Средство, обладающее противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и SARS-CoV-2 Российский патент 2023 года по МПК A61K35/32 A61P31/12 A61P31/14 

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к применению фармацевтической субстанции Антисептика-стимулятора Дорогова фракции 2 в качестве средства, обладающего противовирусной активностью.

Вирусы являются опасными патогенами, так как они вызывают множество заболеваний. Во всем мире, в том числе и в нашей стране, от вирусных инфекций ежегодно погибают тысячи людей и животных. Из всех вирусных заболеваний наиболее тяжелой патологией отличаются респираторные инфекции, которые причиняют наибольший ущерб здоровью населения и экономике. Экономические потери, вызванные, например, гриппом и другими острыми респираторными вирусными инфекциями, составляют около 77% от ущерба, приходящегося на долю всех инфекционных болезней. Периодически появляющиеся новые пандемические штаммы, к которым отсутствует популяционный иммунитет, превращают грипп в особо опасную инфекцию

В связи с изложенным выше, расширение ассортимента лекарственных средств, обладающих противовирусной активностью, в том числе и в отношении вируса гриппа, является актуальной задачей.

Известен лекарственный препарат Тамифлю ((см., например, Инструкцию по медицинскому применению препарата ТАМИФЛЮ от 04.06.2010, регистрационный номер ЛС-000550, владелец регистрационного удостоверения. Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд., Швейцария).

Тамифлю тормозит рост вируса гриппа in vitro и подавляет репликацию вируса и его патогенность in vivo, уменьшает выделение вирусов гриппа А и В из организма, значительно сокращает период клинических проявлений гриппозной инфекции, уменьшает их тяжесть и снижает частоту развития осложнений гриппа, требующих применение антибиотиков.

Действующее вещество препарата - осельтамивир

Также известен инновационный противовирусный препарат Форвет (см., например, Инструкцию по применению лекарственного препарата Форвет, 10.07.2020).

Форвет - первый в мире препарат растительного происхождения, действующим веществом которого является высокомолекулярный полианионный полисахарид класса гексозных гликозидов.

Данное активное вещество также является основой препарата Панавир, который с 2000 года успешно применяется в лечении людей.

Форвет обладает двумя действиями одновременно: противовирусным и иммуномодулирующим. Нормализует показатели иммунного статуса организма за счет индукции альфа- и гамма- интерферонов и действует на всех стадиях жизнедеятельности чужеродного вируса.

Форвет повышает устойчивость к возбудителям инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, неблагоприятным факторам внешней среды, активизирует обменные процессы и клеточный иммунитет, повышает неспецифическую резистентность организма, легко переносится, прекрасно показал себя при лечении острой инфекции не только на начальной стадии заболевания, но и в период развития болезни.

Разработчик препарата - ООО «Национальная Исследовательская Компания», Россия.

Данный препарат является наиболее близким заявленному.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента отечественных препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, обладающего противовирусной активностью, применяют фармацевтическую субстанцию Антисептика - стимулятора Дорогова фракция 2 - далее субстанция АСД-2Ф (см., например, RU 2494750 0,10.10.2013).

Субстанция АСД-2Ф является продуктом сухой термической возгонки сырья животного происхождения, содержит комплекс биологически активных веществ, в том числе низкомолекулярные органические соединения, включая низшие карбоновые кислоты, их амиды и аммонийные соли, холиновые эфиры карбоновых кислот, холин, первичные и вторичные амины, пептиды, соли аммония углекислого, аммония уксуснокислого и воду.

Субстанция АСД-2Ф обладает широким спектром биологической активности, оказывает антисептическое, противовоспалительное действие, нейротропное и холиномиметическое действие на центральную и вегетативную нервную систему, стимулирует моторную деятельность желудочно-кишечного тракта, секрецию пищеварительных желез, повышает активность пищеварительных ферментов, способствует улучшению процессов пищеварения и усвоения питательных веществ, повышает активность тканевых ферментов, включая транспортную Na⁺ и К⁺-АТФазы, рибонуклеазу, щелочную фосфатазу, участвующих в активном транспорте ионов и питательных веществ через клеточные мембраны, в процессах фосфорилирования, а также синтеза белковых веществ, в результате чего улучшается трофика тканей, повышается уровень обменных процессов и факторов естественной резистентности организма.

