДНК может содержать (i) первую последовательность, содержащую экзоны 1, 3 и 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 31), или вырожденную последовательность первой последовательности; (ii) вторую последовательность, содержащую интрон 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 32), или фрагмент данной второй последовательности; (iii) третью последовательность, содержащую экзоны 5 и 6-1 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 33), или вырожденную последовательность данной третьей последовательности; (iv) четвертую последовательность, содержащую интрон 5 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 34), или фрагмент данной второй последовательности; и (v) пятую последовательность, содержащую экзон 6-2 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 35), или вырожденную последовательность данной пятой последовательности. Интроны 4 и 5 могут подвергаться альтернативному сплайсингу, приводя к образованию двух изоформ IGF-1 (например, Класса I, Ec и Класса I, Еа).
В некоторых воплощениях конструкция ДНК тестируется in vitro и/или in vivo в отношении ее способности экспрессировать одну или более чем одну изоформу IGF-1. В предпочтительных воплощениях выбирают конструкции ДНК, способные экспрессировать обе изоформы IGF-1 - Класса I, Ec и Класса I, Еа.
Разные конструкции ДНК, содержащие кДНК, соответствующую (i) экзонам 1-6 человеческого гена IGF-1 и (ii) интронам 4 и 5 человеческого гена IGF-1 или разным фрагментам интронов 4 и 5, называются «IGF-1X», с последующим уникальным номером. Конструкции IGF-1X, проанализированные заявителем, включают IGF-1X1, IGF-1X2, IGF-1X3, IGF-1X4, IGF-1X5, IGF-1X6, IGF-1X7, IGF-1X8, IGF-1X9 и IGF-1X10, но не ограничиваются ими. Среди проанализированных конструкций было идентифицировано то, что IGF-1X6 и IGF-1X10 экспрессируют изоформы IGF-1 и Класса I, Ec, и Класса I, Еа.
В предпочтительных воплощениях используются IGF-1X6 (SEQ ID NO 21) или IGF-1X10 (SEQ ID NO 22). IGF-1X6 (SEQ ID NO 21) и IGF-1X10 (SEQ ID NO 22), клонированные в вектор pCK, называются pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 соответстенно. Клетки Е. coli, трансформированные pCK-IGF-1X6 ("DH5α_pCK-IGF1 Х6"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейской коллекции типовых культур (KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Корейская Республика) под номером доступа KCTC 13539 ВР 30 мая 2018 г. Клетки Е. coli, трансформированные pCK-IGF-1X10 ("DH5α_pCK-IGF1 Х10"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейской коллекции типовых культур (KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Корейская Республика) под номером доступа KCTC 13540 ВР30 мая 2018 г.
В некоторых воплощениях плазмида рТх содержит IGF-1X6 (т.е. pTx-IGF-1X6) или IGF-1 Х10 (т.е. pTx-IGF-1X10). Например, можно использовать pTx-IGF-1X10 (SEQ ID NO 16), полученную посредством лигирования IGF-1X10 в рТх, расщепленную ферментом Clal на 5' и ферментом Sah на 3'.
В некоторых воплощениях плазмида рТх содержит IGF-1Ec или IGF-1Ea. Например, pTx-IGF-1Ec получается лигированием IGF-1Ec (SEQ ID NO 26) в рТх, и pTx-IGF-1Ea получается лигированием IGF-1Ea (SEQ ID NO 24) в рТх. Данные плазмиды экспрессируют изоформу IGF-1Ec (SEQ ID NO 25) или изоформу IGF-1 Еа (SEQ ID NO 23) соответственно.
Изоформы IGF-1 или плазмиды, кодирующие IGF-1, описанные в данном документе, могут включать модификации от изоформ человеческого IGF-1 дикого типа. Данные модифицированные последовательности могут включать последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью при выравнивании данных модифицированных последовательностей с последовательностями изоформы человеческого IGF-1 дикого типа максимальным образом. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. В частности, для определения процента идентичности можно использовать алгоритм выравнивания, раскрытый в NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) веб-сайта Национального центра биологической информации (NBCI, Bethesda, Md.) и используемый в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx.
6.3.1.4. Плазмидная ДНК, кодирующая SDF-1α
Происходящий из стромальной клетки фактор 1 (SDF-1), также известный как хемокин 12 с мотивом С-Х-С (CXCL12), представляет собой белок-хемокин, который кодируется у человека геном CXCL12 на хромосоме 10. Он повсюду экспрессируется во многих типах тканей и клеток. Происходящие из стромальных клеток факторы 1а (SDF-1α) и 1р (SDF-1 р) представляют собой маленькие цитокины, которые принадлежат к семейству хемокинов, члены которого активируют лейкоциты и часто индуцируются провоспалительными стимулами, такими как липополисахарид, TNF (фактор некроза опухолей) или IL1 (интерлейкин-1). SDF-1 продуцируется в двух формах SDF-1α/СХС1_12а и SDF-1β/CXCL12b посредством альтернативного сплайсинга того же самого гена.
Были разработаны плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу человеческого SDF-1, и проанализированы на лечение периферического сосудистого заболевания, как описано в заявке США №15/514244, включенной в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте. В частности, полинуклеотид, кодирующий SDF-1α, эффективно стимулировал миграцию клеток сосудистого эндотелия и ангиогенез при введении совместно с полинуклеотидом, кодирующим человеческий HGF.
Плазмиды, кодирующие одну или более чем одну изоформу SDF-1, можно использовать в разных воплощениях настоящего раскрытия. В некоторых воплощениях используется плазмида, кодирующая одну или более чем одну SDF-1, раскрытая в заявке США №13/514244. В некоторых воплощениях используется плазмида, содержащая кодирующую последовательность SDF-1α. В некоторых воплощениях используется плазмида, содержащая кодирующую последовательность SDF-1β. В некоторых воплощениях используется плазмида, кодирующая и SDF-1α, и SDF-1β. В конкретном воплощении используется плазмида, содержащая последовательность SEQ ID NO 36.
6.3.2. Буфер
Жидкая композиция дополнительно содержит буфер для поддержания рН данной фармацевтической композиции. Данный буфер может включать буферное соединение, известное в данной области, такое как TAPS, бицин, Tris, трицин, TAPSO, HEPES, TES, MPOS, PIPES, какодилат или MES. Данный буфер может содержать лимонную кислоту, монокалия фосфат, борную кислоту или диэтилбарбитуровую кислоту. Данный буфер может представлять собой буфер PBS, HEPES, TRIS или TRIS/EDTA. Данный буфер может представлять собой другой фосфатный буфер. Фосфатные буферы могут содержать смесь одноосновного дигидрофосфата и двухосновного моногидрофосфата.
В частности, данный буфер может представлять собой калий-фосфатный буфер. Калий-фосфатный буфер может содержать фосфат калия в концентрации от 5 мМ до 15 мМ, от 7,5 мМ до 12,5 мМ, от 9 мМ до 11 мМ или 10 мМ.
Буфер, содержащийся в данной жидкой композиции, может иметь рН от 7 до 9. В некоторых воплощениях рН составляет от 7,0 до 8,5 или 8,0. В некоторых воплощениях рН составляет от 7,0 до 8,0.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 7,5-12 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7 до 9. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 7,5-12 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7,0 до 8,0. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит 9-11 мМ калий-фосфатный буфер с рН до 7,0 до 8,5. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция включает 10 мМ калий-фосфатный буфер с рН 8,0.
6.3.3. Углевод
Стабильность плазмидной ДНК в данной лиофилизированной фармацевтической композиции может быть повышена приготовлением данной пазмидной ДНК перед лиофилизацией в виде препарата с водным раствором, содержащим стабилизирующее количество углевода. Данный углевод может представлять собой маннит или сахарозу.
Данный углевод можно добавлять в жидкую композицию так, чтобы иметь конечную концентрацию углевода от примерно 0,05% до примерно 30%, от примерно 0,1% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 10%, от примерно 0,5% до примерно 10%, от примерно 1% до примерно 5%, от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 0,75% до 1,1%, от примерно 0,9% до 1,1%, от примерно 1,0% до примерно 1,1%.
В некоторых воплощениях жидкая композиция имеет конечную концентрацию по меньшей мере одного углевода больше, чем 0,1% и меньше, чем 15%, больше, чем 0,2% и меньше, чем 10%, больше, чем 0,3% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 3%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 2%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,75% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,9% и меньше, чем 1,1% или 1,0%.
В частности, данная жидкая композиция может иметь конечную концентрацию сахарозы от примерно 0,05% до примерно 30%, от примерно 0,1% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 15%, от примерно 0,2% до примерно 10%, от примерно 0,5% до примерно 10%, от примерно 1% до примерно 5%, от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 0,75% до примерно 1,1%, от примерно 0,9% до примерно 1,1% или примерно 1,0%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозу больше, чем 0,1% и меньше, чем 15%, больше, чем 0,2% и меньше, чем 10%, больше, чем 0,3% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 5%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 3%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 2%, больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,75% и меньше, чем 1,1%, больше, чем 0,9% и меньше, чем 1,1% или 1,0%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита меньше, чем 5%, меньше, чем 4%, меньше, чем 3%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита от 0% до 10%, от 1% до 9%, от 2% до 7,5%, от 2% до 3%, от 2% до 5%, от 2% до 4%, от 0% до 3%, от 0% до 2%, от 1% до 2%, от 1,5% до 3% или 2%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию маннита больше, чем 0% и меньше, чем 10%, больше, чем 0% и меньше, чем 7,5%, больше, чем 0% и меньше, чем 5%, больше, чем 0% и меньше, чем 4%, больше, чем 0% и меньше, чем 3% или больше, чем 0% и меньше, чем 2,5%, или больше, чем 1% и меньше, чем 2,5%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы больше, чем 0,5% и меньше, чем 1,1% и конечную концентрацию маннита больше, чем 0% и меньше, чем 3%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы от 0,7% до 1,1% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3% или 2%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы от 0,9% до 1,1% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3% или 2%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция имеет конечную концентрацию сахарозы 1,0% и конечную концентрацию маннита от 1,5% до 3%, от 2% до 3% или 2%.
В некоторых воплощениях в данной композиции используется другой углевод. Данный углевод может представлять собой моно-, олиго- или полисахарид, такой как сахароза, глюкоза, лактоза, трегалоза, арабиноза, пентоза, рибоза, ксилоза, галактоза, гексоза, идоза, манноза, талоза, гептоза, фруктоза, глюконовая кислота, сорбит, маннит, метил-а-глюкопиранозид, мальтоза, изоаскорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, лактон, сорбоза, глюкаровая кислота, эритроза, треоза, аллоза, альтроза, гулоза, эритрулоза, рибулоза, ксилулоза, псикоза, тагатоза, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота, арабинаны, фруктаны, фуканы, галактаны, галактеронаны, глюканы, маннаны, ксиланы, леван, фукоидан, каррагенан, галактокаролоза, пектины, пектиновые кислоты, амилоза, пуллулан, гликоген, амилопектин, целлюлоза, декстран, циклодекстрин, пустулан, хитин, агароза, кератин, хондроитин, дерматан, гиалуроновая кислота, альгиновая кислота, ксантановая камедь или крахмал.
6.3.4. Соль
Жидкая композиция дополнительно содержит соль. Данная соль может представлять собой NaCl или KCl.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит соль в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит соль в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,1% до 0,6%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит NaCl в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит NaCl в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,1% до 0,6%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит KCl в концентрации больше, чем 0,1% и меньше, чем 0,9%, больше, чем 0,25% и меньше, чем 0,75%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,6%, больше, чем 0,4% и меньше, чем 0,5% или в концентрации 0,45%. В некоторых воплощениях данная жидкая композиция содержит KCl в концентрации от 0,1% до 0,9%, от 0,25% до 0,75%, от 0,4% до 0,6%, от 0,4% до 0,5% или в концентрации 0,45%.
В некоторых воплощениях в данной композиции используется другая соль. Данная соль может представлять собой одновалентную катионную галогенную соль (например, хлорид натрия, хлорид калия, бромид натрия, хлорид лития, йодид натрия, бромид калия, бромид лития, фторид натрия, фторид калия, фторид лития и/или йодид лития), двухвалентную или трехвалентную соль (например, хлорид кальция, хлорид магния, сульфат кальция, сульфат натрия, сульфат магния, трихлорид хрома, сульфат хрома, цитрат натрия, хлорид железа(III), хлорид иттрия(III), фосфат калия, сульфат калия, хлорид калия, ацетат натрия, фосфат натрия, фосфат калия, хлорид железа(II), хлорид железа(III) или их комбинацию.
6.4. Условия лиофилизации
Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению получают посредством лиофилизации жидкой композиции, описанной в данном документе. Данную жидкую композицию можно лиофилизировать при стандартных условиях лиофилизации, известных в данной области, или их модификаций.
Способ осуществления лиофилизации жидкой композиции по изобретению может включать (а) загрузку контейнера жидкой композицией при исходной температуре от примерно 5°С до примерно -50°С; (b) охлаждение препарата ДНК до температур ниже нуля (например, от -10°С до -50°С); и (с) по существу высушивание данного препарата ДНК. Условия для лиофилизации, например, температуру и продолжительность, препарата ДНК по изобретению могут корректироваться обычным специалистом в данной области, принимая во внимание факторы, которые влияют на параметры лиофилизации, например, тип используемой лиофилизационной установки, количество используемой ДНК и размер используемого контейнера.
В некоторых воплощениях стадии (b) охлаждения и (с) сушки проводятся при изменении температур. Например, стадию замораживания можно проводить при увеличении температур от -50°С до -40°С, от -50°С до -30°С, от -50°С до -20°С, от -50°С до -10°С или от -50°С до 0°С. В некоторых воплощениях стадию замораживания можно проводить при снижении температур от -40°С до -50°С, от -30°С до -50°С, от -20°С до -50°С, от -10°С до -50°С, от 0°С до -50°С или от 5°С до -50°С. В некоторых воплощениях стадия замораживания проводится при уменьшении температуры и затем увеличении температуры.
Некоторые аморфные продукты (такие как маннит или глицин) формируют метастабильное стекло с неполной кристаллизацией при первом замораживании. Данные продукты могут получать пользу от способа тепловой обработки, который также называется отжиг. Во время отжига температура продукта циклически изменяется (например: от -40°С до -20°С в течение нескольких часов и затем обратно до -40°С; от -50°С до -20°С, выдерживая в течение двух (2) часов, затем вводя вакуум; или от -50°С до -20°С и затем обратно до -50°С с получением более полной кристаллизации. Отжиг имеет дополнительное преимущество большего роста кристаллов и соответствующего более короткого времени сушки. Вода, удерживаемая в аморфной фазе, может быть дополнительно удалена во время вторичной сушки.
В некоторых воплощениях стадия сушки проводится в два этапа - (i) первичная сушка и (ii) вторичная сушка.
В некоторых воплощениях первичная сушка проводится при поддержании температуры или при повышении или снижении температуры. В некоторых воплощениях первичная сушка проводится при поддержании температуры при -50°С, -40°С, -30°С, -20°С, -10°С или 0°С. В некоторых воплощениях вторичная сушка проводится при поддержании температуры или при повышении или снижении температуры. В некоторых воплощениях вторичная сушка может проводиться при увеличении температуры от -50°С до 20°С, от -40°С до 20°С, от -30°С до 20°С, от -20°С до 20°С, от -10°С до 20°С, от -50°С до 10°С, от -40°С до 10°С, от -30°С до 10°С, от -20°С до 10°С или от -10°С до 10°С.
Во время процесса лиофилизации может происходить разделение фаз. Например, чистая кристаллическая фаза может отделяться от насыщенной аморфной фазы. Данная кристаллическая фаза может включать лед или другие кристаллизующиеся эксципиенты. Таким образом, во время первичной сушки может удаляться фаза чистого льда, оставляя за собой другие кристаллические фазы и любые насыщенные аморфные фазы. Условия для первичной сушки могут быть скорректированы для эффективного удаления данной несвязанной воды при сохранении структуры осадка и стабильности ДНК. Первичная сушка (сублимация) представляет собой медленный процесс, проводящийся при более холодных температурах, безопасно более низких, чем критическая температура разрушения продукта (англ. «collapse temperature»). Для сублимации требуется тепловая энергия для управления процессом изменения фазы от твердого вещества до газообразного. При лиофилизации продукта необходимо рассматривать все три способа переноса теплоты - кондуктивную теплопередачу, конвекцию и излучение.
Каждая жидкая композиция имеет уникальную критическую температуру. Необходимо поддерживать композицию при температуре безопасно меньше, этой критической температуры во время первичной сушки для того, чтобы избежать разрушения. Данная температура зависит от давления пара на поверхности контакта льда, и, в свою очередь, данное давление пара зависит и от скорости теплопередачи в композицию (которая контролируется посредством корректировки температуры полки), и от заданной точки уровня вакуума системы. Во время первичной сушки давление системы и температуру полки устанавливают и контролируют в комбинации с получением подходящей температуры продукта. С установленными параметрами температуры и давления первичная сушка затем продолжается в течение достаточной продолжительности времени для сублимации всех кристаллов льда.
