Способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа (варианты) Российский патент 2023 года по МПК G01N33/569 G01N33/535 G01N33/538 G01N33/541 G01N33/547 

Группа изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использована ветеринарными специалистами для диагностики коронавирусного энтерита лошадей.

Ведущую роль в этиологии диарей у молодняка сельскохозяйственных животных играют рота-коронавирусы, вирус диареи - болезни слизистых, в меньшей степени другие инфекционные агенты. Указанные болезни широко распространены как в Российской Федерации, так и за рубежом и наносят животноводческим хозяйствам ощутимый экономический ущерб, складывающийся из потерь от гибели, особенно в раннем возрасте, средств, затрачиваемых на лечение больных и недополучении продукции от переболевших животных. Ежегодно половина потерь молодняка приходится на желудочно-кишечные заболевания в раннем возрасте. В связи с вышеизложенным, проблема диагностики и борьбы с данными инфекциями является актуальной, [журнал Ветеринария 2005, №5, С21]

Уровень техники

Известен способ диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций методом иммуноферментного анализа с использованием диагностического набора. Глобулиновую фракцию из гипериммунных сывороток выделяли высаливанием полунасыщенным раствором сернокислого аммония с последующей ионнообменной хромотографией на ДЭАЕ-целлюлозе. Для приготовления коньюгатов использовали пероксидазу из хрена с показателем чистоты RZ-3.

Коньюгирование антител с ферментом осуществляли по методике Wilson и др. ковалентным связыванием пероксидазы, модифицированной перйодатом натрия, с иммуноглобулинами, выделенными из гипериммунной антиротавирусной сыворотки (коньюгат для обнаружения ротавирусного антигена) или с иммуноглобулинами кроличьей сыворотки быка (коньюгат для выявления антител в сыворотках крови и молозива крупного рогатого скота). [Труды ВИЭВ, 1984 г, №60. С. 63-66]

Также известен способ обнаружения антигена вируса диареи, для чего специфические иммуноглобулины, входящие в диагностический набор, вносят в лунки планшета по 0,1 см³ и сорбируют на их поверхности. Раствор, содержащий исследуемый антиген, вносят в лунки по 0,1 см и инкубируют с сенсибилизированными на поверхности носителя антителами в течение 1,5 ч при 37°С. Несвязавшийся антиген удаляют промыванием. Затем добавляют иммуноферментный коньюгат в объеме 0,1 см³. В положительных случаях коньюгат связывается с фиксированным на сенсибилизированной поверхности антигеном, образуя комплекс антитело-антиген-коньюгат. Избыток коньюгата удаляют промыванием и вносят в лунки субстратный индикаторный раствор, который меняет свою окраску по принципу окислительно-восстановительной реакции, пропорционально количеству коньюгированного с антителами фермента. Количество фермента пропорционально количеству антигена, фиксированного на сенсибилизированной поверхности лунок плашки. [Доклады Россельхозакадемии с/х наук. 1998, вып. №3. С. 25]. При изучении уровня техники нами не было выявлено литературных данных по диагностике коронавирусного энтерита лошадей.

Технической проблемой является необходимость расширение арсенала способов диагностики короновирусного энтерита лошадей

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является расширение арсенала способов диагностики короновирусного энтерита лошадей путем разработки достоверных способов диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа.

Предложенный способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа имеет два варианта:

Вариант №1. Способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа путем обнаружение коронавирусного антигена в пробах фекалий от больных лошадей методом иммуноферментного анализа. Способ включает внесение короновирусного иммуноглобулина по 0,1 см³ в отмытые лунки планшета, инкубацию их в термостате в течение 1,5 часов при 36-37°С, внесение испытуемых проб от лошадей в лунки планшета по 0,1 см, их инкубацию в течение 1,5 часов при температуре 36-37°С далее внесение имуноферментного коньюгата в размере ОД см³, его инкубацию в течение 1,5 часов при температуре 36-37°С, внесение субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода объемом 0,1 см³ и учета реакции по изменившейся окраске реакционного продукта.