Из АСД-2Ф-субстанции на протяжении 20 лет производится лекарственный препарат для ветеринарного применения АСД-2Ф - Антисептик-стимулятор Дорогова фракция 2, предназначенный для применения сельскохозяйственным животным, включая птиц, и собак:

- для лечения и профилактики болезней желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, мочеполовой системы, при поражениях кожных покровов, нарушениях обмена веществ различной этиологии (см., например, SU 1729505 А1, 30.04.1992, RU 2099068 С1, 20.12.1997, RU 2308956 С2, 27.10. 2007);

- для стимуляции деятельности центральной и вегетативной нервной системы, повышения естественной резистентности у ослабленных и переболевших инфекционными и инвазионными болезнями животных и птицы (см., например, RU 2159116 С1, 20.11.2000; Ветеринарные препараты. Справочник. Под ред. А.Д. Третьякова. М. Агромпроиздат, 1988, 319 с.).

Также на основе данной субстанции с 2014 года производится биологически активная добавка «АСД - капли», которая дополнительно содержит фолиевую кислоту и селен.

Биологически активная добавка «АСД - капли» применяется для восстановления адаптационных и антиоксидантных возможностей организма, восстановления после перенесенных заболеваний, для повышения устойчивости к патогенным агентам, физическим и эмоциональным перегрузкам, стрессам (см., например, https://medi.ru/instrukciva/asd-kapli 12223/).

Однако, применение субстанции АСД-2Ф в качестве средства, обладающего противовирусной активностью, в известных источниках информации не описано.

Новые свойства субстанции АСД-2Ф были обнаружены благодаря проведенным экспериментальным исследованиям.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые, однако, не ограничивают объем притязаний заявителя.

Пример 1. Влияние субстанции АСД-2Ф на течение инфекции гриппа у мышей, вызванной штаммом вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1).

В эксперименте использовали белых мышей чистой линии BALB/C.

Перед проведением исследования животные прошли карантин, во время которого осуществляли ежедневный осмотр их внешнего состояния. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальную группу включены не были.

Для кормления животных использовали экструдированные, полнорационные, экологически чистые, сбалансированные по содержанию питательных веществ корма для лабораторных животных, изготовленные без применения консервантов и искусственных красителей на основе высококачественного отечественного сырья.

Животные получали стандартный рацион питания, их содержали в равноценных условиях в клетках.

Были созданы 2 опытные группы и 2 контрольные группы мышей. Животные опытных группа получали субстанцию АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг или 0,1 мл/кг массы тела. Животные первой контрольной группы получали препарат сравнения Тамифлю, а животные второй контрольной группы (группа контроля вируса) не получали никакого лечения. Также была создана интактная группа, животные которой получали плацебо. В качестве плацебо мышам вводили физиологический раствор. Мышей интактной группы содержали в отдельном помещении в тех же условиях, что и опытные группы.

В каждой группе было по 30 мышей.

Накопление вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1) и титрование его инфекционной активности проводили на 10-ти дневных куриных эмбрионах.

Животных инфицировали вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1) в дозе 5,2 lg ЭИД₅₀/мл, интраназально под легким эфирным наркозом в объеме 0,05 мл/мышь или 0,1 мл/кг массы тела.

В течение 14 суток после инфицирования вирусом проводили лечение животных субстанцией АСД-2Ф. Мыши получали субстанцию АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг (1-ая опытная группа) или 0,1 мл/кг массы тела (2-ая опытная группа). Субстанцию АСД-2Ф и физиологический раствор вводили перорально в течение 14 суток после инфицирования вирусом. Через 3, 7 и 14 суток после инфицирования у 10 мышей осуществляли взятие крови для дальнейшего исследования.

Эффективность субстанции АСД-2Ф в отношении вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1) в нелетальной дозе оценивали по показателям изменения массы тела, показателей иммунитета, фагоцитоза, интерферонов альфа, бетта, гамма и интерлейкинов 4, 6, 8, 10, 13 на 3, 7 и 14 сутки от начала терапии.

Статистический анализ проводили с применением ПО Microsoft Excel. Использовали критерий Стьюдента и парный t тест; различия считали достоверными при р≤0,05, высоко достоверными при р<0,001, недостоверными при р>0,05 (см. Reed L, Muench Η.A simple method of estimating 50% endpoints // Amer. J. Hygiene, 1938, v. 27, p. 493-497).