Помимо свободного льда, который сублимируется во время первичной сушки, остается существенное количество молекул воды, которые связаны с продуктом. Это вода, которая удаляется (десорбируется) во время вторичной сушки. Поскольку весь свободный лед был удален при первичной сушке, температура продукта теперь может быть значительно увеличена без страха плавления или разрушения. Вторичная сушка фактически начинается во время первичной фазы, но при повышенных температурах (типично в интервале от 20 до 50°С), десорбция идет значительно быстрее. Скорости вторичной сушки зависят от температуры продукта. Вакуум системы может сохраняться на том же самом уровне, что и используемый во время первичной сушки; меньшие уровни вакуума не будут улучшать время вторичной сушки.
Вторичная сушка продолжается, пока данный продукт не имеет приемлемого содержания влаги для долговременного хранения. В зависимости от применения, содержание влаги в полностью высушенных продуктах типично составляет от 0,5% до 3%. В большинстве случаев чем суше продукт, тем дольше будет его срок хранения. Однако определенные сложные биологические продукты могут фактически становиться слишком сухими для оптимальных результатов хранения, и способ вторичной сушки должен контролироваться соответствующим образом.
Стадию вторичной сушки можно проводить при увеличении температур от -50°С до 20°С, от -40°С до 20°С, от -30°С до 20°С, от -20°С до 20°С, от -10°С до 20°С, от -50°С до 10°С, от -40°С до 10°С, от -30°С до 10°С, от -20°С до 10°С, от -10°С до 10°С.
6.5. Лиофилизированная композиция в разовой дозе
Другим аспектом настоящего изобретения является лиофилизированная фармацевтическая композиция в разовой дозе. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, ампулу, бутыль или предварительно заполненный шприц. В некоторых воплощениях разовая доза содержит примерно от 50 мкг до 1 г плазмидной ДНК, от 100 мкг до 1 г плазмидной ДНК, от 100 мкг до 100 мг плазмидной ДНК, от 1 мг до 100 мг плазмидной ДНК, от 10 мг до 100 мг плазмидной ДНК, от 10 мг до 50 мг плазмидной ДНК. Разовая доза может содержать примерно 10 мкг, 50 мкг, 100 мкг, 1 мг, 10 мг, 100 мг или 1 г плазмидной ДНК. Стандартная лекарственная форма может содержать 0,01 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,5 мг, 1 мг, 2,5 мг, 5 мг, 8 мг, 10 мг, 12,5 мг, 16 мг, 24 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг или 200 мг плазмидной ДНК.
В типичных воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий 50 мг, 10 мг, 7,5 мг, 5, мг, 1 мг, 100 мкг или 50 мкг лиофилизированной фармацевтической композиции, подходящей для введения после растворения. Введение включает подкожное, внутрикожное или внутримышечное введение с использованием предварительно загруженных шприцев, автоинъекторов и авто инъецирующих шприцев-ручек, причем каждый содержит заданное количество фармацевтической композиции, описанной выше.
Разовая доза в контейнере может быть определена на основе разных факторов, таких как активный ингредиент (например, плазмидная ДНК), заболевание, подлежащее лечению, субъект, путь и способ введения. Разовая доза может быть определена на основе исследований in vitro или in vivo, включая клинические испытания.
Разовая доза в контейнере может быть запечатана и может храниться в течение увеличенного периода времени при разных температурах (например, от комнатной температуры до примерно -180°С, предпочтительно от примерно 2-8°С до примерно -80°С, более предпочтительно от примерно -20°С до примерно -80°С и наиболее предпочтительно при примерно -20°С).
Лиофилизированные композиции ДНК, хранящиеся в контейнере, предпочтительно являются стабильными в пределах интервала от примерно 2-20°С до примерно -80°С в течение периода по меньшей мере 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев или 1 год без потери значительной активности. Срок хранения может быть таким длительным, как несколько месяцев, 1 год, 5 лет, 10 лет, 15 лет или вплоть до 20 лет. Предпочтительно данный препарат является стабильным в течение периода по меньшей мере примерно 3 лет.
6.6. Характеристика лиофилизированной композиции
Согласно настоящему изобретению предложена лиофилизированная фармацевтическая композиция, имеющая одно или более чем одно желательное свойство в качестве фармацевтического продукта. Данные свойства могут включать стабильность и эффективность активного ингредиента при разных условиях хранения, образование осадка, однородное растворение данного препарата для введения, меньшее количество загрязнений и т.д. Разные свойства, предоставленные в данном документе, можно использовать для выбора предпочтительной лиофилизированной композиции или для определения идеальных условий хранения для лиофилизированной композиции.
Стабильность плазмидной ДНК в данной лиофилизированной композиции можно определять на основе известных в данной области способов. В частности, стабильность можно определять на основе конформации плазмидной ДНК, например, например, существуют ли они в виде более стабильной суперспирализованной формы или менее стабильной открытой кольцевой или линейной формы. Конформация плазмидной ДНК может определяться посредством капиллярного электрофореза образца, содержащего плазмидную ДНК. Содержание суперспирализованной ДНК по сравнению с открытой кольцевой или линейной формой можно измерять в разных условиях. Например, содержание суперспирализованной ДНК можно определять перед, во время или после лиофилизации, или перед, во время или после растворения данной лиофилизированной композиции. Содержание суперспирализованной ДНК также можно определять перед, во время или после хранения при разных температурах для выбора стабильной лиофилизированной композиции, а также для определения идеальных условий хранения.
Другой способ определения стабильности плазмидной ДНК основывается на концентрациях ДНК. Можно применять разные способы измерения концентраций ДНК, известные в данной области. Например, концентрации ДНК можно измерять на основе на основе светопоглощения при 260 нм. Данный способ может дополнительно включать измерение загрязнителей для лучшего количественного измерения концентраций ДНК в образце.
Внешний вид осадка может быть другой важной характеристикой лиофилизированного продукта. Обычно предпочтительным является однородный и первоклассный внешний вид осадка. Неидеальный внешний вид осадка может влиять на качество продукта, например, затрудняя определение качества продукта на основе визуальной проверки или делая затруднительным извлечение всего количества активного ингредиента в контейнере. Кроме того, частичное или полное обратное плавление осадка может приводить к нестабильности и деградации активного ингредиента. Обратное плавление представляет собой вид разрушения осадка, и оно вызвано изменением от твердого до жидкого состояния. То есть, имеется неполная сублимация (изменение от твердого до газообразного состояния) во флаконе. Данные изменения могут включать изменение физической формы лекарственного вещества и карман влаги.
Внешний вид осадка может определяться визуальной проверкой, которая может включать фотографирование. Визуальные проверки могут осуществляться, главным образом, на основе исторического прецедента. Перед суждением о качестве продукта важной является надежная программа качественной оценки для визуальной проверки. Данная программа качественной оценки может быть основана на прошлом опыте или опубликованной информации. Для лекарственного продукта могут быть разработаны конкретные руководства визуальной проверки, например, на основе информации, предоставленной в руководстве по проверке «Lyophilization of Parenterals: Guide To Inspections of Lyophilization of Parenterals (7/93)», опубликованной Управлением США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств.
Другой характеристикой лиофилизированного продукта, которая может влиять на качество лекарственного продукта, является мутность растворенного лекарственного средства, полученного посредством растворения лиофилизированного продукта. Мутность растворенного лекарственного средства может коррелировать с выходом активных ингредиентов в данной лиофилизированной композиции. В общем, предпочтительным является полное растворение, т.е. низкая мутность выделенного лекарственного средства. Неполное растворение может приводить к отходам активных ингредиентов фармацевтической композиции и к закупорке шприца для введения растворенного лекарственного средства.
Мутность растворенного лекарственного средства можно измерять визуальными проверками или измерением светопоглощения при определенных длинах волн, например, при 450 нм и 650 нм. Светопоглощение можно измерять с использованием доступного в данной области устройства, например, микропланшета ThermoMAX от Molecular Devices.
Время растворения является другим фактором, который можно связать с качеством лекарственного продукта. В общем, предпочтительным является короткое время растворения. Увеличенное время растворения на этапе пользователя может приводить к частичной потере эффективности, если данное лекарственное средство не полностью растворяется, так как во время введения пациенту обычным является применение инфузионных фильтров. Время, требующееся для растворения лиофилизированного продукта, можно определять, например, измерением мутности растворенного лекарственного средства в разные моменты времени после растворения. Например, мутность можно измерять через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа или более.
Остаточная влага после лиофилизации также может быть важной. Для измерения остаточной влаги в лиофилизированной композиции можно применять разные способы, известные в данной области. Например, для анализа содержания влаги можно использовать Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Карман влаги в лиофилизированной композиции может приводить к большей нестабильности и повышенной деградации продукта. Таким образом, меньшее содержание влаги может быть предпочтительным.
6.7. Способы лечения заболевания с использованием лиофилизированной композиции
Способы лечения заболеваний с использованием лиофилизированной композиции находятся в пределах объема настоящего изобретения.
6.7.1. Растворение лиофилизированной композиции
Можно использовать разные способы растворения, такие как способы вихревого перемешивания, способы с использованием механического орбитального шейкера или способы с поддержанием флакона в стационарном состоянии.
Конечная концентрация растворенного лекарственного средства для введения может корректироваться, в зависимости от многих факторов, включая количество препарата, подлежащего доставке, возраст и массу субъекта, способ доставки, путь и иммуногенность доставляемого антигена.
Лиофилизированную композицию по настоящему изобретению можно растворять с использованием подходящего раствора, такого как вода, ТЕ, PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), Tris буфер или нормальный физиологический раствор, до конечной концентрации примерно 10 мг/мл, 5 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл или 0,05 мг/мл.
6.7.2. Введение растворенного лекарственного средства
Растворенное лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему субъекту для лечения разных заболеваний. Растворенную лиофилизированную композицию по изобретению можно вводить разными способами доставки, например, перорально или посредством парентеральных путей, таких как внутривенная, внутримышечная, внутриэндокардиальная, внутримиокардиальная, внутриперикардиальная, внутрижелудочковая, внутрисуставная, внутрикожная, внутримозговая, внутрипочечная, внутрипеченочная, внутриселезеночная, внутрилимфатическая, подкожная, внутрибрюшная, интратестикулярная, внутрияичниковая, внутриматочная, грудинная, внутритрахеальная, внутриплевральная, интраторакальная, интрадуральная, внутриспинальная, интрамедуллярная, интрамуральная, интраскорионная и артериальная инъекция или инфузия, или местно посредством ректального, внутриназального, ингаляционного или внутриглазмого введения. В некоторых воплощениях способом доставки является внутримышечная, внутримиокардиальная, внутривенная, внутримозговая или внутрипочечная доставка.
В типичных воплощениях конструкция нуклеиновой кислоты вводится посредством инъекции жидкой фармацевтической композиции. В предпочтительных в настоящее время воплощениях полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции. Типично данная полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции близко к пораженному участку. В некоторых воплощениях полинуклеотидные конструкции вводится в мышцы конечностей, сердца или других частей организма субъекта.
В некоторых воплощениях данная конструкция инъецируется подкожно или внутрикожно. В некоторых воплощениях данная полинуклеотидная конструкция вводится посредством внутрисосудистой доставки. В некоторых воплощениях данная конструкция инъецируется ретроградной внутривенной инъекцией.
Следует понимать то, что типичную ежесуточную дозу растворенной лиофилизированной композиции по настоящему изобретению следует определять в свете разных релевантных факторов, включающих состояния, подлежащие лечению, выбранный путь введения, возраст, пол и массу тела индивидуального пациента, тяжесть симптома пациента, и она может вводиться в одной дозе или в раздельных дозах. Полинуклеотидная конструкция вводится в терапевтически эффективной дозе.
В некоторых воплощениях описанных в данном документе способов полинуклеотидная конструкция вводится в общей дозе от 1 мкг до 200 мг, от 1 мг до 200 мг, от 1 мг до 100 мг, от 1 мг до 50 мг, от 1 мг до 20 мг, от 5 мг до 10 мг, 16 мг, 8 мг или 4 мг.
В типичных воплощениях общая доза делится на целый ряд индивидуальных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на целый ряд равных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на неравные инъекционные дозы.
В разных воплощениях с раздельными дозами общая доза вводится в 4, 8, 16, 24 или 32 разных инъекционных участка.
В некоторых воплощениях инъекционная доза составляет 0,1-5 мг. В определенных воплощениях инъекционная доза составляет 0,1 мг, 0,15 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,3 мг, 0,35 мг, 0,4 мг, 0,45 мг или 0,5 мг.
Данная общая доза может вводиться во время одного посещения или за два или более чем два посещения.
В типичных воплощениях с раздельной дозой все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1 часа друг от друга. В некоторых воплощениях все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1,5; 2; 2,5 или 3 часов друг от друга.
В разных воплощениях данных способов общая доза полинуклеотидной конструкции, независимо от того, вводится ли она в виде одиночной унитарной дозы или разделенной на множество инъекционных доз, вводится субъекту только один раз.
В некоторых воплощениях один цикл может включать введение общей дозы полинуклеотидной конструкции во множество мест инъекции за один, два, три или четыре посещения. В частности, один цикл может включать введение 32 мг, 16 мг, 8 мг или 4 мг полинуклеотидной конструкции во множество мест инъекции за два посещения. Данные два посещения могут быть отделены друг от друга 3, 5, 7, 14, 21 или 28 сутками.
В некоторых воплощениях цикл можно повторять. Данный цикл можно повторять дважды, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз или более.
В некоторых воплощениях данный цикл можно повторять через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев после предыдущего цикла.
В некоторых воплощениях общая введенная доза в последующем цикле является такой же, как и общая введенная доза в предыдущем цикле. В некоторых воплощениях общая введенная доза в последующем цикле является отличной от общей введенной дозы в предыдущем цикле.
В предпочтительных в настоящее время воплощениях данная конструкция нуклеиновой кислоты вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на целый ряд внутримышечных инъекций и целый ряд посещений, где каждая из целого ряда инъекций в любое одно посещение проводится в отдельное место инъекции. В некоторых воплощениях данная конструкция нуклеиновой кислоты вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на первую дозу в 4 мг на конечность в сутки 0 и вторую дозу в 4 мг на конечность в сутки 14, где каждая из первой и второй дозы равномерно разделена на множество инъекционных доз.
Фактическое введенное количество, скорость и динамика введения будут зависеть от природы и тяжести заболевания, которое лечат. В типичных воплощениях полинуклеотидная конструкция вводится в эффективном количестве для уменьшения симптомов заболевания, например, боли. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома в пределах 1 недели после введения. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома в пределах 2 недель, 3 недель или 4 недель введения.
Данная плазмидная ДНК может вводиться одна или в комбинации с другой плазмидной ДНК либо одновременно, либо последовательно, в зависимости от состояния, которое лечат.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий HGF. Данное растворенное лекарственное средство может вводиться для лечения разных заболеваний, например, заболевания, для которого ранее было продемонстрировано то, что оно лечится введением плазмидной ДНК. Данная плазмидная ДНК может кодировать терапевтический ген, как, например, человеческого HGF. Данное заболевание включает ишемическое или печеночное заболевание, болезнь коронарных артерий («CAD»), боковой амиотрофический склероз («ALS»), болезнь периферических артерий («диабетическая язва») и диабетическую периферическую нейропатию («DPN») или нейропатию, вызванную заболеваниями, повреждениями, инфекциями или состояниями недостаточности витаминов, но не ограничивается ими. Например, нейропатия может быть вызвана диабетом, недостаточностями витаминов, аутоиммунными заболеваниями, генетическими или наследственными расстройствами, амилоидозом, уремией, токсинами или ядами, травмой или повреждением, опухолями или может быть идиопатической. Для лечения заболеваний посредством введения лиофилизированной композиции можно применять способы, описанные в патентах США №7812146; 7838505; 7745174; 8338385; 8389492 и заявках США №12/359137; 14/355792; 15/030999. Приведенные в данном документе ссылки являются включенными в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий IGF-1. Данное растворенное лекарственное средство может вводиться для лечения разных заболеваний, например, заболевания, для которого ранее было продемонстрировано то, что оно лечится введением плазмидной ДНК, кодирующей человеческий IGF-1 или белок человеческого IGF-1. Данное заболевание включает нейропатию, вызванную заболеваниями, повреждениями, инфекциями или состояниями недостаточности витаминов, но не ограничивается ей. Например, данная нейропатия может быть вызвана диабетом, недостаточностями витаминов, аутоиммунными заболеваниями, генетическими или наследственными расстройствами, амилоидозом, уремией, токсинами или ядами, травмой или повреждением, опухолями или может быть идиопатической. В некоторых воплощениях плазмида, кодирующая человеческий белок IGF-1 (pTx-IGF-1), вводится с другой плазмидой, кодирующей человеческий HGF (например, VM202), для лечения заболевания. Для лечения заболеваний посредством введения лиофилизированной композиции можно применять способы, описанные в заявках США №16/513560 и/или 16/513564.