Результат реакции учитывают через 30-40 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

Вариант №2. Способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа путем серологической диагностика коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа. Способ включает внесение короновирусного антигена по 0,1 см³ в отмытые лунки планшета, инкубацию их в термостате в течение 1,5 часов при 36-37°С, внесение испытуемых проб сывороток крови лошадей в лунки планшета по 0,1 см³, их инкубацию в течение 1,5 часов при температуре 36-37°С, далее внесение в отмытые лунки планшета в объеме 0,1 см³ антивидового имуноферментного коньюгата выделенного методом аффинной хромотографии на колонке с иммуносорбентом бромциан сефароза, его инкубацию в течение 1,5 часов при температуре 36-37°С, внесение субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода объемом 0,1 см³ и учета реакции по изменившейся окраске реакционного продукта.

Результат реакции учитывают через 30 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

Оба способа диагностики могут проводится как раздельно, так и совместно для повышения достоверности полученных результатов обнаружение коронавирусного антигена в пробах от лошадей

Осуществление изобретения иллюстрируется следующим примерами:

Пример №1 Обнаружение коронавирусного антигена в пробах от больных животных.

Для постановки диагноза в лабораторию поступили 5 проб фекалий от жеребят.

Реакцию проводят на планшете, сенсибилизированном коронавирусными иммуноглобулинами. Для этого во все лунки планшета вносят иммуноглобулины по 0,1 см³. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате 1,5 ч при температуре 36-37°С, а затем 18 ч при 4°С. Удаляют раствор иммуноглобулинов и трижды отмывают лунки планшета ТФБР.

На следующем этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 см фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с коронавирусными иммуноглобулинами вносят по 0,1 см испытуемой пробы, пипетируют и по 0,1 см³ переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 см³ коронавирусного антигена и также титруют его как пробу. Таким же образом вносят отрицательный антиген. Планшет инкубируют в термостате 1,5 часа при 36-37°С, затем отмывают его от несвязавшихся антигенов. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 см, иммуноферментный коньюгат, состоящий из антикоронавирусных иммуноглобулинов, меченых пероксидазой хрена. Планшет инкубируют в термостате при 36-37°С 1,5 часа и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором. Затем в лунки вносят по 0,1 см субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты (1.0 см³) и перекиси водорода (5 мг). Результат реакции учитывают через 30-40 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

При исследовании 5-х проб фекалий от жеребят на коронавирусный энтерит методом иммуноферментного анализа установлено следующее. Антиген коронавируса обнаружен в 4-х пробах в титрах от 1:16 до 1:256.

Результаты исследования 5 проб фекалий жеребят на наличие специфического антигена коронавируса методом ИФА представлены в таблице.

Предложенный способ найдет применение при обследовании лошадей в неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям хозяйствах с целью диагностики коронавирусного энтерита.

Пример №2 Серологическая диагностика коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа

Для постановки диагноза в лабораторию поступили 5 проб сывороток крови кобыл и 5 проб сывороток крови жеребят.

При исследование сывороток крови лошадей на наличие антител к коронавирусу методом ИФА используют планшет, сенсибилизированный коронавирусным антигеном. В каждую лунку вносят антиген по 0,1 см³. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате 1,5 ч при температуре 36-37°С, а затем 18 ч при 4°С, и потом отмывают лунки планшета от несвязавшихся антигенов следующим образом. Планшет освобождают от содержимого резким вытряхиванием и трижды отмывают ТФБР, каждый раз полностью заполняя лунки буфером и вытряхивая содержимое.

На втором этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 см³ 0,01М фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с нанесенными антигенами коронавируса вносят по 0,1 см³ исследуемой сыворотки, пипетируют и по 0,1 см³ переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 см³ специфическую гомологичную сыворотку и также титруют ее как пробу. Таким же образом вносят и титруют отрицательную сыворотку. Планшет инкубируют в термостате 1,5 часа при 36°С, затем отмывают его от несвязавшихся антител. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 см антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из глобулинов сыворотки крови лошади, меченых пероксидазой хрена. Специфические антитела против IgG лошади выделяют методом аффинной хромотографии на колонке с иммуносорбентом (бромциан сефароза). Колонку заполняют иммуносорбентом, промывают 100 см³ 0,1М фосфатного буфера, рН 7.4 с 0,1М NaCl (ФБР) и наносят моноспецифическую сыворотку кролика, содержащую антитела к IgG лошади. Иммуносорбент промывают ФБР до исчезновения белка на выходе из колонки. Сорбированные на колонке с иммуносорбентом специфические антитела к IgG лошади элюируют 0,1М глициновым буфером, рН 2,5, с 0,1М NaCl фракциями по 3,0 см³. Элюированный раствор быстро подщелачивают до нейтральных значений рН.