В группе вирусного контроля, начиная с третьих суток, отмечали снижение массы тела животных по сравнению с группой интактных животных, при значимости р≤0,001. Масса тела мышей, получавших субстанцию АСД-2Ф в дозе 0,05 мг/кг, статистически достоверно выше массы тела мышей интактной группы (р≤0,001). Таким образом, сохранение массы тела мышей в группе, получавшей субстанцию в концентрации 0,05 мг/кг при гриппозной инфекции, свидетельствует о лечебном действии фармацевтической субстанции АСД-2Ф.

При лечении субстанцией АСД-2Ф в дозе 0,1 мг/кг, масса тела мышей также достоверно превышала массу тела мышей в группе, зараженной вирусом, с 3-го дня наблюдения (р≤0,05). Однако в этой опытной группе на 7-ые сутки погибли 2 мыши, а на 8-ые - еще 1 мышь.

Количество РНК копий в сыворотках леченых и контрольных мышей определяли методом ОТ-РЦР. Результаты исследования представляли в виде среднего логарифмического значения количества копий вирусной РНК в группах по 10 животных.

Проведенные исследования показали, что субстанция АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг оказывает терапевтическое действие на 3,7 сутки, достоверно снижая количество копий РНК до 2,9⋅10², 3,6⋅10² по сравнению с группой контроля вируса (р≤0,01). К 14 суткам разница с вирусным контролем не достоверна (р>0,05). В концентрации 0,1 мл/кг субстанции АСД-2Ф на 3 сутки вирусная нагрузка была снижена в 2,7 раза, однако к 7 и 14 суткам вирусная нагрузка резко возросла, достоверно отличаясь (р≤0,05) по сравнению с группой контроля. Препарат сравнения Тамифлю статистически достоверно снижал количество копий в сыворотках крови в 1,5 раза на 3 сутки, а к 7 суткам наблюдения - в 3,5 раза. К 14 суткам вирусная нагрузка не отличалась по сравнению с контролем вируса (р>0,05).

Таким образом, субстанция АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг, проявляла наиболее выраженный эффект, статистически достоверно снижая количество РНК копий вируса гриппа в сыворотках мышей. В то время, как концентрация препарата АСД-2Ф 0,1 мл/кг оказалась токсична для организма мышей, повышала вирусную нагрузку и вызвала гибель 10% животных.

При исследовании значения показателей фагоцитоза, а именно процента фагоцитоза и фагоцитарного индекса, выяснилось, что у опытной группы, которую лечили субстанцией АСД-2Ф в концентрации 0,05 мл/кг, данные показатели не имели статистически значимых различий на 3-й сутки в отношении как группы контроля вируса, так и интактной группы. На 7-ые сутки у опытной группы наблюдалось повышение фагоцитарной активности макрофагов, и она составила 77,5±18,1% (р≤0,001) в отношении группы контроля вируса и р≤0,01 в отношении интактной группы), фагоцитарный индекс составил 16,7. На 14 сутки фагоцитарная активность понизилась до 45,2±9,8%, фагоцитарный индекс остался на том же уровне. Статистически значимых различий в отношении обеих групп не наблюдалось.

В случае лечения субстанцией АСД-2Ф в дозе 0,1 мл/кг, на 3 сутки процент фагоцитоза составил 9,8±1,7% (р≤0,001) для группы контроля вируса и интактной, фагоцитарный индекс был равен 25,0. На 7 сутки наблюдалось повышение процента фагоцитоза до 24,2±12,0% (р≤0,01) для интактной группы, фагоцитарный индекс - 16,7. На 14 сутки после заражения мышей процент фагоцитоза составил 16,7±2,1% (р≤0,05) в отношении контроля вируса и (р≤0,001) интактной группы, фагоцитарный индекс значительно увеличился и составлял 33,3.

При исследовании на 3 сутки фагоцитарная активность составляла 28,3±14,6% со статической достоверностью р≤0,05 для группы контроля вируса и р≤0,01 для интактной группы, фагоцитарный индекс составил 16,7. На 7 сутки повышения процента фагоцитоза не наблюдалось, статистическая достоверность в отношении интактной группы - р≤0,001, фагоцитарный индекс не изменился. На 14 сутки фагоцитарная активность увеличилась и составила 32,2±12,7% (р≤0,05 в отношении обеих групп), фагоцитарный индекс повысился - 20,0.