В некоторых воплощениях растворенная композиция содержит плазмидную ДНК, кодирующую человеческий SDF-1α. Для лечения заболевания данную плазмиду можно вводить одну или совместно с другой плазмидной ДНК. В некоторых воплощениях плазмида, кодирующая человеческий SDF-1α (например, pCK-SDF-1α) вводится с другой плазмидной ДНК, кодирующей человеческий HGF (например, VM202), для лечения заболевания. Данное заболевание включает сосудистое заболевание, такое как заболевание периферических сосудов, но не ограничивается им. Для лечения заболевания посредством введения плазмиды, кодирующей человеческий SDF-1α, можно применять способы, описанные в заявке США №15/514244.
6.8. Примеры
Следующие примеры излагаются таким образом, чтобы давать обычным специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как использовать настоящее изобретение, и они не предназначены ни для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы данного изобретения рассматривают как их изобретение, ни для представления того, что эксперименты ниже являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении использованных чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но необходимо учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приводится в градусах Цельсия, и давление является атмосферным или около атмосферного. Могут использоваться стандартные сокращения, например, п.о. - пара(ры) оснований; т.п.н. - тысяча(чи) пар нуклеотидов; пл - пиколитр(ы); с - секунда(ды); мин - минута(ты); ч - час(сы); ак - аминокислота(ты); нт - нуклеотид(ды) и тому подобные.
В воплощении настоящего изобретения на практике, если не указано иное, будут использоваться традиционные способы белковой химии, биохимии, методики генной инженерии и фармакологии, находящиеся в пределах квалификации в данной области.
6.8.1. Пример 1: лиофилизированная композиция VM202 (исследование 001) 6.8.1.1. Проанализированная фармацевтическая композиция, содержащая VM202
Получали разные препараты, содержащие VM202, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 1. Активный ингредиент - плазмида VM202 - получали из замороженных маточных растворов, содержащих либо 1,6 мг/мл VM202 в 0,9% NaCl, либо 1,3 мг/мл VM202 в 0,9% NaCl.
Данные препараты получали с использованием имеющихся в продаже веществ и оборудования, например, одноосновного фосфата калия (Spectrum, каталожный № РО200), двухосновного фосфата калия (EMD, каталожный № РХ1570-1), маннит (J.T. Baker, каталожный №2553-05), сахарозы (J.T. Baker, каталожный №4074-05), хлорида натрия (Millipore, каталожный №1.06404.5000) и трегалозы (Pfanstiehl, каталожный №Т-104-04), диализной кассеты (Thermo Scientific, каталожный №66380 (10000 MWCO (порог отсечения молекулярной массы)), стеклянных флаконов (3 мл или 20 мл стеклянные флаконы (Schott, Типа I, борсиликатные, каталожный №68000316 или 68000321)) и пробки (13 мм или 20 мм лиокрышка с одним вентиляционным отверстием, Flurotec®, (West Pharmaceutical, каталожный №19700034 или 19700311)). Также использовали эксципиенты, такие как декстран (MP Biomedicals, каталожный №101514), гидроксид лития (Sigma Aldrich, каталожный № L4533-100G) и фосфорная кислота (J.T. Baker, каталожный №0262-01).
6.8.1.2. Анализ разных препаратов в малом масштабе
6.8.1.2.1. Приготовление образца
Для получения разных препаратов флаконы с VM202 в концентрации 1,6 мг/мл в 0,9% NaCl удаляли с хранения при -70°С и оттаивали при температуре окружающей среды.
Образцы для 1 раунда анализа в малом масштабе: затем получали KP8M2SN (см. Таблицу 1) посредством диализа с использованием диализной кассеты Thermo с MWCO 10000 при 10000-кратной или более замене объема относительно препарата целевого буфера (10 мМ фосфат калия, 2% маннита, 1,0% сахарозы, 0,1% NaCl, рН 8,0) за 24 часа при 2-8°С. После диализа концентрацию KP8M2SN доводили до 0,5 мг/мл VM202 с использованием буфера для приготовления препарата.
KP8MS3N, KP8MT3N и контроль получали разведением лекарственного вещества. В частности, 1,7 мл VM202 (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) разводили 0,85 мл буферов для разведения (буфер №2 для KP8MS3N, буфер №3 для KP8MT3N и буфер №8 для контроля), приведенных в ТАБЛИЦЕ 2. После разведений каждый препарат доводили таким образом, чтобы он содержал 0,5 мг/мл VM202 для KP8MS3N и KP8MT3N, соответственно, с использованием буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Образцы для 2-го раунда анализов в малом масштабе: 4MSN, 3MSN и 2MSN получали разведением 0,84 мл лекарственного вещества (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) с использованием 0,42 мл буферов для разведения (буфер 4 для 4MSN, буфер 5 для 3MSN и буфер 6 для 2MSN), также приведенных ниже в ТАБЛИЦЕ 2. После разведения каждый препарат, за исключением контроля, доводили таким образом, чтобы он включал 0,5 мг/мл VM202 с использованием каждого буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Приготовление образцов для исследования стабильности с ускоренной деградацией: для исследования стабильности с ускоренной деградацией дополнительно получали отдельный набор препаратов. Для данного отдельного набора 4MSN, 3MSN, 2MSN, 2M1SN и контроль получали разведением лекарственного вещества (т.е. VM202 в 0,9% NaCl) буферами для разведения, приведенными выше в ТАБЛИЦЕ 2, в соотношении 2:1 (буфер 4 для 4MSN, буфер 5 для 3MSN, буфер 6 для 2MSN, буфер 7 для 2M1SN и буфер 8 для контроля). После разведений все препараты, за исключением контроля, доводили таким образом, чтобы они содержали VM202 в концентрации 0,5 мг/мл с использованием каждого буфера для приготовления препарата, содержащего 0,45% NaCl.
Имитирующий препарат получали с использованием декстрана в концентрации 0,5 мг/мл в 0,9% NaCl и 1,1% сахарозе.
Лиофилизация образцов: после доведения концентрации до 0,5 мг/мл приготовленный в виде препарата VM202 подвергали стерилизующей фильтрации через 0,2 мкм фильтр PES (исследования в малом масштабе и исследования стабильности с ускоренной деградацией) или фильтр на основе ацетата целлюлозы (СА) (дополнительное исследование стабильности с ускоренной деградацией) при асептических условиях. Всеми образцами заполняли при асептических условиях стерилизованные 3 мл флаконы с объемом заполнения 0,75 мл на флакон для лиофилизации в малом масштабе или стерилизованные 20 мл флаконы с объемом заполнения 5 мл на флакон для исследований стабильности с ускоренной деградацией в боксе микробиологической безопасности. В частности, заполнение данными препаратами осуществляли с использованием шприцевого фильтра (PALL Life Science, 13 мм Acrodisc с 0,2 мкм мембраной PES, каталожный №4602) с использованием системы вакуумной фильтрации (Corning, 1 л система вакуумный фильтр/бутыль для хранения, 0,2 мкм СА мембрана, каталожный №431-205; Thermo scientific, фильтрующий элемент для быстрого тока, 0,2 мкм PES мембрана, каталожный №567-0020) в боксе микробиологической безопасности (бокс микробиологической безопасности NuAire, класс II, тип А/В3, №модели NU-425-600)).
После заполнения данные флаконы частично закупоривали стерильными крыжками и загружали в лиофилизатор (VirTis (№ модели 25L Genesis SQ Super XL-70) для лиофилизации с использованием цикла, описанного в ТАБЛИЦЕ 3. Флаконы имитации использовали для полного окружения флаконов VM202 таким образом, что во время процесса сушки для лиофилизации в малом масштабе обеспечивается сравнимая излучательная теплопередача от соседних флаконов.
После лиофилизации данные флаконы полностью закупоривали при частичном вакууме 600 мТорр (79,99 Па), обжимали алюминиевыми колпачками и метили. Метки включали информацию относительно проекта, дату, температуру инкубации/стрессовое условие и момент времени. После мечения образцы помещали в соответствующие им условия стабильности.
6.8.1.2.2. Анализы для тестирования разных препаратов
Лиофилизированные препараты подвергали воздействию разных стрессовых условий для оценки их относительной стабильности. Для теплового стрессового воздействия на образцы все препараты хранили при 5°С, 25°С или 40°С в течение вплоть до 10 недель. Для оценки стабильности после растворения образцы растворяли в боксе микробиологической безопасности с использованием целевого объема 5,0 мл фильтрованной воды для инъекции (WFI), повторно закупоривали и повторно запечатывали. После растворения образцы хранили при 25°С в течение 3 или 7 суток. Разные условия, проанализированные в данном эксперименте, обобщаются ниже в ТАБЛИЦЕ 4.
Следующие анализы проводили для анализа стабильности разных препаратов в разных условиях.
(1) Визуальная проверка: визуальную проверку проводили относительно темного и белого фона. Получали цифровые фотографии.
(2) УФ (ультрафиолетовая) спектрофотометрия: анализ УФ спектрофотометрией проводили с использованием нанофотометра Implen с фактором крышки 10. Концентрацию плазмидной ДНК опытных образцов определяли измерением поглощения при 230, 260, 280 и 350 нм. Анализы концентрации проводили с использованием протокола в УФ/видимой области ViroMed. Расчеты проводили с использованием следующих уравнений:
Концентрация (мкг/мл) = [(D-E)/C] × (В/А)
Выход = (низкая мкг/мл) / (высокая мкг/мл) × 100%
ОП260нм/ОП280нм=D/F
ОП260nm/ОП230nm=D/G
где:
А - масса образца, взятого для получения разведения.
В - общая масса образца и буфера для получения разведения.
С - коэффициент экстинкции 0,005% раствора в кювете с длиной пути 1 см (0,02).
D - оптическая плотность для максимума при 260 нм.
Е - поглощение, измеренное при 350 нм.
F - поглощение, измеренное при 280 нм.
G - поглощение, измеренное при 230 нм.
Критерии принятия:
D должно попадать в интервал от 0,5 до 1,5 единиц ОП (оптическая плотность)
Выход должен быть большим или равным 98%
ОП260нм/ОП280нм должно находиться в интервале от 1,8 до 2,0
ОП260нм/ОП230нм должно быть большим или равным 1,1
(3) Капиллярный электрофорез: для структурного анализа плазмидной ДНК (чистота и суперспирализованная ДНК) использовали прибор Beckman Coulter, ProteomeLab™ PA 800 СЕ, оснащенный УФ детектором Р/АСЕ™ MDQ. Для анализа результатов использовали программу 32 Karat (версия 7.0). Перед анализом посредством капиллярного электрофореза 40 см покрытый капилляр Beckman Coulter Neutral с 50 мкм внутренним диаметром (№ части 477441) и 8 мкм окном апертуры кондиционировали посредством пропускания воды класса ультрачистая для ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) при 137,9 кПа в течение 1 минуты, с последующей промывкой 100 мМ фосфорной кислотой (рН 2,6) при 137,9 кПа в течение 1 минуты. Разделение происходило посредством приложения постоянного напряжения 17 кВ в течение 14 минут. 40 мкл образца в концентрации 0,5 мг/мл добавляли в полиэтиленовую вставку для анализов. Использовали следующие параметры:
• Давление/ время инъекции: 3,45 кПа/11 с.
• Буфер для разделения/давление: 100 мМ фосфорная кислота (рН 2,60), 85% / 137,9 кПа; 60 с.
• Промывочный буфер/давление: ультрачистая вода класса для ВЭЖХ / 137,9 кПа; 60 с
• Длина волны детектора: 254 нм.
• Напряжение разделения: 17 кВ; 0,17 мин; 14 мин.
Типичный результат капиллярного электрофореза VM202 приводится на Фиг. 1.
(4) Мутность: мутность определяли измерением поглощения образца при 450 нм и 650 нм с использованием микропланшет-ридера ThermoMAX от Molecular Devices.
(5) Анализ ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) при условиях, близких к условиям окружающей среды: с использованием ДСК Pyris Diamond с Intercooler II замораживали приблизительно 10 мкл каждого препарата при -60°С. При скорости изменения 5°С/мин образец нагревали до 25°С, и записывали тепловой поток во время процесса нагревания. Также осуществлялась программа, включающая стадию отжига. Стадию отжига проводили посредством нагревания образца до -15°С при скорости изменения 5°С/мин.
(6) Анализ влаги по Карлу Фишеру: для анализа содержания влаги использовали Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Для определения точности системы использовали AquaStar Water Standard Oven 1%. Перед удалением колпачков для анализа флаконы с образцами доводили до комнатной температуры. Лодочки для взвешивания взвешивали до и после добавления образцов для определения количества лиофилизированного порошка, использованного для анализа. Для анализа использовали приблизительно 10-160 мг вещества.
6.8.1.2.3. Анализ KP8M2SN, KP8MS3N и KP8MT3N (1-ый раунд анализа в малом масштабе)
Анализ ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды: перед процессом лиофилизации 10 мкл образцов приготовленной в виде препрата VM202 - т.е. KP8M2SN, KP8MS3N, KP8MT3N и контроль (ТАБЛИЦА 1) - в концентрации 0,5 мг/мл анализировали посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) при условиях, близких к условиям окружающей среды, для характеристики препаратов-кандидатов. Проанализированные сигналы включают температуру разрушения (Tg'), температуру расстеклования (Td) и пользу отжига разных препаратов с VM202 в замороженных состояниях. На Фиг. 2A-2D проиллюстрированы результаты ДСК жидкого состояния для 1-го раунда лиофилизации в малом масштабе KP8M2SN (Фиг. 2А), KP8MS3N (Фиг. 2В), KP8MT3N (Фиг. 2С) и контроля (Фиг. 2D) без отжига (слева) или с отжигом (справа) VM202. Температуру стеклования (Tg') KP8M2SN наблюдали при -44°С. Контроль демонстрировал эвтектическую температуру плавления (Те) при примерно -21°С. Температура расстеклования (Td) наблюдалась во всех препаратах и исчезала после отжига. Поскольку некоторые из добавок демонстрировали сигналы рассеклования, которые исчезали после отжига, цикл 1 лиофилизации (ТАБЛИЦА 3) разрабатывали так, чтобы он включал стадию отжига во время замораживания для 1-го раунда в малом масштабе.
Увеличение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов, затем последующее введение вакуума обеспечивали отжиг и индукцию кристаллизации маннита. Первичную сушку проводили при температуре полки -20°С (24 часа) с давлением камеры 80 мТорр (10,66 Па) (ТАБЛИЦА 3). Вторичную сушку при температуре полки 20°С разрабатывали для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
На Фиг. 3 показан график динамики температур (левая ордината) и давлений (правая ордината) во время процесса лиофилизации для 1-го раунда проведения анализа в малом масштабе. Температура продукта падала ниже -36°С из-за потери тепла сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 30 часов во время стадии первичной сушки, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 46 часов с потенциалом уменьшения до 43 часов, если вторичная сушка инициировалась сразу при завершении первичной сушки.
При завершении 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе все флаконы закупоривали с давлением вакуума 600 торр. Данные лиофилизаты удаляли из камеры и анализировали. Лиофилизированный осадок KP8M2SN имел первоклассный внешний вид. Другие осадки демонстрировали признаки разрушения, особенно контроль. Растворенные образцы были прозрачными и сравнимыми с образцами перед лиофилизацией (Фиг. 4А-С). Содержание влаги данных осадков составляло 1,37% (KP8M2SN), 2,40% (KP8MS3N), 1,44% (KP8MT3N) и 1,25% (контроль) соответственно.
Концентрацию VM202 в каждом образце измеряли после растворения образца из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 5. Данные результаты показали то, что каждый образец содержал VM202 в аналогичной концентрации.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли СЕ в отношении чистоты продукта. Хроматограммы и данные по площади пиков (%) после СЕ показаны на Фиг. 5 и в ТАБЛИЦЕ 6. Результаты из анализов СЕ показали уменьшение площади пика суперспирализованной у KP8M2SN, KP8MT3N и контроля после лиофилизации и растворения. KP8MS3N имел самую большую площадь пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
В заключение, результаты показывают то, что KP8M2SN, содержащий 1,0% сахарозы и 0,1% NaCl, дает лучший лиофилизированный осадок, чем KP8MS3N, содержащий 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, или KP8MT3N, содержащий 0,5% трегалозы и 0,45% NaCl. Данные результаты дополнительно показывали то, что KP8MS3N, содержащий 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, имел наименьший уровень деградации при измерении СЕ. В целом, это свидетельствует о том, что препараты, содержащие сахарозу (KP8M2SN и KP8MS3N), имеют лучшие свойства (например, образование первоклассного осадка и стабильность), чем препарат, содержащий трегалозу (KP8MT3N).
6.8.1.2.4. Анализ 1-го набора 4MSN, 3MSN и 2MSN (2-ой раунд цикла лиофилизации в малом масштабе)
На основе результатов из 1-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе следующий цикл лиофилизации (2-ой раунд анализа в малом масштабе) сосредоточен на улучшении внешнего вида осадка посредством изменения концентрации маннита в KP8MS3N при поддержании его концентраций сахарозы (0,5%) и NaCl (0,45%).