Количество белка во фракциях определяют спектрофотометрически при λ=280 нм. Фракции, содержащие максимальное количество белка, объединяют, диализуют против ФБР в течение 14-18 часов при 4°С.

Специфичность и титр выделенных специфических антител проверяют реакцией иммунопреципитации. Выделенные специфические антитела используют для получения иммуноферментного конъюгата.

Метод позволяет повысить специфичность; специфические антитела против IgG лошади связываются только с IgG лошади и не связываются с IgG других видов животных. Для стабилизации конъюгата добавляют БСА (1%), глицерин (50%) и хранят в небольших порциях при 4°С. Химическая стабилизация входит в перечень требований, предъявляемых к реагентам ИФА тест-систем для их реализации в странах Таможенного Союза. Планшет инкубируют в термостате при 36°С 1,5 часа и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором с твином-20. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты (1.0 см³) и перекиси водорода (5 мг). Результат реакции учитывают через 30 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

Результаты исследования 5 проб сывороток крови кобыл и 5 проб сывороток крови жеребят на наличие специфических антител к коронавирусу методом ИФА представлены в таблице.

Из данных таблицы следует, что антитела к коронавирусу в сыворотках крови жеребят выявлены в 2-х пробах в титрах от 1:100 до 1:200, в сыворотках кобыл также в 2-х пробах в титрах от 1:200 до 1:400. Предложенный способ для серологической диагностики коронавирусного энтерита лошадей не имеет отечественных аналогов.

Данную тест-систему можно использовать при оценке иммунного статуса поголовья, для контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин.

Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки и возможность автоматизации процессов исследования методом иммуноферментного анализа позволяют в короткие сроки проводить массовые обследования животных с целью определения распространения этих инфекций. Ускоренная постановка диагноза позволяет приступить к своевременному лечению и проведению профилактических мероприятий и, тем самым, оздоровить и сохранить поголовье скота.

Разработанный способ может решить проблему диагностики коронавирусного энтерита лошадей с большой эффективностью.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарной вирусологии, и может быть использована для диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа. Вносят коронавирусный иммуноглобулин по 0,1 см³ в лунки планшета. Инкубируют их в термостате в течение 1,5 ч при 36-37°C, а затем 18 ч при 4°С. Вносят испытуемые пробы фекалий лошадей в отмытые лунки планшета по 0,1 см³, инкубируют их в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C. Далее осуществляют внесение иммуноферментного конъюгата в размере 0,1 см³, его инкубацию в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C, внесение субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода объемом 0,1 см³. При регистрации коричневого окрашивания продукта диагностируют коронавирусный энтерит у лошадей. При анализе проб сывороток крови лошадей иммуноферментный конъюгат выделяют методом аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом бромциан сефароза. Способ обеспечивает возможность диагностики коронавирусного энтерита лошадей за счет разработки достоверных способов диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа, включающий внесение коронавирусного иммуноглобулина по 0,1 см³ в лунки планшета, инкубацию их в термостате в течение 1,5 ч при 36-37°C, а затем 18 ч при 4°С, внесение испытуемых проб фекалий лошадей в отмытые лунки планшета по 0,1 см³, их инкубацию в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C, далее внесение иммуноферментного конъюгата в размере 0,1 см³, его инкубацию в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C, внесение субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода объемом 0,1 см³, и при регистрации коричневого окрашивания продукта диагностируют коронавирусный энтерит у лошадей.

2. Способ диагностики коронавирусного энтерита лошадей методом иммуноферментного анализа, включающий внесение коронавирусного антигена по 0,1 см³ в лунки планшета, инкубацию их в термостате в течение 1,5 ч при 36-37°C, а затем 18 ч при 4°С, внесение испытуемых проб сывороток крови лошадей в отмытые лунки планшета по 0,1 см³, их инкубацию в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C, далее внесение в отмытые лунки планшета в объеме 0,1 см³ антивидового иммуноферментного конъюгата, выделенного методом аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом бромциан сефароза, его инкубацию в течение 1,5 ч при температуре 36-37°C, внесение субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода объемом 0,1 см³, и при регистрации коричневого окрашивания продукта диагностируют коронавирусный энтерит у лошадей.