В группе мышей с отсутствием лечения на 3 день процент фагоцитоза составил 49,5±0,2%, фагоцитарный индекс - 16,5. На 7 сутки процент фагоцитоза незначительно повысился и достиг значения 50,0±2,1% при статистической значимости в сравнении с контролем вируса р≤0,001, фагоцитарный индекс повысился до 16,7. На 14 сутки процент фагоцитоза повысился до 52,5±1,8% (статистическая достоверность не наблюдалась). Фагоцитарный индекс составил 25,0.

В патогенезе вируса гриппа немаловажное значение имеют цитокины врожденного иммунитета (IFNα, β, γ, IL-6, IL-8) и адаптивного иммунитета (IL-4, IL-13).

Интерфероны I типа (IFNα, β) проявляют выраженное противовирусное действие, блокируя все этапы репродукции вирусного агента. В процессе лабораторного исследования лечения мышей субстанцией АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг было установлено достоверное увеличение IFNα, β в 2-4 раза. В группе мышей, которых лечили субстанцией АСД-2Ф в дозе 0,1 мл/кг, IFΝβ оставался на уровне вирусного контроля, уровень экспрессии гена IFNα к 14 суткам был выше в 2,7 раза, чем в группе интактых мышей.

Важность IFNγ для иммунной системы отчасти связана с его способностью напрямую подавлять репликацию вирусов. Весь период наблюдения достоверных изменений уровня IFNγ по сравнению с не леченными мышами не отмечено.

IL-4 стимулирует пролиферацию покоящихся Т-лимфоцитов. При лечении субстанцией АСД-2Ф в концентрации 0,05 мл/кг экспрессия гена IL-4 статистически значимо возрастает на 3, 7 сутки, а при применении концентрации 0,1 мл/кг экспрессия гена IL-4 сравнима с группой вирусного контроля. В группе референс препарата Тамифлю относительный процент экспрессии гена IL-4 достоверно возрастал примерно в 15 раз.

IL -6 - провоспалительный цитокин, оказывающий влияние на развитие иммунного ответа на вирус. Относительный процент экспрессии гена IL-6 значительно повышен в группе мышей, которых лечили субстанцией АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг, по сравнению с группой вирусного контроля.

Несколько ниже этот показатель в группе мышей, которых лечили субстанцией АСД-2Ф в концентрации 0,1 мл/кг и в группе мышей, получавших референс препарат Тамифлю, по сравнению с группой вирусного контроля.

IL-8 вызывает миграцию в зону воспаления различных типов клеток. Статистически значимых отличий в уровне IL-8 в исследуемых группах мышей, которых лечили субстанцией АСД-2Ф и препаратом сравнения Тамифлю,, не установлено.

IL-10 является противовоспалительным цитокином, антагонистом практических всех остальных цитокинов, опосредующих развитие воспаления. IL-13 оказывает действие на иммунные клетки, является центральным медиатором физиологических изменений, вызванных воспалением во многих тканях. Влияние субстанции АСД-2Ф на экспрессию гена IL-10 и IL-13 оказалось статистически незначимо.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования по изучению эффективности фармацевтической субстанции АСД-2Ф в отношении гриппозной вирусной инфекции (штамм вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1) у мышей показали, что:

- сохранение массы тела мышей в группе, получавшей препарат в концентрации 0,05 мг/кг при гриппозной инфекции, свидетельствует о лечебном действии фармацевтической субстанции АСД-2Ф;

- фармацевтическая субстанция АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг проявляет наиболее выраженный эффект, статистически достоверно снижая количество РНК копий вируса гриппа в сыворотках мышей. В то время, как АСД-2Ф в концентрации 0,1 мл/кг оказалась токсична для организма мышей, повышая вирусную нагрузку и вызывая гибель 10% животных;

- показатели фагоцитоза у опытной группы, получавшей АСД-2Ф в дозе 0,05 мл/кг, не имели статистически значимых различий на 3 и 14 сутки в отношении, как группы контроля вируса, так и интактной группы; на 7 сутки у опытной группы наблюдалось повышение фагоцитарной активности макрофагов (р≤0,001);

- выявлено резкое повышение уровня экспрессии IFNβ, IL-4, IL-6 в группах мышей, получавших АСД-2Ф в концентрации 0,05 мл/кг и 0,1 мл/кг;

- уровни экспрессии показателей врожденного иммунитета IL-6, IL-8 и адаптивного иммунитета IFNγ, IL-4 не имеют статистически значимых различий в группах, получавших АСД-2Ф и референс - препарат Тамифлю.