Перед процессом лиофилизации 10 мкл образцы приготовленной в виде препарата VM202 - т.е. 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль (ТАБЛИЦА 1) - в концентрации 0,5 мг/мл анализировали посредством ДСК в условиях, близких к условиям окружающей среды, для характеристики препаратов-кандидатов. На Фиг. 6A-D проиллюстрированы результаты ДСК жидкого состояния из 2-го раунда анализа лиофилизации в малом масштабе. Контроль (Фиг. 6D) демонстрировал эвтектическую температуру плавления (Те) порядка -21°С. Температуру расстеклования (Td) наблюдали во всех препаратах (без отжига слева), и оно исчезало после отжига (справа). Из-за наблюдения сигналов расстеклования цикл лиофилизации 2 (ТАБЛИЦА 3) разрабатывали так, чтобы он включал стадию отжига во время замораживания для 2-го раунда анализа в малом масштабе.
Увеличение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов, затем последующее введение вакуума обеспечивало отжиг и индукцию кристаллизации маннита. Первичную сушку проводили при температуре полки -20°С (25 часов) с давлением камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 3). Вторичную сушку при температуре полки 20°С разрабатывали для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
На Фиг. 7 показан график динамики температур (левая ордината) и давлений (правая ордината) во время процесса лиофилизации для 2-го цикла анализа в малом масштабе. Температура продукта падала ниже -37°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 23 часа во время стадии первичной сушки, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 47 часов с потенциалом уменьшения до 42 часов, если вторичная сушка инициировалась сразу при завершении первичной сушки.
Как только цикл был завершен, образцы удаляли из лиофилизатора и анализировали. Посредством визуальной проверки 4MSN демонстрировал первоклассный осадок. 3MSN и 2MSN также демонстрировали неплохой осадок с пересыханием, тогда как контроль демонстрировал признаки разрушения осадка после лиофилизации. Образцы были прозрачными и бесцветными после растворения, сравнимыми с образцами до лиофилизации (Фиг. 8А-С). Содержание влаги осадка составляло 2,51% (4MSN), 2,15% (3MSN), 2,01% (2MSN) и 1,12% (контроль).
Концентрацию VM202 в каждом образце измеряли после растворения образца из 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 7. Данные результаты показали то, что каждый образец содержал VM202 в аналогичной концентрации.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 9 и в ТАБЛИЦЕ 8. 4MSN и 3MSN демонстрировали минимальную деградацию по площади пика суперспирализованной, тогда как 2MSN и контроль демонстрировали уменьшения пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Данные результаты свидетельствовали о том, что 4MSN (10 мМ фосфат калия, 4% маннит, 0,5% сахароза, 0,45% NaCl при рН 8,0) давал наилучший лиофилизированный осадок и наименьшую степень деградации при определении посредством СЕ во 2-ом раунде цикла лиофилизации в малом масштабе.
6.8.1.2.5. Анализ 2-го набора 4MSN, 3MSN и 2MSN (2-ой раунд цикла лиофилизации в малом масштабе)
Другой набор 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля получали посредством 2-го раунда цикла лиофилизации в малом масштабе, разработанного с температурой полки первичной сушки -20°С при давлении камеры 50 мТорр (6,67 Па) и температурой полки вторичной сушки 20°С при давлении камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 3). На Фиг. 10 показан график динамики температур и давлений, полученных во время данного цикла. Температура продукта падала ниже -37°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значения манометра Пирани сливались с показанием емкостного манометра приблизительно в 75 часов во время первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 87 часов.
Как только цикл был завершен, образцы удаляли из лиофилизатора и анализировали. Посредством визуальной проверки 4MSN демонстрировал первоклассный осадок. 3MSN и 2MSN также демонстрировали неплохой осадок с пересыханием, тогда как контроль демонстрировал признаки разрушения осадка после лиофилизации. При растворении некоторые флаконы во всех препаратах, за исключением контроля, демонстрировали замутненность, тогда как все образцы были прозрачными перед лиофилизацией (Фиг. 11A-F). Содержание влаги осадка составляло 0,97% (4MSN), 0,95% (3MSN), 1,69% (2MSN) и 1,06% (контроль).
Мутность: результаты по концентрации и мутности обобщаются в ТАБЛИЦЕ 9. Все образцы демонстрировали аналогичные значения концентрации после растворения. Для всех препаратов не было выявлено мутности перед лиофилизацией и после растворения.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и процентные содержания пиков из СЕ показаны на Фиг. 12 и в ТАБЛИЦЕ 10. 4MSN, 3MSN и контроль демонстрировали значительное уменьшение площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения. 2MSN демонстрировал минимальную деградацию в площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Данные результаты свидетельствовали о том, что 2MSN (10 мМ фосфат калия, 2% маннит, 0,5% сахароза, 0,45% NaCl с рН 8,0) давал наименьшую степень деградации, определенную СЕ, в данном отдельном наборе экспериментов для 2-го раунда анализа в малом масштабе.
Образцы, полученные в данном цикле лиофилизации, использовали на протяжении 10 недель исследования стабильности с ускоренной деградацией.
6.8.1.2.6. Анализ 2MSN и 2M1SN
Принимая во внимание то, что KP8MS3N и 2MSN, содержащие 2% маннита, 0,5% сахарозы и 0,45% NaCl, демонстрировали наименьшую степень деградации при измерении посредством СЕ в анализах 1-ого раунда и определенных анализах 2-го раунда в малом масштабе, препараты KP8MS3N и 2MSN дополнительно оптимизировали посредством изменения концентрации сахарозы при сохранении концентраций маннита (2%) и NaCl (0,45%) на том же самом уровне. В частности, готовили препарат 2M1SN, содержащий 2% маннита, 0,45% NaCl и 1,0% сахарозы, и анализировали по сравнению с 2MSN.
2M1SN и 2MSN лиофилизировали с использованием аналогичных параметров цикла лиофилизации относительно параметров, использованных в исследовании стабильности с ускоренной деградацией. На Фиг. 13 показаны измерения температуры и давления из данного цикла. Температура продукта падала ниже -41°С из-за теплопотери сублимации при приложении вакуума. Значения манометра Пирани сливались с показанием емкостного манометра приблизительно в 60 часов во время первичной сушки. Инициировали вторичную сушку, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился 76 часов с потенциалом уменьшения до 70 часов, если вторичную сушку инициировали немедленно при завершении первичной сушки.
После лиофилизации 2M1SN демонстрировал первоклассный осадок, а 2MSN демонстрировал неплохой осадок с небольшим пересыханием (Фиг. 14). При растворении 2M1SN давал прозрачный раствор, тогда как 2MSN демонстрировал замутненность. Оба препарата были прозрачными перед лиофилизацией. Содержание влаги осадков составляло 1,31% (2MSN) и 1,44% (2M1SN).
Мутность: препараты оценивали на концентрацию и мутность, и результаты обобщаются в ТАБЛИЦЕ 11. Все образцы демонстрировали аналогичные значения концентрации после растворения. Для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией определили, что измерения мутности при 450 нм лучше могли оценивать различия препаратов. Для 2M1SN не выявляли мутности перед лиофилизацией и после растворения. После растворения 2MSN наблюдали значительное увеличение мутности при 450 нм.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Хроматограммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 15 и в ТАБЛИЦЕ 12. 2MSN демонстрировал уменьшение площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения. 2M1SN демонстрировал минимальную деградацию в площади пика суперспирализованной после лиофилизации и растворения.
Образцы, продуцированные в данном цикле лиофилизации, использовали в течение 10 недель для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией.
6.8.1.3. Исследование стабильности с ускоренной деградацией 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля
Стабильности лиофилизированных препаратов VM202 - 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля - оценивали при разных условиях хранения при температуре охлаждения (5 плюс/минус 3°С), окружающей среды (25 плюс/минус 3°С) и ускоренной деградации (40 плюс/минус 3°С), а растворенных препаратов VM202 - при температуре окружающей среды в течение 3 или 7 суток.
Лиофилизированные образцы из исследования стабильности с ускоренной деградацией растворяли 5 мл фильтрованной воды в боксе микробиологической безопасности, повторно закупоривали, запечатывали и инкубировали при 25°С в течение 3 и 7 суток. После 3 и 7 суток инкубированные образцы удаляли из инкубатора и анализировали визуально, на концентрацию и анализом СЕ.
Визуальная проверка: после хранения препаратов 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроля при 25°С в течение 3 суток (Фиг. 16А) и 7 суток (Фиг. 16В) не наблюдали изменений внешнего вида после растворения по сравнению с Т, равным 0.
В каждый момент времени образцы анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202. Концентрация каждого препарата после хранения при 25°С в течение 3 и 7 суток является аналогичной результатам, полученным в Т, равное 0 (ТАБЛИЦА 13). Все образцы находились в пределах 5% от целевого значения концентрации. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Капиллярный электрофорез: анализ СЕ использовали для отслеживания чистоты продукта во время хранения при заданной температуре. Хроматограммы СЕ и результаты в табличной форме для препаратов после хранения подробно описываются на Фиг. 17А-В и в ТАБЛИЦЕ 14. Все препараты (т.е. 4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль) демонстрировали снижения площади пика суперспирализованной после хранения при 25°С от 3 до 7 суток. 2MSN демонстрировал наилучшую стабильность от 3 до 7 суток только с 1,1% уменьшения площади пика суперспирализованной.
Лиофилизированные препараты VM202 хранили в течение 10 недель при 5°С, 25°С и 40°С (ТАБЛИЦА 4). В каждый момент времени образцы удаляли с хранения при заданной температуре и оценивали визуально. Делали фотографии флаконов, и образцы оценивали на форму осадка. Все лиофилизированные осадки оставались интактными и не демонстрировали каких-либо признаков изменения при хранении, независимо от температурных условий (контрольный осадок оставался поднятым). Данные образцы затем растворяли 5 мл фильтрованной воды и оценивали на прозрачность и выпадение осадка. Большинство образцов для 4MSN, 3MSN и 2MSN демонстрировали небольшие различия в прозрачности по сравнению с Т равно 0. Внешний вид каждого препарата после хранения при 5°С (Фиг. 18С), 25°С (Фиг. 18А) и 40°С (Фиг. 18В) в течение 10 недель показан на Фиг. 18А-С.
Также проводили анализы концентрации, мутности, содержания влаги и анализы капиллярным электрофорезом для оценки стабильности лиофилизированного VM202 во время температурных стрессов.
В каждый момент времени образцы растворяли и анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202 во флаконах. В ТАБЛИЦЕ 15 показано то, что концентрация VM202 в лиофилизированных образцах после 10 недель хранения при заданной температуре является аналогичной результатам, полученным при Т равно 0. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Мутность: мутность каждого образца также оценивали в каждый момент времени в данном исследовании. Результаты подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 16. Мутность растворенных препаратов 4MSN, 3MSN и 2MSN значительно не изменялась после 10 недель хранения, независимо от температурных условий.
В каждый момент времени также проводили анализ содержания влаги. В ТАБЛИЦЕ 17 описаны результаты для содержания влаги после 10 недель хранения при заданной температуре. После 10 недель хранения при 5°С, 25°С и 40°С наблюдали небольшие снижения содержания влаги зависимым от температуры образом. Более высокие температуры хранения приводили к меньшему содержанию влаги. 2MSN имел наибольшее содержание влаги во время исследования стабильности с ускоренной деградацией.
Капиллярный электрофорез: анализ капиллярным электрофорезом использовали для отслеживания чистоты продукта. Хроматограммы СЕ и значения площади пиков после 10 недель инкубации при 40°С показаны на Фиг. 19 и в ТАБЛИЦЕ 18 соответственно. Все препараты демонстрировали значительные снижения площади пика суперспирализованной с соответствующими увеличениями площади пика открытой кольцевой по сравнению с Т равно 0 после растворения после хранения в течение 10 недель при 40°С. 2MSN демонстрировал наибольшую площадь пика суперспирализованной, хотя данное значение и было значительно ниже в 10 недель хранения при 40°С, чем во время ноль. Большие уровни площади пика открытой кольцевой наблюдали в препаратах, содержащих 3% и 4% маннита, а также в контрольном препарате.
Тенденции по чистоте пика суперспирализованной, определенного СЕ, взвешенные стандартным отклонением и включающие планки ошибок отклонения, в течение 10 недель при разных температурах подробно описываются на Фиг. 20А-С - 5°С (Фиг. 20А), 25°С (Фиг. 20В) или 40°С (Фиг. 20С). Значительные различия в чистоте наблюдали после инкубации при повышенной температуре. Как проиллюстрировано на Фиг. 20А-С, 2MSN, содержащий 2% маннита и 0,45% NaCl, демонстрировал наивысший уровень чистоты после хранения при 40°С.
Тенденции примесей пиков открытой кольцевой, выявленных СЕ, после хранения при разных температурах также представлены на Фиг. 21А-С. Небольшие увеличения площадей пиков открытой кольцевой наблюдали при 5°С. Однако при 25°С или выше все препараты демонстрировали значительную деградацию. После инкубации при 40°С более высокие уровни примесей открытой кольцевой наблюдали для 4MSN, 3MSN и контроля. По сравнению с этим 2MSN демонстрировал значительно меньшую деградацию при всех температурах.
6.8.1.4. Исследование стабильности с ускоренной деградацией 2MSN и 2M1SN
Стабильности лиофилизированных препаратов VM202, 2MSN и 2M1SN также оценивали после инкубации при температуре окружающей среды (25°С) в течение 3 или 7 суток. Образцы растворяли 5 мл фильтрованной воды в боксе микробиологической безопасности, повторно закупоривали, запечатывали и инкубировали при 25°С в течение 3 и 7 суток. После 3 и 7 суток инкубированные образцы удаляли из инкубатора и анализировали посредством визуальной проверки, концентрационного анализа и анализа СЕ.
Визуальная проверка: визуальную проверку проводили в оба момента времени (Фиг. 22A-D). Замутненность наблюдали в 2MSN после 3 и 7 суток хранения при 25° после растворения. 2M1SN оставался прозрачным в оба момента времени.
В каждый момент времени образцы анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202. Концентрации VM202 в обоих препаратах были целевыми в Т, равное 0, и после инкубации при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения (ТАБЛИЦА 19). Следовательно, температурный стресс не индуцировал значительных изменений концентрации VM202.
Капиллярный электрофорез: Образцы также анализировали на чистоту продукта посредством СЕ после хранения при заданной температуре. Хроматограммы СЕ и результаты по площади пиков образцов после хранения иллюстрируются на Фиг. 23А-В и в ТАБЛИЦЕ 20. Оба препарата демонстрировали аналогичные площади пиков суперспирализованной после хранения. 2M1SN демонстрировал большую площадь пика суперспирализованной по сравнению с 2MSN.
Стабильность во время хранения: лиофилизированные препараты VM202 для дополнительного исследования стабильности с ускоренной деградацией хранили на протяжении 10-недельного периода при 5°С, 25°С и 40°С (ТАБЛИЦА 4). В каждый момент времени образцы забирали с хранения при заданной температуре и оценивали визуально. Делали фотографии флаконов, и образцы оценивали на форму осадка. Образцы растворяли 5 мл фильтрованной воды и оценивали на прозрачность и выпадение осадка. Все лиофилизированные осадки оставались интактными и не показывали какого-либо признака изменения при хранении независимо от температурных условий. Наблюдали замутненность в растворенном 2MSN после хранения в течение 10 недель. 2M1SN был прозрачным после хранения. Внешний вид каждого препарата после хранения в течение 10 недель при 5°С, 25°С и 40°С показан на Фиг. 24А-С.
Проводили анализы концентрации, мутности, содержания влаги и анализ капиллярным электрофорезом для оценки стабильности лиофилизированного VM202 во время температурных стрессов.
В каждый момент времени образцы растворяли и анализировали на поглощение при 260 нм для определения концентрации VM202 во флаконах. В ТАБЛИЦЕ 21 показано то, что концентрация VM202 в лиофилизированных образцах после 10 недель хранения при заданной температуре является аналогичной результатам, полученным при Т, равном 0. Следовательно, температурный стресс не индуцировал больших изменений в концентрации VM202.
Мутность каждого образца также оценивали в каждый момент времени для двух (2) разных длин волн. В то время как операторы выявляли видимую замутненность в образцах, значимое различие в мутности не наблюдалось при измерении при длине волны 650 нм. Следовательно, определяли то, что 450 нм были адекватными для оценки различий в мутности между препаратами. Результаты из данной оценки подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 22. 2MSN демонстрировал умеренное поглощение при 450 нм, независимо от температурных условий хранения. 2M1SN демонстрировал низкое поглощение при 450 нм при всех температурах.
Анализ содержания влаги также проводили в каждый момент времени. В ТАБЛИЦЕ 23 описаны результаты относительно содержания влаги после 10 недель хранения при заданной температуре. После 10 недель хранения при 5°С, 25°С и 40°С наблюдали аналогичное содержание влаги во всех образцах, за исключением 2M1SN, хранящегося при 5°С, который демонстрировал слегка повышенное содержание влаги (1,56%).
Анализ капиллярным электрофорезом использовали для отслеживания чистоты продукта. Хроматограммы СЕ и значения площади пиков после 10 недель инкубации при 40° показаны на Фиг. 25 и в ТАБЛИЦЕ 24 соответственно. Оба препарата демонстрировали значительные уменьшения площади пика суперспирализованной с соответствующими увеличениями пика открытой кольцевой по сравнению с Т, равным 0, после растворения после хранения в течение 10 недель при 40°С. 2M1SN демонстрировал наибольшую площадь пика суперспирализованной, хотя данное значение и было значительно ниже в 10 недель хранения при 40°С, чем во время ноль. Наибольшие уровни площади пика открытой кольцевой наблюдались у 2 MS N.