На основании полученных данных можно заключить, что субстанция АСД-2Ф оказывает выраженное терапевтическое действие при вирусной гриппозной инфекции у мышей. Наиболее выраженный фармакологический эффект субстанция АСД-2Ф оказывает в дозе 0,05 мл/кг.

Пример 2. Исследование влияния субстанции АСД-2Ф на течение инфекции гриппа у мышей, вызванной вирусом A/Aichi/2/68 (H3N2).

Исследование было проведено на мышах самках чистой линии Balb/C. Возраст мышей - 5-7 недель. Лабораторных животных до начала исследования содержали в течение пяти дней на карантине в клетках групповым методом. Во время этого периода у животных каждый день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра. Оценивали такие параметры, как состояние шерсти, наличие повреждений кожного покрова, а также подвижность. Животных с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы не включали.

Животных распределили по группам случайным отбором по массе тела так, чтобы индивидуальная масса тела входил в диапазон вариации ±10% от среднего значения показателя.

Животных содержали в отдельных помещениях вивария в контролируемых условиях окружающей среды: при температуре 18-24°С и относительной влажности воздуха 50-80%. Фотопериод составлял 12 часов ночь - 12 часов день при искусственном освещении лампами дневного света.

Для кормления животных использовали экструдированные, полнорационные, экологически чистые, сбалансированные по содержанию питательных веществ корма для лабораторных животных, изготовленные без применения консервантов и искусственных красителей на основе высококачественного отечественного сырья

Для адаптации вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) к животным было проведено 5 пассажей через легкие мышей.

Вирус гриппа после адаптации был размножен в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов, после чего жидкость была собрана, осветлена при помощи центрифугирования и расфасована по аликвотам объемом 1 мл. Было проведено предварительное титрование вируса на мышах линии Balb/C для определения 50% мышиной летальной дозы вируса (МЛД₅₀).

Мышей под легким эфирным наркозом интраназально заражали вирусом A/Aichi/2/68 (H3N2) в объеме 50 мкл в дозе 2 МЛД₅₀. Мышей ежедневно взвешивали и фиксировали гибель животных.

Инфицирование вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) привело к развитию у лабораторных мышей патологического процесса. Внешние признаки заболевания проявлялись в ограничении подвижности животных, учащении дыхания, а также в снижении потребления корма и воды. Все перечисленные признаки являются типичными для гриппозной пневмонии.

Субстанцию АСД-2Ф и плацебо вводили животным перорально при помощи зонда для перорального введения два раза в день с интервалом 6 часов в объеме 0,4 мл.

В группе плацебо животным вводили перорально стерильный физиологический раствор.

Препарат контроля Тамифлю применяли для контроля специфичности патологического процесса. Его вводили животным перорально при помощи желудочного зонда в объеме 0,2 мл в дозировке 20 мг/кг/сут, по той же схеме, что и исследуемые препараты.

Все препараты вводили по лечебно-профилактической схеме, а именно за 10 дней до заражения и в течение 10 дней после заражения, и по лечебной схеме, а именно: в течение 10 дней после заражения 2 раза в день с интервалом 6 часов.

Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней после заражения.

На 3-й день после заражения по 6 животных из каждой группы подвергали эвтаназии, вскрывали, изолировали и взвешивали их легкие. Образцы ткани легких гомогенизировали в фосфатно-солевом буферном растворе DPBS Суспензию органов использовали для оценки вирусной нагрузки с помощью титрования на культуре клеток MDCK.

Основным критерием оценки противовирусной активности является статистически значимое отличие выживаемости мышей в группе субстанции АСД 2-Ф по сравнению с группой плацебо.

Второстепенные критерии оценки противовирусной активности:

- статистически значимое отличие в снижении массы тела животных в группе плацебо по сравнению с группой субстанции АСД 2-Ф;

- статистически значимое снижение вирусной нагрузки в легких мышей в группе субстанции АСД 2-Ф по сравнению с группой плацебо.

Критерием адекватности поставленного эксперимента является статистически значимое отличие выживаемости мышей в группе препарата сравнения Тамифлю по сравнению с группой плацебо.

Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа.

Заражение вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) привело к потере массы тела животных из всех опытных групп. Максимальная потеря массы тела в группе плацебо составила 38,4% на 11 сутки после заражения при лечебно-профилактической схеме и на 33,9% в на 9 сутки при лечебной схеме.

Препарат сравнения Тамифлю позволил уменьшить потерю массы тела у мышей на 11 сутки после заражения по сравнению с группой плацебо при лечебно-профилактической схеме до 9,6% и при лечебной схеме на 9 день до 14,9%.

Исследуемый препарат - субстанция АСД-2Ф - при применении позволил уменьшить потерю массы тела у подопытных животных, до 18,5% на 11 день после заражения при лечебно-профилактической схеме применения. При лечебной схеме применения препарат - субстанция АСД-2Ф- уменьшил потерю массы тела до 34,1% на 9 день после заражения.

В ходе анализа выживаемости осуществлялось фиксированное цензурирование: для каждого сочетания «штамм вируса - схема лечения - препарат» выборка из 15 животных наблюдалась в течение 14 сутки после заражения. Выявление отличий между функциями выживания мышей, получавших препараты и плацебо в различных экспериментальных группах проводили с помощью тестов Гехана-Вилкоксона и Кокса-Мантеля.

Статистически значимые отличия функций выживания в положительную сторону обнаружены у препарата Тамифлю при сравнении с группой Плацебо при обеих схемах применения в случае заражения мышей вирусом H3N2. В группе, зараженной вирусом H3N2 и получавшей субстанцию АСД-2Ф по лечебно-профилактической схеме, значение «р» было пограничным (0,056 по сравнению с 0,05), что свидетельствует о наличии выраженной тенденции к протективному действию препарата.

Также в результате проведенных исследований установлены положительные значения индекса защиты в группах, зараженных вирусом H3N2 и получавших субстанцию АСД-2Ф по обеим схемам применения.

Исследование протективной активности субстанции АСД-2Ф на модели летальной гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа А A/Aichi/2/68 (H3N2), у мышей Balb/C при лечебно-профилактической и лечебной схемах введения показало, что в отношении вируса гриппа H3N2 отмечено улучшение динамики снижения массы тела зараженных животных при использовании по лечебно-профилактической схеме, а снижение летальности наблюдалось при обеих схемах применения, но более ярко было выражено для лечебно-профилактической схемы.

Таким образом, на основе полученных данных можно сделать вывод о том, что субстанция АСД-2Ф обладает выраженным протективным эффектом в отношении штамма H3N2 вируса гриппа in vitro/

Пример 3. Изучение цитотоксического действия субстанции АСД- 2Ф на культуру клеток Vero-E6.

В данном исследовании использовали депонированный в Государственной Коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России штамм коронавируса SARS-CoV-2: PMVL-12, номер депонирования EPI_ISL_572398 в базе Gisaid.

В качестве тест-системы использовали самок сирийских золотистых хомячков. Данный вид животных является восприимчивым к инфекции, вызываемой SARS-CoV, со сравнимой репликацией вируса в верхних и нижних дыхательных путях, но не имеет выраженных клинических признаков заболевания, кроме снижения активности. Заражение хомячков SARS-CoV-2 приводит к появлению таких клинических признаков, как взъерошенный мех, учащенное дыхание, потеря массы тела. В легких и носовых раковинах на 2-4 дни после заражения наблюдаются высокие уровни вируса.

Перед проведением исследования животных содержали в течение двух недель на карантине группами в клетках, их состояние оценивали ежедневно путем осмотра. В экспериментальные группы отбирали животных без каких-либо признаков отклонений в состоянии здоровья. Животных взвешивали во время распределения по группам и далее ежедневно после инфицирования

Животные были распределены по группам с использованием в качестве основного критерия массы тела таким образом, чтобы индивидуальное значение массы тела не отклонялось от среднего значения более чем на 10%.

После формирования групп животные всех групп размещались по три особи в автоматизированной системе содержания мелких лабораторных животных.

Животные получали комбинированный корм для лабораторных мышей, крыс, хомяков и питьевую воду. В комнате содержания животных постоянно контролировали температуру и влажность.

Вирус SARS-CoV-2 пассировали и титровали на монослойной культуре Vero-Е6. Инфекционный титр вируса определяли методом конечных разведений путем параллельного титрования на культуре клеток Vero-Е6 с шагом ×10, начиная с разведения вируса 10^-1 и до 10^-7. Результаты оценивали с помощью микроскопирования по цитопатическому действию (далее - ЦПД). За титр вируса принимали последнее разведение, где наблюдалось ЦПД. Количество дозы вируса, вызывающей цитопатическое действие в 50% лунок с зараженной культурой клеток (ТЦИД₅₀) рассчитывали по методу Рида и Менча. Лизат культуральной жидкости разливали по аликвотам и сохраняли до проведения исследования. Полученные результаты исследования показали, что наиболее оптимальными для изучения противовирусного действия тестируемых объектов на модели сирийских хомячков являются дозы вируса SARS-CoV-2: 10⁵ - 10⁶ ТЦИД₅₀. Наиболее высокие титры в легких инфицированных животных определяются на 4-ый день после заражения.