Тенденции чистоты пика суперспирализованной, определенного СЕ, на протяжении 10 недель при разных температурах подробно описываются на Фиг. 26А-С - при 5°С (Фиг. 26А), при 25°С (Фиг. 26 В) или при 40°С (Фиг. 26С). Значительные различия в чистоте наблюдали после инкубации при повышенной температуре. Как проиллюстрировано в ТАБЛИЦЕ 24, 2M1SN, содержащий 1% сахарозы и 0,45% NaCl, демонстрировал наивысший уровень чистоты после хранения при 40°С.
Тенденции примесей пиков открытой кольцевой, выявленных СЕ, во время хранения при заданной температуре представлены на Фиг. 27А-С - при 5°С (Фиг. 27А), при 25°С (Фиг. 27В) или при 40°С (Фиг. 27С). Данные графики демонстрируют увеличения пика открытой кольцевой, соответствующие хранению при повышенной температуре хранения. После инкубации при 40°С более высокий уровень примеси пика открытой кольцевой наблюдали для 2MSN. 2M1SN демонстрировал меньший пик открытой кольцевой при всех температурах, но следовал такой же тенденции, что и 2MSN.
6.8.1.5. Краткое изложение результатов анализа
Перед лиофилизацией все проанализированные препараты, содержащие плазмидную ДНК (VM202), оставались прозрачными, без обесцвечивания или видимых частиц. Кроме того, результаты капиллярного электрофореза (СЕ) согласованно демонстрировали высокую чистоту всех данных композиций.
Первый и второй раунды анализа лиофилизации в малом масштабе осуществляли для VM202 с использованием шести (6) разных препаратов (KP8M2SN, KP8MS3N(равно 2MSN), KP8MT3N, 4MSN, 3MSN и контроль), где продукт заполняли в объеме 0,75 мл в 3 мл стеклянные флаконы. Исследование стабильности с ускоренной деградацией осуществляли для VM202 с использованием таких же четырех (4) препаратов (4MSN, 3MSN, 2MSN и контроль) второго раунда лиофилизации в малом масштабе, заполненных в объеме 5 мл в 20 мл стеклянные флаконы, и параметры лиофилизации определяли из данных, полученных из исследований лиофилизации в малом масштабе. Также два (2) других препарата (2MSN и 2M1SN) анализировали в дополнительном исследовании стабильности с ускоренной деградацией на основе данных из исходного исследования стабильности с ускоренной деградацией. Данные циклы лиофилизации разрабатывали из результатов, полученных после анализа ДСК при условиях, близких к условиям окружающей среды. В лиофилизационный цикл включали стадию отжига, так как было определено то, что после отжига устранялась температура расстеклования.
После лиофилизации наблюдали первоклассные или неплохие осадки для всех композиций, за исключением контроля, содержащего 0,9% NaCl и 1,1% сахарозы. Контролем является препарат, описанный ранее в патенте США №8389492, который включается в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.
Однако после растворения лиофилизированных композиций все проанализированные композиции, за исключением 2M1SN (10 мМ фосфат калия, рН 8,0, 2% маннит, 1% сахароза, 0,45% NaCl) оказывались помутневшими. Данное замутнение оставалось даже после хранения растворенных композиций при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения. Только 2M1SN оставался прозрачным после растворения и следующего хранения при 25°С в течение 3 и 7 суток после растворения, и отсутствовало изменение концентраций VM202 в 2M1SN на протяжении всего данного исследования.
Капиллярный электрофорез был эффективным в оценке чистоты продукта VM202. После лиофилизации и растворения все препараты демонстрировали уменьшения площади пика суперспирализованной. Уменьшение площади пика суперспирализованной также наблюдали во всех препаратах после 10 недель хранения при 25°С и 40°С. Однако 2M1SN демонстрировал наибольшую процентную долю пика суперспирализованной, соответствующую наименьшему увеличению процентной доли пика открытой кольцевой на протяжении 10 недель исследования стабильности.
Данные результаты свидетельствуют о том, что лиофилизированная VM202 сохраняет первоклассный вид осадка и наивысший уровень чистоты (суперспирализованной ДНК) после лиофилизации и хранения при приготовлении в концентрации 0,5 мг/мл с 10 мМ фосфатом калия, рН 8,0, 2% маннитом, 1% сахарозой, 0,45% NaCl при объеме заполнения 5 мл в 20 мл флаконах (2M1SN в ТАБЛИЦЕ 25). Хотя показатель нестабильности и возрастает для VM202 при более высоких температурах, в данном препарате 2M1SN наблюдали меньше деградации, чем в других проанализированных препаратах.
6.8.2. Пример 2: лиофилизированная композиция VM202 (исследование 002)
Получали разные лиофилизированные препараты, содержащие VM202, и анализировали для того, чтобы протестировать качество VM202 в препарате лекарственного продукта после лиофилизации, а также качество VM202 в препаратах с небольшими вариациями рН и/или концентраций наполнителей и стабилизаторов.
6.8.2.1. Схема экспериментов
Материалы: активным фармацевтическим ингредиентом (API, от англ. active pharmaceutical ingredient), проверенным в данном исследовании, была VM202. Вещество, используемое для данного исследования, содержало следующее: реактивы и вещества, использованные для приготовления и анализа VM202 были следующими:
Параметр приготовления препарата: в данном исследовании фиксировали следующие параметры:
(1) Объем заполнения: 5 мл
(2) Концентрация API: 0,5 мг/мл
(3) Концентрация буфера: 10 мМ калий-фосфатный
(4) Концентрация сахарозы: 1%
В данных препаратах проверяли следующие параметры приготовления препарата:
(1) рН: 7,0; 8,0 и 9,0
(2) Концентрация маннита: 1% и 2%
(3) Концентрация хлорида натрия: 0,45%, 0,6% и 0,9%
Для анализа готовили препарат, перечисленный ниже в ТАБЛИЦЕ 27:
6.8.2.2. Получение препаратов
6.8.2.2.1. Исследование в малом масштабе
Анализ в малом масштабе проводили для определения значений рН буфера, требующихся для того, чтобы разводить лекарственное вещество (DS, от англ. drug substance) для достижения целевых значений рН препарата в ТАБЛИЦЕ 27. Для консервации лекарственного вещества проводили исследование разведений в малом масштабе с плацебо в виде 0,9% NaCl (такой же препарат, что и для DS) вместо DS. Плацебо в виде 0,9% NaCl готовили без корректировки рН для лучшего представления композиции препарата DS. Композицию буфера для разведения (ТАБЛИЦА 28) рассчитывали на основе разведения DS от 1,6 мг/мл до 0,5 мг/мл. Анализ в малом масштабе выявил то, что после разведения буферами для приготовления препаратов все конечные препараты демонстрировали значения рН в или около целевых значений в ТАБЛИЦЕ 27. Однако, поскольку рН препарата F3 (9,0) находился за пределами буферизующего интервала фосфата, наблюдали сползание рН к меньшим значениям. Для наилучшей компенсации этого выбирали буфер для разведения с более высоким рН (9,5). Тестирование в малом масштабе продемонстрировало рН 9,2 сразу после разведения, затем снижение рН до 9,1 и 8,5 через 24 и 48 часов соответственно.
Для наилучшего достижения целевых значений рН для данного исследования готовили препараты в пределах одних суток после лиофилизации, и отслеживали изменения рН после растворения. Для получения препарата использовали буферы для разведения, показанные в ТАБЛИЦЕ 28.
6.8.2.2.2. Лиофилизация
VM202 в концентрации 1,6 мг/мл в 0,9% NaCl, поставленном от Cobra, удаляли с хранения при -70°С и оттаивали при 5°С в течение ночи. 35 мл DS разводили в 21 мл буферов для разведения (ТАБЛИЦА 28) до концентрации 1,0 мг/мл. После разведения измеряли рН и концентрацию API. Несмотря на результаты анализа в малом масштабе с использованием плацебо, данные препараты в присутствии VM202 не давали целевых значений рН, таким образом, рН исходных буферов для разведения дополнительно корректировали во время разведения 1,0 мг/мл DS в 48 мл буфера для разведения (ТАБЛИЦА 29) до конечной концентрации 0,5 мг/мл.
После разведения препараты подвергали стерилизующему фильтрованию с использованием 0,2 мкм фильтра на основе ацетата целлюлозы, заполняли в 20 мл стеклянные, апирстенные флаконы с 5 мл объемом заполнения (доза 2,5 мг) в BSC (бокс микробиологической безопасности). После заполнения флаконы частично закупоривали и загружали в лиофилизатор для сублимационной сушки. Пустые флаконы использовали для полного окружения флаконов, содержащих DS VM202. После лиофилизации данные флаконы полностью закупоривали внутри лиофилизационной камеры с частичным вакуумом 600 торр перед удалением. Данные флаконы закрывали обжимными колпачками, метили и помещали при -70°С. Один (1) флакон каждого препарата помещали при 5°С. Один (1) флакон на каждый препарат растворяли 5 мл фильтрованной воды Milli-Q и анализировали с использованием образцов до лиофилизации.
6.8.2.2.3. Способы анализа
Лиофилизированные препараты анализировали в разные моменты времени, как обобщено в ТАБЛИЦЕ 30.
Визуальная проверка: визуальную проверку проводили под источником белого света (13 Вт флуоресцентная трубка) относительно черного и белого фона. Получали цифровые фотографии всех препаратов.
Измерение концентрации (А260): спектрофотометрический анализ проводили с кварцевой кюветой с 1 см длиной пути посредством Beckman Coulter DU800. Концентрацию плазмидной ДНК опытных образцов определяли посредством измерения поглощения при 230, 260, 280 и 350 нм. Анализы концентрации проводили с использованием протокола УФ/Вид. от Helixmith. Расчеты проводили с использованием следующих уравнений:
Концентрация (мкг/мл)=[(D-E)/C] × (В/А)
Выход=(низкая мкг/мл) / (высокая мкг/мл) × 100%
ОП260nm / ОП280nm=D / F
ОП260nm / ОП230nm=D / G
Где:
А - масса образца, взятого для разведения
В - общая масса образца и буфера, используемых для разведения
С - коэффициент экстинкции 0,005% раствора в кювете с длиной пути 1 см (0,02)
D - оптическая плотность для максимума при 260 нм. Е - поглощение, измеренное при 350 нм
F - поглощение, измеренное при 280 нм
G - поглощение, измеренное при 230 нм
Критерии принятия:
D должна попадать в интервал от 0,5 до 1,5 единиц ОП
Выход должен составлять 98% или больше
ОП260нм / ОП280нм - должно попадать в интервал от 1,8 до 2,0
ОП260нм/ ОП230нм - должно составлять 1,1 или больше
рН: анализ рН проводили с использованием рН-метра SympHony® (VWR Scientific, каталожный № SB70P), откалиброванного с тремя стандартными растворами рН (рН 4, 7 и 10) с наклоном калибровки 95% или выше. В образцах не корректировали температуру, обеспечивали их уравновешивание при температуре окружающей среды и осуществляли измерение.
Измерение мутности (А350, А450, А650): мутность определяли посредством измерения поглощения образца при 350, 450 и 650 нм с использованием Beckman Coulter DU800. Обычно считается, что препараты с А650 больше 0,01 демонстрируют повышенную мутность.
Капиллярный зональный электрофорез: перед анализом капилляр доводили до кондиции посредством пропускания воды Milli-Q, 0,1 н. NaOH, 0,1 н. HCl и вновь воды Milli-Q - каждого при 137,9 кПа в течение 10 минут (доведение до кондиции длилось всего 40 минут). 40 мкл образца в концентрации 0,5 мг/мл загружали в полиэтиленовую вставку для анализа.
Прибор: Beckman Coulter PA 800+ СЕ (S/N 3063309)
Капилляр: нейтральный покрытый капилляр, внутренний диаметр 50 мкм, общая длина 40 см, эффективная длина 30 см, апертура 8 мкм (Beckman Coulter P/N 477441, № партии М812134)
Анализ данных: 32 Karat (версия 9.0)
Давление/время инъекции: 3,447 кПа; 60 с
Буфер для разделения/давление: 100 мМ фосфорная кислота (рН 2,60), 85%/137,9 кПа; 60 с
Промывочный буфер/давление: вода Milli-Q / 137,9 кПа; 60 с
Выявление: УФ при 254 нм
Напряжение разделения: 17 кВ; линейное изменение - 0,17 мин; 14 мин.
Остаточное содержание влаги: для анализа содержания влаги использовали Karl Fisher Coulometer С20 (Mettler Toledo). Для определения точности системы использовали печь водного стандарта Apura 1%. Флаконы с образцами доводили до комнатной температуры перед удалением колпачков для анализа. Для каждого анализа использовали приблизительно 100 мг вещества.
6.8.2.3. Краткое изложение результатов анализа
В данном разделе обобщается качество лиофилизированной VM202 в разных препаратах.
6.8.2.3.1. Профиль цикла лиофилизации
Для лиофилизации 2,5 мг доз VM202 в разных препаратах использовали разработанный ранее цикл лиофилизации. Линейное изменение температуры замораживания от -50°С до -20°С и выдерживание в течение двух (2) часов перед созданием вакуума обеспечивало осуществление отжига. Процесс отжига помогает кристаллизации аморфных эксципиентов. Из-за уникальной характеристики лиофилизатора, используемого в данных экспериментах, который может прекратить программу, если вакуум не достигает установленной точки в пределах данных временных рамок, в начале первичной сушки использовали стадию, где исходно создается вакуум 100 мТорр (13,33 Па), и он корректируется до конечного вакуума по мере начала первичной сушки. Первичная сушка проводится при температуре полки -20°С (порядка 53,4 часов) с давлением камеры 50 мТорр (6,67 Па) (ТАБЛИЦА 31). Вторичная сушка при температуре полки 20°С разработана для удаления остаточной воды, которая не сублимировалась во время стадии первичной сушки.
* Время первичной сушки изменяли от 3240 мин до 3200 мин из-за ограничений программы. Показания манометра Пирани и емкостного манометра сливались перед переходом ко вторичной сушке.
На Фиг. 28 показан график всего цикла лиофилизации. Температура продукта падала до примерно -40°С из-за теплопотери от сублимации при приложении вакуума. Значение манометра Пирани сливалось с показанием емкостного манометра приблизительно в 41 час, что подтверждало завершение процесса первичной сушки. После 62 часов всего цикла инициировали вторичную сушку пи 20°С, и давали образцам сохнуть в течение еще 13 часов. Весь цикл длился приблизительно 75 часов.
Измеренное содержание влаги осадков показано в ТАБЛИЦЕ 32.
6.8.2.3.2. Исследование лиофилизации
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2 и F3 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. Полное разрушение осадков наблюдали для F4 (Фиг. 32) и F6 (Фиг. 34). Растворенные жидкие образцы F1 (Фиг. 29), F2 (Фиг. 30), F3 (Фиг. 31), F4 (Фиг. 32) и F5 (Фиг. 33) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, что сравнимо с контролем перед лиофилизацией. После растворения F6 был помутневшим.
Концентрация (А260): все образцы имели их целевые концентрации перед лиофилизацией и после растворения, как приводится в ТАБЛИЦЕ 33.
рН и время растворения: из-за ограничения буферизации препарата F3 рН F3 не был стабильным и быстро снижался во время заполнения. Ко времени анализа образцов перед лиофилизацией он уже снижался от рН 9,0 до 8,7. Дальнейшее снижение значения рН наблюдали после растворения (Δ равно -0,4) по сравнению с контролем перед лиофилизацией. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,1) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся через 1-1,5 минуты. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 34.
Мутность (А350, А450, А650): небольшие увеличения мутности наблюдали для F6 при 350 нм, 450 нм и 650 нм после растворения. Все другие препараты не демонстрировали значительной мутности перед лиофилизацией или после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 35.
Примечание: поглощение воды вычитали для получения значений мутности для образцов с А650, большим или равным 0,01, рассматриваемым как мутный.
Капиллярный зональный электрофорез (CZE): растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством CZE. F6 не анализировали из-за мутности. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от CZE подробно описываются на Фиг. 35 и в ТАБЛИЦЕ 36 соответственно. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной (97,5%-99,0%) по сравнению с образцами перед лиофилизацией (99,1%-100,0%). F4 и F5 демонстрировали наименьшее увеличение процентной доли пика открытой кольцевой, меньшее чем или равное 0,4% по сравнению с другими препаратами. За исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наивысшую чистоту перед (100%) и после лиофилизации (98,6%).
Заключения: целью данного исследования была оценка качества VM202 в препарате лекарственного продукта - 0,5 мг/мл VM202 в 10 мМ фосфате калия с 2% маннита, 1% сахарозы, 0,45% NaCl при рН 8,0, с последующей лиофилизацией, а также качества VM202 в препаратах с легкими вариациями рН и/или концентраций наполнителей и стабилизаторов из препарата лекарственного продукта. Аналитические способы, применяемые в данном исследовании, включали капиллярный зональный электрофорез (CZE, от англ. capillary zone electrophoresis), визуальную проверку на прозрачность и внешний вид осадка, анализы мутности, концентрации (А260), рН и содержание влаги (Карл Фишер), которые все, как было показано, являются эффективными указывающими стабильность анализами продукта.