Для выбора инфицирующей дозы животных заражали интраназально дозами вируса от 10° до 10⁶ в объеме 100 мкл - по 50 мкл в каждую ноздрю.

При исследовании противовирусной активности субстанции АСД-2Ф животных инфицировали интраназально дозой вируса 10⁵ ТЦИД₅₀ в объеме 100 мкл - по 50 мкл в каждую ноздрю.

Для приготовления рабочего раствора для внутрижелудочного введения, субстанцию АСД-2Ф предварительно разводили в 100 раз стерильной водой с температурой 35-36°С. Суточная доза рабочего раствора субстанции АСД-2Ф для внутрижелудочного введения составила 5 мл/кг. Терапевтическая доза субстанции АСД-2Ф составила 0,05 мл/кг массы тела. Субстанцию АСД-2Ф вводили внутрижелудочно с помощью зонда. Введение осуществляли по лечебно-профилактической схеме введения - один раз в день в течение 10 дней до инфицирования и 4 дней после инфицирования, и по лечебной схеме введения - один раз в день в течение 4 дней после инфицирования.

Наблюдение за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья и смертности проводили ежедневно в первой половине дня.

Наблюдение за животными, получавших субстанцию АСД-2Ф по лечебно-профилактической и лечебной схемах введения, не выявило ни одной гибели животных на протяжении всего исследования.

На 5-й день после инфицирования животных подвергали эвтаназии, легочную ткань от каждого хомячка растирали в ступке с небольшим количеством базовой среды.. Полученную 10% суспензию вносили в лунки планшета с монослоем клеток Vero- Е6 в разведениях от 1×10^-1 до 1×10^-7 и инкубировали при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 96 ч. Оценку вирусной продукции по ЦПД осуществляли на основе анализа жизнеспособности клеток при помощи микроскопирования, с целью визуального определения границы вирусного повреждения клеток. Вычисление титра вируса проводили по методу Рида и Менча. Титром вируса считали последнее разведение, в котором наблюдается ЦПД.

Результат исследования противовирусной активности оценивали по Δlgmax - максимальному снижению значения заражающей вирусной дозы в опыте по сравнению с контролем, выраженному в десятичных логарифмах. Минимально эффективной вирусингибирующей концентрацией являлась концентрация, снижающая титр вируса не менее чем на 2,0 lg. Для дальнейшего изучения противовирусного действия субстанции АСД-2Ф на модели сирийских хомячков была выбрана доза вируса SARS-CoV-2 10⁵ ТЦИД₅₀. Определяли титр вируса SARS-CoV-2 в легких инфицированных животных при лечебно-профилактической и лечебной схемам введения АСД-2Ф.

Все полученные результаты были статистически обработаны.

Оценку противовирусной активности субстанции АСД-2Ф в отношении вируса SARS-CoV-2 учитывали по снижению инфекционного титра вируса в опытных группах по сравнению с контрольной. В результате проведенных исследований получены данные, что инфекционный титр вируса в органах (легких) животных при лечебно-профилактическом способе введения на 4 день после интраназального инфицирования сирийских хомячков вирусом SARS-CoV-2 в дозе 10⁵ ТЦИД₅₀ составляет 6,0±0,94, снижение инфекционного титра вируса составляет 0,85 lg.

Инфекционный титр вируса в органах (легких) животных при лечебном способе введения на 4 день после интраназального инфицирования сирийских хомячков вирусом SARS-CoV-2 в дозе 10⁵ ТЦИД₅₀ составляет 6,60±0,81, снижение инфекционного титра вируса составляет 1,01 lg.

Изобретение относится к применению фармацевтической субстанции Антисептика-стимулятора Дорогова фракции 2 (АСД-2Ф) в качестве средства, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и SARS-CoV-2. Технический результат - расширение ассортимента отечественных препаратов, обладающих противовирусной активностью. 3 пр.

Применение фармацевтической субстанции Антисептика-стимулятора Дорогова фракции 2 в качестве средства, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и SARS-CoV-2.