В данном исследовании лиофилизированного препарата VM202 оценивали в дозе 2,5 мг на флакон при объеме заполнения 5 мл. Анализ рН в малом масштабе проводили с плацебо в виде 0,9% NaCl для установления правильных процедур приготовления препарата посредством способа разведения для VM202 в большем масштабе.
Перед лиофилизацией все препараты VM202 были прозрачными без обесцвечивания, не содержали видимых частиц, а концентрация была целевой. рН препарата 10 мМ фосфата калия, составляющий 9,0, не был стабильным и быстро снижался во время заполнения, с дальнейшими снижениями, наблюдаемыми после лиофилизации и растворения. Результаты капиллярного зонального электрофореза для всех препаратов перед лиофилизацией демонстрировали высокую чистоту, причем препарат лекарственного продукта демонстрирует наивысшую процентную долю пика суперспирализованной.
После лиофилизации для препарата лекарственного продукта и препаратов лекарственного продукта при более высоких и более низких рН наблюдали неплохие осадки. После растворения препарат с наивысшей концентрацией NaCl демонстрировал мутность, тогда как остальные препараты были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, сопоставимо с контролем перед лиофилизацией. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной. Исключая препараты с плохим внешним видом осадка, препарат лекарственного продукта после лиофилизации демонстрировал наивысшую чистоту, определенную посредством капиллярного зонального электрофореза.
Результаты, полученные из данного исследования, свидетельствуют о том, что лиофилизированный VM202 сохраняет неплохой внешний вид осадка и наивысший уровень чистоты (суперспирализованной ДНК) после лиофилизации в концентрации 0,5 мг/мл с 10 мМ фосфатом калия при рН 8,0, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,45% NaCl при объеме заполнения 5 мл в 20 мл флаконах.
6.8.3. Пример 3: лиофилизированная композиция pTx-IGF-1X10
Разные лиофилизированные препараты, содержащие pTx-IGF-1X10 получали и анализировали на качество pTx-IGF-1X10 в препарате после лиофилизации. Для анализа получали препараты, перечисленные ниже в ТАБЛИЦЕ 37.
6.8.3.1. Краткое изложение результатов анализа
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2, F7, F8 и F9 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. F3 имел разбрызганный вид. Для F4 и F6 наблюдали полное разрушение осадков. Растворенные жидкие образцы F1 (Фиг. 36), F2 (Фиг. 37), F3 (Фиг. 38), F4 (Фиг. 39), F5 (Фиг. 40), F6 (Фиг. 41), F7 (Фиг. 42), F8 (Фиг. 43) и F9 (Фиг. 44) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц - сопоставимо с контролем перед лиофилизацией. Для определения мутности (прозрачности) образцов образцы сравнивали с калибровочным стандартом мутности 4000NTU I, II, III, IV. Препарат с «прозрачностью меньше 1» может оцениваться как немутный.
Концентрация (А260): все образцы имели их целевые концентрации до лиофилизации и после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 38.
рН и время растворения: значение рН F3 снижалось от рН 9,0 до 7,6 после растворения. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6, F7, F8, F9 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,5) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся от 1 мин 20 с до 4 мин 05 с. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются в ТАБЛИЦЕ 39.
Капиллярный электрофорез (СЕ): растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 45 и в ТАБЛИЦЕ 40 соответственно. После растворения все препараты, за исключением F3, демонстрировали небольшие увеличения (0,5-3%) пика открытой кольцевой с соответствующими уменьшениями пика сверхспральной по сравнению с препаратами перед лиофилизацией. За исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наименьшее уменьшение пика суперспирализованной после лиофилизации.
6.8.4. Пример 4: Лиофилизированная композиция pCK-SDF-1α
6.8.4.1. Схема эксперимента
Разные лиофилизированные препараты, содержащие pCK-SDF-1α, получали и анализировали на качество pCK-SDF-1α в препарате после лиофилизации. Для анализа получали препараты, перечисленные ниже в ТАБЛИЦЕ 41.
6.8.4.2. Краткое изложение результатов анализа
Визуальная проверка: после лиофилизации F1, F2, F3, F7, F8 и F9 демонстрировали неплохие осадки лишь с легким пересыханием. F5 демонстрировал значительное пересыхание осадка. Полное разрушение осадков наблюдали для F4 и F6. Образцы полученной в результате растворения жидкости F1 (Фиг. 46), F2 (Фиг. 47), F3 (Фиг. 48), F4 (Фиг. 49), F5 (Фиг. 50), F6 (Фиг. 51), F7 (Фиг. 52), F8 (Фиг. 53) и F9 (Фиг. 54) были прозрачными, бесцветными и не содержали видимых частиц, сопоставимо с контролем до лиофилизации. Для определения мутности (прозрачности) образцов образцы сравнивали с калибровочным стандартом мутности 4000NTU I, II, III, IV. Препарат с «прозрачностью меньше I» может оцениваться как немутный.
Концентрация (А260): все образцы находились в их целевых концентрациях перед лиофилизацией и после растворения, как приводится ниже в ТАБЛИЦЕ 42.
рН и время растворения: значение рН F3 снижалось от рН 9,0 до 7,9 после растворения. После растворения препараты F1, F2, F4, F5, F6, F7, F8, F9 демонстрировали такие же значения рН (Δ меньше или равно 0,5) по сравнению с их контролями перед лиофилизацией. Анализ времени растворения показал то, что лиофилизированный осадок растворялся от 1,5 мин до 4 мин. Результаты по рН и времени растворения подробно описываются ниже в ТАБЛИЦЕ 43.
Капиллярный электрофорез: растворенные образцы дополнительно проверяли на чистоту продукта посредством СЕ. Электрофореграммы и результаты в табличной форме от СЕ подробно описываются на Фиг. 55 и в ТАБЛИЦЕ 44 соответственно. После растворения все препараты демонстрировали небольшие увеличения (0,5-2%) пика открытой кольцевой с соответствующими снижениями пика суперспирализованной по сравнению с препаратами перед лиофилизацией. С исключением препаратов с плохим внешним видом осадка, настоящий препарат (F1) демонстрировал наименьшее уменьшение пика суперспирализованной после лиофилизации.
7. Включение посредством ссылки
Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, процитированные в данной заявке, являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка или другой документ были индивидуально указанными как включенные посредством ссылки для всех целей.
8. Эквиваленты
В то время как разные конкретные воплощения были проиллюстрированы и описаны, приведенное выше описание изобретения не является ограничивающим. Будет понятно, что могут быть сделаны разные изменения без отступления от сущности и объема данного(ных) изобретения(ний). Многие вариации станут очевидными для специалистов в данной области при обзоре данного описания изобретения.
Перечень последовательностей:
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> HELIXMITH CO., LTD.
<120> ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ГОЛОЙ ДНК
<130> 33730-40319/WO (014WO)
<140>
<141>
<150> 62/700,655
<151> 2018-07-19
<160> 36
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 728
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 2
<211> 723
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165 170 175
Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180 185 190
Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195 200 205
Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210 215 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245 250 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305 310 315 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355 360 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370 375 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405 410 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435 440 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450 455 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465 470 475 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485 490 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
545 550 555 560
Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580 585 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610 615 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625 630 635 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645 650 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660 665 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675 680 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690 695 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
Pro Gln Ser
<210> 3
<211> 482
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
ag 482
<210> 4
<211> 1675
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 60
aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 120
catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 180
ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 240
cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 300
ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 360
tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 420
aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 480
tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 540
aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 600
catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 660
ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 720
atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 780
tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 840
gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 900
tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 960
acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 1020
gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 1080
tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 1140
tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 1200
atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 1260
tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 1320
ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 1380
ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 1440
tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 1500
ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 1560
tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 1620
ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag 1675
<210> 5
<211> 3756
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 5
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560
ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 1620
atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga 1920
aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 1980
cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2040
tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2100
tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2160
ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2220
tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 2280
tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 2340
gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 2400
cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 2460
gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt 2520
tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 2580
agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 2640
agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 2700
aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc 2760
ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca 2820
gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta 2880
agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc 2940
cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa 3000
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3060
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3120
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3180
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3240
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3300
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3360
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3420
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3480
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3540
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3600
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3660
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3720
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg 3756
<210> 6
<211> 4956
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc 60
atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg 120
tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg 180
ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta 240
tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag 300
tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta 360
ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca 420
cctgctgcaa gcccttgacg aatcttactt agaagatgac aacacagaac aattaaatca 480
gaatctctgg ggagaatagg gcaccagtat tttttgagct cccaccatga ttccaaagtg 540
cagccaaatt tgagaaccac tgctaaaagc tcaagcttca gattgaccag cttttccatc 600
tcacctatcg cctaaagacc aaattggata aatgtgttca ttacgacaga tgggtactat 660
ttaaagatga gtaaacacaa tatacttagg ctcgtcagac tgagagtttt aatcatcact 720
gaggaaaaac atagatatct aatactgact ggagtattag tcaaggctta tttcacacac 780
aattttatca gaaaccaaag tagtttaaaa cagctctccc cttattagta atgcattgga 840
gggtttactt taccatgtac cttgctgagc actgtacctt gttaatctca tttacttgta 900
atgagaacca cacagcgggt agttttattg gttctatttt acctacatga caaaactgaa 960
gcataaaaac acttagtaag ttttcagtgt catgcacaac taggaagtga catggccaga 1020
atataagccc agtcaccatc actctataac ctgcgctttt aacaacttca gggcatgaca 1080
catttggccg gtcagtagaa cccatgctgt gatttgtttt tgcagtggtg gtgatgactg 1140
ccttgttgaa tccacttttt attctattcc attttgggga cacaattctg caagatgatt 1200
cttcattagg aaacagagat gagttattga ccaacacaga aagaaaaaga gtttgttgct 1260
ccacactggg attaaaccta tgatcttggc ctaattaaca ctagctagta agtgtccaag 1320
ctgatcatct ctacaacatt tcaataacag aaaacaacaa ttttcaaaat tagttactta 1380
caattatgta gaaatgcctc taaaacacag tattttcctt atattacaaa aacaaaaatt 1440
ataattggtt ttgtcctctt ttgagagttt gcatggtgtt actccctgca tagtgaagaa 1500
aacattttat ttaagtagat ggatctaagt ttttcatgaa caaaggaatg acatttgaaa 1560
tcaatcctac cctagtccag gagaatgcat tagattaacc tagtagaggt cttatttcac 1620
cctgagtttt ctatgatcgt gattctctgc tggaggagta attgtgaaat agatctctct 1680
gggaactggc ttcctagtcc aatcagctct tttaccaatg aacacttcct tgtgatatag 1740
atgtttatgg ccgagaggat ccagtatatt aataaaatcc ctttttgtat tcaatgaggg 1800
aaacacataa ttttcatcaa ttagcagctt attggaatat ctgcatgatg gtttaacact 1860
tttaagtgtt gactaaagat taattttaca gaaaatagaa aaagaaatat gtttctgtct 1920
ggaggaatga tttattgttg acccctaaat tgaaatattt tactagtggc ttaatggaaa 1980
gatgatgaaa gatgatgaaa ttaatgtaga agcttaacta gaaaatcagg tgacctgata 2040
tctacatctg tatccttcat tggccaccca gcattcatta atgaatcaga tgatggaata 2100
gatcaagttt cctaggaaca cagtgaatat taaaagaaaa caaagggagc ctagcaccta 2160
gaagacctag tttatatttc aaagtatatt tggatgtaac ccaattttaa acatttcctc 2220
acttgtctct cttaaagcct tgccaacagc aaggacagag aaccaaaaat agtgtatata 2280
tgaataaatg cttattacag aatctgctga ctggcacatg ctttgtgtgt aatgggttct 2340
cataaacact tgttgaatga acacacataa gtgaaagagc atggctaggc ttcatccctt 2400
ggtcaaatat ggggtgctaa agaaaagcag gggaaataca ttgggacact aacaaaaaaa 2460
aacagttaat ttaggtaaaa gataaaatac accacagaat gaagaaaaga gatgacccag 2520
actgctcttt aaccttcatg tcctagagag gtttttgata tgaattgcat tcagaattgt 2580
ggaaaggagc ccatcttttc tcttcatttt gattttatta actccaatgg gggaatttta 2640
ttcgtgtttt ggccatatct acttttgatt tctacattat tctctcttcc tttctacctg 2700
tatttgtcct aataaattgt tgacttatta attcactact tcctcacagc ttttttttgg 2760
ctttacaaat ccactggaaa ggtatatggg tgtatcactt tgtgtatttc ggtgtgcatg 2820
tgtagagggg acaaaaatcc tctctcaaac tataaatatt gagtatttgt gtattgaaca 2880
tttgctataa ctactaggtt tcttaaataa tcttaatata taaaatgata tagaaaaagg 2940
gaaattatag ttcgtattat tcatctaagt gaagagatta aaacccaggg agtaaataaa 3000
ttgtctaagg actaaggttg tatactattt aggtgataga tatggggcaa ccgtatgggt 3060
tttatgatta acaaataaac ttctcaccac tctaccatat caacttttcc ataaaagaga 3120
gctatagtat tctttgctta aataaatttg attagtgcat gacttcttga aaacatataa 3180
agcaaaagtc acatttgatt ctatcagaaa agtgagtaag ccatggccca aacaaaagat 3240
gcattaaaat attctggaat gatggagcta aaagtaagaa aaatgacttt ttaaaaaagt 3300
ttactgttag gaattgtgaa attatgctga attttagttg cattataatt tttgtcagtc 3360
atacggtctg acaacctgtc ttatttctat ttccccatat gaggaatgct agttaagtat 3420
ggatattaac tattactact tagatgcatt gaagttgcat aatatggata atacttcact 3480
ggttccctga aaatgtttag ttagtaataa gtctcttaca ctatttgttt tgtccaataa 3540
tttatatttt ctgaagactt aactctagaa tacactcatg tcaaaatgaa agaatttcat 3600
tgcaaaatat tgcttggtac atgacgcata cctgtatttg ttttgtgtca caacatgaaa 3660
aatgatggtt tattagaagt ttcattgggt aggaaacaca tttgaatggt atttactaag 3720
atactaaaat ccttggactt cactctaatt ttagtgccat ttagaactca aggtctcagt 3780
aaaagtagaa ataaagcctg ttaacaaaac acaaactgaa tattaaaaat gtaactggat 3840
tttcaaagaa atgtttactg gtattacctg tagatgtata ttctttatta tgatcttttg 3900
tgtaaagtct ggcagacaaa tgcaatatct aattgttgag tccaatatca caagcagtac 3960
aaaagtataa aaaagacttg gccttttcta atgtgttaaa atactttatg ctggtaataa 4020
cactaagagt agggcactag aaattttaag tgaagataat gtgttgcagt tactgcactc 4080
aatggcttac tattataaac caaaactggg atcactaagc tccagtcagt caaaatgatc 4140
aaaattattg aagagaataa gcaattctgt tctttattag gacacagtag atacagacta 4200
caaagtggag tgtgcttaat aagaggtagc atttgttaag tgtcaattac tctattatcc 4260
cttggagctt ctcaaaataa ccatataagg tgtaagatgt taaaggttat ggttacactc 4320
agtgcacagg taagctaata ggctgagaga agctaaatta cttactgggg tctcacagta 4380
agaaagtgag ctgaagtttc agcccagatt taactggatt ctgggctctt tattcatgtt 4440
acttcatgaa tctgtttctc aattgtgcag aaaaaagggg gctatttata agaaaagcaa 4500
taaacaaaca agtaatgatc tcaaataagt aatgcaagaa atagtgagat ttcaaaatca 4560
gtggcagcga tttctcagtt ctgtcctaag tggccttgct caatcacctg ctatctttta 4620
gtggagcttt gaaattatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg tttgactcag 4680
caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag ctaaatggat 4740
gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta aggtaaaata 4800
tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac ccactaatta 4860
gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt atcattttaa 4920
aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaaga 4956
<210> 7
<211> 7113
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 7
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220
agatgtttat ggccgagagg atccagtata ttaataaaat ccctttttgt attcaatgag 2280
ggaaacacat aattttcatc aattagcagc ttattggaat atctgcatga tggtttaaca 2340
cttttaagtg ttgactaaag attaatttta cagaaaatag aaaaagaaat atgtttctgt 2400
ctggaggaat gatttattgt tgacccctaa attgaaatat tttactagtg gcttaatgga 2460
aagatgatga aagatgatga aattaatgta gaagcttaac tagaaaatca ggtgacctga 2520
tatctacatc tgtatccttc attggccacc cagcattcat taatgaatca gatgatggaa 2580
tagatcaagt ttcctaggaa cacagtgaat attaaaagaa aacaaaggga gcctagcacc 2640
tagaagacct agtttatatt tcaaagtata tttggatgta acccaatttt aaacatttcc 2700
tcacttgtct ctcttaaagc cttgccaaca gcaaggacag agaaccaaaa atagtgtata 2760
tatgaataaa tgcttattac agaatctgct gactggcaca tgctttgtgt gtaatgggtt 2820
ctcataaaca cttgttgaat gaacacacat aagtgaaaga gcatggctag gcttcatccc 2880
ttggtcaaat atggggtgct aaagaaaagc aggggaaata cattgggaca ctaacaaaaa 2940
aaaacagtta atttaggtaa aagataaaat acaccacaga atgaagaaaa gagatgaccc 3000
agactgctct ttaaccttca tgtcctagag aggtttttga tatgaattgc attcagaatt 3060
gtggaaagga gcccatcttt tctcttcatt ttgattttat taactccaat gggggaattt 3120
tattcgtgtt ttggccatat ctacttttga tttctacatt attctctctt cctttctacc 3180
tgtatttgtc ctaataaatt gttgacttat taattcacta cttcctcaca gctttttttt 3240
ggctttacaa atccactgga aaggtatatg ggtgtatcac tttgtgtatt tcggtgtgca 3300
tgtgtagagg ggacaaaaat cctctctcaa actataaata ttgagtattt gtgtattgaa 3360
catttgctat aactactagg tttcttaaat aatcttaata tataaaatga tatagaaaaa 3420
gggaaattat agttcgtatt attcatctaa gtgaagagat taaaacccag ggagtaaata 3480
aattgtctaa ggactaaggt tgtatactat ttaggtgata gatatggggc aaccgtatgg 3540
gttttatgat taacaaataa acttctcacc actctaccat atcaactttt ccataaaaga 3600
gagctatagt attctttgct taaataaatt tgattagtgc atgacttctt gaaaacatat 3660
aaagcaaaag tcacatttga ttctatcaga aaagtgagta agccatggcc caaacaaaag 3720
atgcattaaa atattctgga atgatggagc taaaagtaag aaaaatgact ttttaaaaaa 3780
gtttactgtt aggaattgtg aaattatgct gaattttagt tgcattataa tttttgtcag 3840
tcatacggtc tgacaacctg tcttatttct atttccccat atgaggaatg ctagttaagt 3900
atggatatta actattacta cttagatgca ttgaagttgc ataatatgga taatacttca 3960
ctggttccct gaaaatgttt agttagtaat aagtctctta cactatttgt tttgtccaat 4020
aatttatatt ttctgaagac ttaactctag aatacactca tgtcaaaatg aaagaatttc 4080
attgcaaaat attgcttggt acatgacgca tacctgtatt tgttttgtgt cacaacatga 4140
aaaatgatgg tttattagaa gtttcattgg gtaggaaaca catttgaatg gtatttacta 4200
agatactaaa atccttggac ttcactctaa ttttagtgcc atttagaact caaggtctca 4260
gtaaaagtag aaataaagcc tgttaacaaa acacaaactg aatattaaaa atgtaactgg 4320
attttcaaag aaatgtttac tggtattacc tgtagatgta tattctttat tatgatcttt 4380
tgtgtaaagt ctggcagaca aatgcaatat ctaattgttg agtccaatat cacaagcagt 4440
acaaaagtat aaaaaagact tggccttttc taatgtgtta aaatacttta tgctggtaat 4500
aacactaaga gtagggcact agaaatttta agtgaagata atgtgttgca gttactgcac 4560
tcaatggctt actattataa accaaaactg ggatcactaa gctccagtca gtcaaaatga 4620
tcaaaattat tgaagagaat aagcaattct gttctttatt aggacacagt agatacagac 4680
tacaaagtgg agtgtgctta ataagaggta gcatttgtta agtgtcaatt actctattat 4740
cccttggagc ttctcaaaat aaccatataa ggtgtaagat gttaaaggtt atggttacac 4800
tcagtgcaca ggtaagctaa taggctgaga gaagctaaat tacttactgg ggtctcacag 4860
taagaaagtg agctgaagtt tcagcccaga tttaactgga ttctgggctc tttattcatg 4920
ttacttcatg aatctgtttc tcaattgtgc agaaaaaagg gggctattta taagaaaagc 4980
aataaacaaa caagtaatga tctcaaataa gtaatgcaag aaatagtgag atttcaaaat 5040
cagtggcagc gatttctcag ttctgtccta agtggccttg ctcaatcacc tgctatcttt 5100
tagtggagct ttgaaattat gtttcagaca acttcgattc agttctagaa tgtttgactc 5160
agcaaattca caggctcatc tttctaactt gatggtgaat atggaaattc agctaaatgg 5220
atgttaataa aattcaaacg ttttaaggac agatggaaat gacagaattt taaggtaaaa 5280
tatatgaagg aatataagat aaaggatttt tctaccttca gcaaaaacat acccactaat 5340
tagtaaaatt aataggcgaa aaaaagttgc atgctcttat actgtaatga ttatcatttt 5400
aaaactagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc tacaggaaaa ctactgtcga 5460
aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac 5520
gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca tgacctgcaa tggggagagt 5580
tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt gtcagcgctg ggatcatcag 5640
acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg acaagggctt tgatgataat 5700
tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct atactcttga ccctcacacc 5760
cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata ctatgaatga cactgatgtt 5820
cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag gctacagggg cactgtcaat 5880
accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc agtatcctca cgagcatgac 5940
atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa attactgccg aaatccagat 6000
gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca tccgagttgg ctactgctcc 6060
caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt atcgtgggaa tggcaaaaat 6120
tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat gttcaatgtg ggacaagaac 6180
atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg caagtaagct gaatgagaat 6240
tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt gctacacggg aaatccactc 6300
attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg ataccacacc tacaatagtc 6360
aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac aattgcgagt tgtaaatggg 6420
attccaacac gaacaaacat aggatggatg gttagtttga gatacagaaa taaacatatc 6480
tgcggaggat cattgataaa ggagagttgg gttcttactg cacgacagtg tttcccttct 6540
cgagacttga aagattatga agcttggctt ggaattcatg atgtccacgg aagaggagat 6600
gagaaatgca aacaggttct caatgtttcc cagctggtat atggccctga aggatcagat 6660
ctggttttaa tgaagcttgc caggcctgct gtcctggatg attttgttag tacgattgat 6720
ttacctaatt atggatgcac aattcctgaa aagaccagtt gcagtgttta tggctggggc 6780
tacactggat tgatcaacta tgatggccta ttacgagtgg cacatctcta tataatggga 6840
aatgagaaat gcagccagca tcatcgaggg aaggtgactc tgaatgagtc tgaaatatgt 6900
gctggggctg aaaagattgg atcaggacca tgtgaggggg attatggtgg cccacttgtt 6960
tgtgagcaac ataaaatgag aatggttctt ggtgtcattg ttcctggtcg tggatgtgcc 7020
attccaaatc gtcctggtat ttttgtccga gtagcatatt atgcaaaatg gatacacaaa 7080
attattttaa catataaggt accacagtca tag 7113
<210> 8
<211> 6190
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 8
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220
agatgtttat ggccgagagg atctcttcct ttctacctgt atttgtccta ataaattgtt 2280
gacttattaa ttcactactt cctcacagct tttttttggc tttacaaatc cactggaaag 2340
gtatatgggt gtatcacttt gtgtatttcg gtgtgcatgt gtagagggga caaaaatcct 2400
ctctcaaact ataaatattg agtatttgtg tattgaacat ttgctataac tactaggttt 2460
cttaaataat cttaatatat aaaatgatat agaaaaaggg aaattatagt tcgtattatt 2520
catctaagtg aagagattaa aacccaggga gtaaataaat tgtctaagga ctaaggttgt 2580
atactattta ggtgatagat atggggcaac cgtatgggtt ttatgattaa caaataaact 2640
tctcaccact ctaccatatc aacttttcca taaaagagag ctatagtatt ctttgcttaa 2700
ataaatttga ttagtgcatg acttcttgaa aacatataaa gcaaaagtca catttgattc 2760
tatcagaaaa gtgagtaagc catggcccaa acaaaagatg cattaaaata ttctggaatg 2820
atggagctaa aagtaagaaa aatgactttt taaaaaagtt tactgttagg aattgtgaaa 2880
ttatgctgaa ttttagttgc attataattt ttgtcagtca tacggtctga caacctgtct 2940
tatttctatt tccccatatg aggaatgcta gttaagtatg gatattaact attactactt 3000
agatgcattg aagttgcata atatggataa tacttcactg gttccctgaa aatgtttagt 3060
tagtaataag tctcttacac tatttgtttt gtccaataat ttatattttc tgaagactta 3120
actctagaat acactcatgt caaaatgaaa gaatttcatt gcaaaatatt gcttggtaca 3180
tgacgcatac ctgtatttgt tttgtgtcac aacatgaaaa atgatggttt attagaagtt 3240
tcattgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga tactaaaatc cttggacttc 3300
actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta aaagtagaaa taaagcctgt 3360
taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt ttcaaagaaa tgtttactgg 3420
tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt gtaaagtctg gcagacaaat 3480
gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca aaagtataaa aaagacttgg 3540
ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac actaagagta gggcactaga 3600
aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca atggcttact attataaacc 3660
aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca aaattattga agagaataag 3720
caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac aaagtggagt gtgcttaata 3780
agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc ttggagcttc tcaaaataac 3840
catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca gtgcacaggt aagctaatag 3900
gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa gaaagtgagc tgaagtttca 3960
gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta cttcatgaat ctgtttctca 4020
attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat aaacaaacaa gtaatgatct 4080
caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag tggcagcgat ttctcagttc 4140
tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag tggagctttg aaattatgtt 4200
tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc aaattcacag gctcatcttt 4260
ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg ttaataaaat tcaaacgttt 4320
taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat atgaaggaat ataagataaa 4380
ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag taaaattaat aggcgaaaaa 4440
aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa actagctttt tgccttcgag 4500
ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat cctcgagggg aagaaggggg 4560
accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa gtctgtgaca ttcctcagtg 4620
ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat cgaggtctca tggatcatac 4680
agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca ccacaccggc acaaattctt 4740
gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat tgccgcaatc ccgatggcca 4800
gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc tgggagtact gtgcaattaa 4860
aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct ttggaaacaa ctgaatgcat 4920
ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc atttggaatg gaattccatg 4980
tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg actcctgaaa atttcaagtg 5040
caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg tctgaatcac cctggtgttt 5100
taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa attccaaact gtgatatgtc 5160
acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat atgggcaact tatcccaaac 5220
aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg gaagacttac atcgtcatat 5280
cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac tgccgaaatc cagatgatga 5340
tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt ccttgggatt attgccctat 5400
ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat ttagaccatc ccgtaatatc 5460
ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt ccaacacgaa caaacatagg 5520
atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc ggaggatcat tgataaagga 5580
gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga gacttgaaag attatgaagc 5640
ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag aaatgcaaac aggttctcaa 5700
tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg gttttaatga agcttgccag 5760
gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta cctaattatg gatgcacaat 5820
tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac actggattga tcaactatga 5880
tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat gagaaatgca gccagcatca 5940
tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct ggggctgaaa agattggatc 6000
aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt gagcaacata aaatgagaat 6060
ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt ccaaatcgtc ctggtatttt 6120
tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt attttaacat ataaggtacc 6180
acagtcatag 6190
<210> 9
<211> 5190
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 9
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220
agatgtttat ggccgagagg atcctgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga 2280
tactaaaatc cttggacttc actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta 2340
aaagtagaaa taaagcctgt taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt 2400
ttcaaagaaa tgtttactgg tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt 2460
gtaaagtctg gcagacaaat gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca 2520
aaagtataaa aaagacttgg ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac 2580
actaagagta gggcactaga aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca 2640
atggcttact attataaacc aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca 2700
aaattattga agagaataag caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac 2760
aaagtggagt gtgcttaata agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc 2820
ttggagcttc tcaaaataac catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca 2880
gtgcacaggt aagctaatag gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa 2940
gaaagtgagc tgaagtttca gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta 3000
cttcatgaat ctgtttctca attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat 3060
aaacaaacaa gtaatgatct caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag 3120
tggcagcgat ttctcagttc tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag 3180
tggagctttg aaattatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 3240
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 3300
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 3360
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 3420
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 3480
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 3540
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 3600
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 3660
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 3720
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 3780
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 3840
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 3900
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 3960
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 4020
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 4080
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 4140
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 4200
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 4260
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 4320
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 4380
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 4440
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 4500
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 4560
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 4620
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 4680
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 4740
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 4800
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 4860
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 4920
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 4980
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 5040
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 5100
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 5160
attttaacat ataaggtacc acagtcatag 5190
<210> 10
<211> 4241
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 10
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780
agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840
tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900
cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960
cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020
tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080
tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140
atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200
ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260
acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320
gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380
taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440
aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500
gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560
cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620
tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680
ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740
ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800
agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860
tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920
ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980
aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040
aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100
accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160
ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220
agatgtttat ggccgagagg atccttatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg 2280
tttgactcag caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag 2340
ctaaatggat gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta 2400
aggtaaaata tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac 2460
ccactaatta gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt 2520
atcattttaa aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact 2580
actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg 2640
tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg 2700
gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg 2760
atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg 2820
atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc 2880
ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca 2940
ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca 3000
ctgtcaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg 3060
agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa 3120
atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggct 3180
actgctccca aattccaaac tgtgatatgt cacatggaca agattgttat cgtgggaatg 3240
gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg 3300
acaagaacat ggaagactta catcgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga 3360
atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa 3420
atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta 3480
caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg 3540
taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga tacagaaata 3600
aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt 3660
tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa 3720
gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag 3780
gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta 3840
cgattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg 3900
gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca catctctata 3960
taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg 4020
aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc 4080
cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg 4140
gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga 4200
tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata g 4241
<210> 11
<211> 5602
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 11
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccagtatat taataaaatc cctttttgta ttcaatgagg gaaacacata 780
attttcatca attagcagct tattggaata tctgcatgat ggtttaacac ttttaagtgt 840
tgactaaaga ttaattttac agaaaataga aaaagaaata tgtttctgtc tggaggaatg 900
atttattgtt gacccctaaa ttgaaatatt ttactagtgg cttaatggaa agatgatgaa 960
agatgatgaa attaatgtag aagcttaact agaaaatcag gtgacctgat atctacatct 1020
gtatccttca ttggccaccc agcattcatt aatgaatcag atgatggaat agatcaagtt 1080
tcctaggaac acagtgaata ttaaaagaaa acaaagggag cctagcacct agaagaccta 1140
gtttatattt caaagtatat ttggatgtaa cccaatttta aacatttcct cacttgtctc 1200
tcttaaagcc ttgccaacag caaggacaga gaaccaaaaa tagtgtatat atgaataaat 1260
gcttattaca gaatctgctg actggcacat gctttgtgtg taatgggttc tcataaacac 1320
ttgttgaatg aacacacata agtgaaagag catggctagg cttcatccct tggtcaaata 1380
tggggtgcta aagaaaagca ggggaaatac attgggacac taacaaaaaa aaacagttaa 1440
tttaggtaaa agataaaata caccacagaa tgaagaaaag agatgaccca gactgctctt 1500
taaccttcat gtcctagaga ggtttttgat atgaattgca ttcagaattg tggaaaggag 1560
cccatctttt ctcttcattt tgattttatt aactccaatg ggggaatttt attcgtgttt 1620
tggccatatc tacttttgat ttctacatta ttctctcttc ctttctacct gtatttgtcc 1680
taataaattg ttgacttatt aattcactac ttcctcacag cttttttttg gctttacaaa 1740
tccactggaa aggtatatgg gtgtatcact ttgtgtattt cggtgtgcat gtgtagaggg 1800
gacaaaaatc ctctctcaaa ctataaatat tgagtatttg tgtattgaac atttgctata 1860
actactaggt ttcttaaata atcttaatat ataaaatgat atagaaaaag ggaaattata 1920
gttcgtatta ttcatctaag tgaagagatt aaaacccagg gagtaaataa attgtctaag 1980
gactaaggtt gtatactatt taggtgatag atatggggca accgtatggg ttttatgatt 2040
aacaaataaa cttctcacca ctctaccata tcaacttttc cataaaagag agctatagta 2100
ttctttgctt aaataaattt gattagtgca tgacttcttg aaaacatata aagcaaaagt 2160
cacatttgat tctatcagaa aagtgagtaa gccatggccc aaacaaaaga tgcattaaaa 2220
tattctggaa tgatggagct aaaagtaaga aaaatgactt tttaaaaaag tttactgtta 2280
ggaattgtga aattatgctg aattttagtt gcattataat ttttgtcagt catacggtct 2340
gacaacctgt cttatttcta tttccccata tgaggaatgc tagttaagta tggatattaa 2400
ctattactac ttagatgcat tgaagttgca taatatggat aatacttcac tggttccctg 2460
aaaatgttta gttagtaata agtctcttac actatttgtt ttgtccaata atttatattt 2520
tctgaagact taactctaga atacactcat gtcaaaatga aagaatttca ttgcaaaata 2580
ttgcttggta catgacgcat acctgtattt gttttgtgtc acaacatgaa aaatgatggt 2640
ttattagaag tttcattggg taggaaacac atttgaatgg tatttactaa gatactaaaa 2700
tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc aaggtctcag taaaagtaga 2760
aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa tgtaactgga ttttcaaaga 2820
aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt atgatctttt gtgtaaagtc 2880
tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc acaagcagta caaaagtata 2940
aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat gctggtaata acactaagag 3000
tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag ttactgcact caatggctta 3060
ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag tcaaaatgat caaaattatt 3120
gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta gatacagact acaaagtgga 3180
gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta ctctattatc ccttggagct 3240
tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta tggttacact cagtgcacag 3300
gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg gtctcacagt aagaaagtga 3360
gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct ttattcatgt tacttcatga 3420
atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat aagaaaagca ataaacaaac 3480
aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga tttcaaaatc agtggcagcg 3540
atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct gctatctttt agtggagctt 3600
tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat gtttgactca gcaaattcac 3660
aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca gctaaatgga tgttaataaa 3720
attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt aaggtaaaat atatgaagga 3780
atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata cccactaatt agtaaaatta 3840
ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat tatcatttta aaactagctt 3900
tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg 3960
ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga 4020
cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct 4080
catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg 4140
gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa 4200
tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta 4260
ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac 4320
aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa 4380
tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga 4440
aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc 4500
accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa 4560
ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa 4620
cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt 4680
acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa 4740
tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga 4800
ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca 4860
tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg 4920
aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc 4980
attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa 5040
agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa 5100
acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat 5160
gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta 5220
tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt 5280
gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg 5340
cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga 5400
aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca 5460
taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg 5520
tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac 5580
atataaggta ccacagtcat ag 5602
<210> 12
<211> 4679
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 12
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tctcttcctt tctacctgta tttgtcctaa taaattgttg acttattaat 780
tcactacttc ctcacagctt ttttttggct ttacaaatcc actggaaagg tatatgggtg 840
tatcactttg tgtatttcgg tgtgcatgtg tagaggggac aaaaatcctc tctcaaacta 900
taaatattga gtatttgtgt attgaacatt tgctataact actaggtttc ttaaataatc 960
ttaatatata aaatgatata gaaaaaggga aattatagtt cgtattattc atctaagtga 1020
agagattaaa acccagggag taaataaatt gtctaaggac taaggttgta tactatttag 1080
gtgatagata tggggcaacc gtatgggttt tatgattaac aaataaactt ctcaccactc 1140
taccatatca acttttccat aaaagagagc tatagtattc tttgcttaaa taaatttgat 1200
tagtgcatga cttcttgaaa acatataaag caaaagtcac atttgattct atcagaaaag 1260
tgagtaagcc atggcccaaa caaaagatgc attaaaatat tctggaatga tggagctaaa 1320
agtaagaaaa atgacttttt aaaaaagttt actgttagga attgtgaaat tatgctgaat 1380
tttagttgca ttataatttt tgtcagtcat acggtctgac aacctgtctt atttctattt 1440
ccccatatga ggaatgctag ttaagtatgg atattaacta ttactactta gatgcattga 1500
agttgcataa tatggataat acttcactgg ttccctgaaa atgtttagtt agtaataagt 1560
ctcttacact atttgttttg tccaataatt tatattttct gaagacttaa ctctagaata 1620
cactcatgtc aaaatgaaag aatttcattg caaaatattg cttggtacat gacgcatacc 1680
tgtatttgtt ttgtgtcaca acatgaaaaa tgatggttta ttagaagttt cattgggtag 1740
gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc ttggacttca ctctaatttt 1800
agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat aaagcctgtt aacaaaacac 1860
aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat gtttactggt attacctgta 1920
gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa 1980
ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat 2040
gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg 2100
aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat 2160
cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc 2220
tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat 2280
ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg 2340
taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag 2400
ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta 2460
actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa 2520
aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 2580
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 2640
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 2700
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 2760
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 2820
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 2880
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 2940
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 3000
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 3060
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 3120
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 3180
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 3240
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 3300
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 3360
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 3420
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 3480
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 3540
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 3600
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 3660
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 3720
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 3780
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 3840
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 3900
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 3960
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 4020
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 4080
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 4140
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 4200
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 4260
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 4320
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 4380
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 4440
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 4500
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 4560
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 4620
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 4679
<210> 13
<211> 3679
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 13
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780
ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840
aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900
gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960
cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020
aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080
ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140
ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200
gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260
tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320
caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660
taaggtacca cagtcatag 3679
<210> 14
<211> 2730
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 14
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700
attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730
<210> 15
<211> 3250
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 15
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100
gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160
ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220
ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280
aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340
ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400
tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460
cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520
aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240
tgctcacatg 3250
<210> 16
<211> 4108
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 16
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180
ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600
cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660
attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720
aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840
ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900
cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960
ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020
tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080
tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140
agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200
tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260
cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320
tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380
caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440
cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500
ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560
acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620
agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680
attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740
acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800
ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860
caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920
caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980
gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040
ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100
gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160
tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220
acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460
ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820
aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420
tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108
<210> 17
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 17
agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40
<210> 18
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Sсинтетический праймер
<400> 18
tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40
<210> 19
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 19
ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40
<210> 20
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 20
tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40
<210> 21
<211> 933
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 21
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600
tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660
caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720
tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780
cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840
gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900
gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933
<210> 22
<211> 858
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 22
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420
gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480
tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540
acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct 600
ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg 660
tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc 720
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt 780
tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840
aagaactaca ggatgtag 858
<210> 23
<211> 153
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
145 150
<210> 24
<211> 462
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 24
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420
gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462
<210> 25
<211> 158
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 26
<211> 477
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 26
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477
<210> 27
<211> 137
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
35 40 45
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
65 70 75 80
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
85 90 95
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
100 105 110
Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met
130 135
<210> 28
<211> 414
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 28
atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60
ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120
gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180
acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240
ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300
tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360
catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414
<210> 29
<211> 195
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 30
<211> 588
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 30
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420
aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480
cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540
gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588
<210> 31
<211> 402
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 31
atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60
aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120
accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240
tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300
gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360
gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag 402
<210> 32
<211> 1505
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 32
gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60
tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120
gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180
tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240
atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc 300
cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat 360
aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg 420
cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca 480
cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat 540
aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa 600
acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa 660
aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta 720
tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg 780
aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa 840
agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag 900
ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca 960
tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga 1020
tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg 1080
aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa 1140
ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca 1200
aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag 1260
gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg 1320
gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc 1380
tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag 1440
ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt 1500
tacag 1505
<210> 33
<211> 75
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 33
tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt 60
gaagaacgca agtag 75
<210> 34
<211> 15250
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 34
aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa 60
tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga 120
tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac 180
ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa 240
aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac 300
aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta 360
tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc 420
aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg 480
tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt 540
gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat 600
cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac 660
aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag 720
ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg 780
ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc 840
ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt 900
tggatttggg cccaccccac tgacctcatt ttaacttaat tatctctgta aagactctgt 960
ctccaaatac agtcatattt tgacgtactg ggagttaggg cttcaacaca tgaatttgga 1020
cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt 1080
acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa 1140
accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc 1200
ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt 1260
gcttgggttc taagctgctc ttcttttggc caggagacaa cagcacataa tcaaagtggg 1320
tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga 1380
gcaaaagtgc tggatttccc tgagggtgaa gaaaagttaa atagaatcac agaattcaga 1440
ttttagagat cttctccttc agatcccttg gtttaatcag taggattggg gtcttcatag 1500
ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg 1560
tacaagacgg aagttctcta ccaaacaaat ggtgacattt tggggtaaga atatgactaa 1620
cccagaagtg aagcatttca tccaagtagt ctattttgaa gatgtcatgg tataaaggaa 1680
cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt 1740
ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat 1800
ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg 1860
ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc 1920
ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980
atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040
gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100
tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160
agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220
aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280
ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340
acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400
tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460
ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520
ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580
aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640
cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700
aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760
tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820
atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880
aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940
tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000
agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060
ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120
aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180
agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240
tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300
cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360
agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420
taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480
gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540
ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600
tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660
tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720
ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780
tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840
cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900
ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960
tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020
cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080
tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140
attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200
tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260
tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320
tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380
ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440
atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500
taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560
ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620
taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680
tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740
gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800
ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860
aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920
ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980
gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040
gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100
atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160
agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220
aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280
tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340
gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400
gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460
cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt 5520
tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580
ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640
ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700
cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760
tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat 5820
tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880
gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940
actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000
catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060
actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120
gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180
atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt 6240
acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300
ttctacaaaa ttctgggtac aatgtataaa cattcacttg gggctttctg tctagccagc 6360
accaagaggt caagtaatca aggaccaact agccctgcca tctgtgaaaa tatgtgctat 6420
tttcacggct ttagttcaca attatggcaa gacaaaagtt ccaaataatt aggagcaaga 6480
ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540
tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600
ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660
tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720
aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780
acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca 6840
ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900
cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960
tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020
aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080
gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140
tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200
actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260
ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320
atctttagca catagcagca aaattgctag aatctggtgt ttcacttttt aaaataccac 7380
atttgaacct ttcagcaatt ccaaaatcaa ctccctctgc gaaagataat aagcttaaac 7440
attttttaaa tttaaaaatg taacacaaac aaacagctaa gcaaacaagc tgcccataaa 7500
atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa 7560
aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg 7620
ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680
aaatagagtc aggtggtagt ctttaaaaga gtaagaaagt tgctaagtca agataatctt 7740
ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga 7800
gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg 7860
tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata 7920
gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980
cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg 8040
agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt 8100
cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac 8160
cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata 8220
tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa 8280
taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca 8340
tcattcctgc aggaaattcg catccattaa atgagcattt cctggtttgc cactttgctc 8400
aaacactttg cttggatctg gagaggatat agaagtgaag gaaatatgct acctgctctc 8460
aaggaactta tgttttagtg gagagacaaa catgcagaat ttactctaca gaacatcaat 8520
gcttgagcaa atgtagaccc agagagggct cttacagcac acaagccaga acagactgat 8580
ggtgctaaca attaggttca aggtttttct aaacagtaga ctctcctgca tacaactata 8640
ccgcatgcca ggtaaatgac tgagggttat tacatccaat tataacacca ctgtgatgta 8700
ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag 8760
tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata 8820
agatgaggtc ctccaagaaa cagaagatga gaaggtgtta aatgagcagg ggttttatta 8880
gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg 8940
caagcctaac cccaagggaa ggagagagag agagtagatt ggttggaaac atttttggtg 9000
ggtctatggt ctaaggaaag ttcagcaaag tcatcatgga gtttttgagc caaagttggg 9060
caatacagtt gcccaacaaa tttctgtgtt tctcagaaat aggtctgcct caatgtcccc 9120
accatacttg gtcactggct cttgggaggg gcctgccctg ttccaatcca ctagagccaa 9180
agaagagccg ttgtactggc agggggtggg ggaattccta caaccacata aaaagtgggg 9240
tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat 9300
atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt 9360
gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct 9420
cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt 9480
gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc 9540
atttcacatg tccccaggcc aagccagcaa aattgctata gcacatccct ttcaacaggt 9600
aaagggctga tatctgagcc ctctttccaa tcatccactg ctcttttctt ctcattttgc 9660
cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat 9720
attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac 9780
ttcatgtcat acaatactta acttgtttgg agtgggtgga gatggaaaca tagtctattg 9840
aaaacatcac tgcttcctcc ctgaagttta aagagcctat ttttatcctt ttagattcta 9900
tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct 9960
agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca 10020
aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac 10080
agcctttccc tccaaactag catctacccc catctggaag catgggcagc tcatgatatt 10140
atcaactatt gctattggaa agtgatttgg acttgaaagc actagatatt ttttacctct 10200
tggggaggca gtttagcaga gtggttaact ggtgagctcc agaatcagaa ggaataggtc 10260
caaattccaa ccactattac atctccatca taagaaatta ggcaagttgt ttatcctaag 10320
tttcagattc cttaaagata aaacagtcaa gacagtagta cttatccctg agagaagtat 10380
aggaaacaag aaaatatatg caatttacat acatactaca atccccagca catgacaaat 10440
gttcaagtaa tgggaactgt tattatttta gccctttgtc tatcagtttg ttcctctgtg 10500
acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat 10560
aacaccgcat cacctcatgt ggtgattgta aggattcagt gatattattt tgtaaactgt 10620
aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg 10680
atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc 10740
tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg 10800
gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860
acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct 10920
ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980
acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040
tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100
ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160
tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220
ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280
gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340
aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400
gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460
tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg 11520
cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca 11580
actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag 11640
tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt 11700
gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc 11760
ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820
acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880
agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940
ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000
aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060
gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg 12120
ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa 12180
acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt 12240
taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300
atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360
atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420
gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag 12480
gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct 12540
atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600
tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc 12660
tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag 12720
aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac 12780
gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga 12840
gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat 12900
gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt 12960
gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt 13020
gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080
actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140
tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200
aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260
agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320
ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380
ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440
taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500
ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata 13560
ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc 13620
atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac 13680
atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt 13740
tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt 13800
gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860
acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt 13920
acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980
cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040
atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100
ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160
tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg 14220
tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280
tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc 14340
caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400
ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460
tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520
gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580
tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640
agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct 14700
cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760
gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820
ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880
gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940
tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000
tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060
agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120
ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180
ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240
ttatttatag 15250
<210> 35
<211> 60
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 35
gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60
<210> 36
<211> 270
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
<400> 36
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60
gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120
agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180
gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240
gagtacctgg agaaagcttt aaacaagtaa 270
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению лиофилизированной фармацевтической композиции, и может быть использовано в медицине для лечения нейропатии. Композиция содержит эффективное количество плазмидной ДНК, которая экспрессирует две изоформы человеческого белка HGF, калий-фосфатный буфер, маннит, сахарозу и хлорид натрия. Изобретение позволяет получить лиофилизированную фармацевтическую композицию, которая сохраняет стабильность ДНК-плазмиды во время лиофилизации и фармацевтическую активность для генетической терапии после её повторного растворения в воде. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 55 ил., 44 табл., 4 пр.
1. Лиофилизированная фармацевтическая композиция для лечения нейропатии, содержащая эффективное количество плазмидной ДНК, где данную лиофилизированную фармацевтическую композицию получают лиофилизацией жидкой композиции, которая перед лиофилизацией содержит:
а) ДНК pCK-HGF-X7, где pCK содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 и где HGF-X7 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13;
b) калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 9,0;
с) маннит в концентрации в интервале от 1 до 3 % (масс./об.);
d) сахарозу в концентрации больше чем 0,5 % (масс./об.) и меньше чем 1,1 % (масс./об.) и
e) NaCl в концентрации в интервале от 0,1 до 0,9 % (масс./об.).
2. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой по меньшей мере 90% плазмидной ДНК в жидкой композиции является суперспирализованной.
3. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения данной лиофилизированной фармацевтической композиции.
4. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой по меньшей мере 90% плазмидной ДНК остается суперспирализованной после хранения при 25°С в течение 3-7 суток после растворения данной лиофилизированной фармацевтической композиции.
5. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой по меньшей мере 80% плазмидной ДНК остается суперспирализованной через 30 минут после растворения данной лиофилизированной фармацевтической композиции, где лиофилизированную фармацевтическую композицию хранили при 40°С в течение 10 недель перед растворением.
6. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, где данная лиофилизированная фармацевтическая композиция содержит суперспирализованную ДНК в количестве по меньшей мере 90% от общего количества суперспирализованной ДНК в данной жидкой композиции.
7. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п. 1, где данная жидкая композиция содержит фосфат калия в концентрации в интервале от 5 до 15 мМ;
при этом данная жидкая композиция содержит калий-фосфатный буфер с рН в интервале от 7,0 до 8,0;
при этом данная жидкая композиция содержит маннит в концентрации в интервале от 2 до 3 % (масс./об.);
при этом данная жидкая композиция содержит сахарозу в концентрации в интервале от 0,75 до 1,1 % (масс./об.); или
при этом данная жидкая композиция содержит NaCl в концентрации в интервале от 0,1 до 0,75 % (масс./об.).
8. Растворенная композиция для лечения нейропатии, полученная растворением лиофилизированной фармацевтической композиции по любому из пп. 1-7 в воде.
9. Растворенная композиция по п. 8, в которой светопоглощение данной растворенной композиции при 450 нм составляет меньше чем 0,002.
10. Растворенная композиция по п. 9, в которой светопоглощение измеряется в сутки растворения.
11. Растворенная композиция по п. 9, в которой светопоглощение измеряется после хранения лиофилизированной фармацевтической композиции в течение 10 недель.
| WO 2009125986 A2, 15.12.2009 | |||
| POXON S | |||
| W | |||
| et al., The effect of lyophilization on plasmid DNA activity, Pharmaceutical development and technology, 2000, v | |||
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| БУДЫЛЬСКАЯ Т.В | |||
| и др., Фармацевтическая разработка ГЛФ биофармацевтических препаратов для генной терапии, Разработка и регистрация лекарственных средств, 2016, n | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
