Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 G01N33/569 G01N33/543 A61K39/118 

Изобретение относится к ветеринарии, биотехнологии и микробиологии, в частности - к способам получения иммуносорбентов, и может найти применение в создании средств диагностики хламидийной инфекции.

Разработка специфичных и недорогих средств диагностики хламидиоза животных является перспективным направлением научных изысканий.

Согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции животных», утвержденным заместителем руководителя Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ от 30 июня 1999 г. диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет: хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.

На данный момент имеются разработанные диагностические тест-системы направленные на выявление генетического материала хламидий методом ПНР и выявления антигенов хламидий методом иммунной флюоресценции (Патент RU 2 042 360, МПК A61K 39/118, G01N 33/53, 06.07.1992) в патологических материалах. Однако для постановки этих реакций, лаборатории должны быть оснащены специализированными помещениями, оборудованием и обученными специалистами.

Недорогими по себестоимости и технологичными методами, широко внедренными в ветеринарную практику, позволяющими диагностировать хламидиоз у животных, является выявление антигенов хламидий в патологическом материале методами ИФА и ИХА для постановки которых необходимы очищенные специфические хламидийные иммуноглобулины.

Современные распространенные и коммерциализированные методы выделения высокоочищенных иммуноглобулинов являются дорогостоящими и требуют специализированного современного профессионального лабораторного оборудования в оснащении лабораторий. Однако известны доказанные научные концепции применяющиеся как для очистки сывороток крови от неспецифических компонентов, так и выделения иммуноглобулинов специфичных к различным инфекциям посредством их адсорбции на различных иммуносорбентах, производство и применение которых не требует дорогостоящих оборудования и химических реактивов.

Базовым требованиям к иммуносорбентам относят их стабильность, прочность, инертность к неспецифическим биопрепаратам, сорбционная емкость при иммобилизации лигандов. Наиболее стабильное и прочное присоединение лигандов обеспечивается актривацией поверхности носителя сорбента линкером (Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов. / В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь [и др.] // ЖМЭИ, N 12, 1989, с. 100-104).

Известен способ получения иммуносорбента в качестве носителя которого выступает целлюлоза ковалентно связанная с белковым лигандом. Недостатком данного иммуносорбента является органический носитель, который непрочен и подвержен деструкции при воздействии разных микроорганизмов, что в свою очередь негативно влияет на условия и срок его хранения (Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. / К.Л. Шаханина [и др.] // Ж. Вопросы медицинской химии, N 6, 1976. - С.127-136).

Иммуносорбент, носителем которого является полисахарид целлюлозы с иммобилизированным на его поверхности антигеном, также нестабилен при хранении подвержен воздействию микроорганизмов (Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител. / К.Л. Шаханина [и др.] // Ж. Вопросы медицинской химии, N 6, 1976. - С.127-136).

Известен способ получения иммуносорбента сущность которого заключается в активации аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом с последующим ковалентным связыванием антигена (а.с. СССР N 1517545, МПК G01N 33/53, 15.12.93, Бюл. N 45-46).

Недостатком данного способа получения иммуносорбента является то, что носитель сорбента аминопропилсилохром является дефицитным.

Известен способ получения иммуноглобулина для специфической терапии хламидиоза у плотоядных животных (Патент RU 2259849, МПК A61K 39/395, Опубл.: 10.09.2005 Бюл. №25). Сущность данного способа сводится к концентрации общей белковой фракции сывороток крови иммунизированных животных солями аммония. Недостатком данного способа является низкая специфичность полученных иммуноглобулинов.

Целью изобретения является создание способа получения иммуносорбента, представляющего из себя поликапролактоновые микрочастицы с фиксированным на их поверхности хламидийным антигеном, позволяющие удешевить технологическую цепочку выделения очищенных хламидийных иммуноглобулинов и минимизировать материальные, трудовые и технические затраты на осуществление этого процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Этап 1 - получение микрочастиц поликапролактона.

Для получения 7 см³ твердого осадка полимерных микрочастиц (носитель иммуносорбента) 1 г поликапролактона растворяют в 15 см³ хлороформа.

В получившийся раствор постепенно добавляют 600 см³ технического этилового спирта (ГОСТ 51999-2002), после чего раствор приобретает белый цвет и становится мутным.

Получившийся раствор помещают в холодильную камеру (температура от 4 до 6°С) на 24 часа, по истечению которых на дне флакона выпадает однородный осадок белого цвета (поликапролактоновые микрочастицы). Осадок осаждают центрифугированием при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин, супернатант сливают и измеряют объем осадка.

Осажденные микрочастицы ресуспендируют техническим этиловым спиртом (ГОСТ 51999-2002) и хранят в таком виде в стеклянных флаконах при температуре от 4 до 25°С до изготовления иммуносорбента.

Этап 2 - Фиксация хламидийного антигена на поверхности микрочастиц поликапролактона.

Для получения 1 см³ иммуносорбента берут 1 см³ твердого осадка поликапролактонновых микрочастиц полученных на этапе 1, предварительно двукратно отмытых от технического этилового спирта (ГОСТ 51999-2002) дистиллированной водой (ДВ) путем их осаждения на дне пробирки центрифугированием при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин и последующим ресуспендированием ДВ.

Далее на поверхность полимерных микрочастиц посредством аминолиза присоединяют линкер. Для этого получившуюся при отмывке дисперсную систему вода/поликапролактон центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 1 мин, надосадочную жидкость удаляют, а получившийся осадок микрочастиц резуспензируют 10% раствором 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина в смеси изопропиловый спирт/вода в соотношении 1:1. Полученную дисперсную систему выдерживают при температуре плюс 37°С в течение 30 мин. По истечении этого срока проводят отмывку полимерных частиц с иммобилизированными на их поверхности линкерами от не связавшихся молекул диамина по следующей схеме. 1 раз раствором изопропилового спирта в воде в соотношении 1:1 и два раза дистиллированной водой.

Далее полученный осадок модифицированного поликапролактона обрабатывали 2% раствором глутарового альдегида в течение 3 ч при температуре плюс 24°С. После отмывки микрочастиц дистиллированной водой от несвязавшихся молекул глутарового альдегида осадок выдерживают в растворе антигена, полученного по методу, описанному в патенте RU 2485972 (МПК A61K 39/00, Опубл.: 27.06.2013 Бюл. №18) «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных», в разведении 1:5 в 0,6 молярном карбонатно-бикарбонатном буфере со значением рН=9,6 в течение одного часа при температуре плюс 24°С и 12 ч при температуре плюс 4°С. Полученный иммуносорбент три раза отмывают 0,01 молярным фосфатно-буферным раствором (ФБР-Т) от несвязавшегося хламидийного антигена.

Специфическую емкость (активность) полученного иммуносорбента определяют в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого в две пробирки наливают по 1 см³ гипериммунной положительной сыворотки реагирующих в ИФА в титрах от 1:3200 до 1:6400. В первую пробирку вносят 0,1 см³ твердого осадка иммуносорбента (0,2 см³ дисперсной системы ФБР-Т:иммуносорбент в соотношении 1:1). Во вторую пробирку (контроль) вносят 0,1 см твердого осадка микрочастиц (не связанных с антигеном) полученных на этапе 1 (0,2 см³ дисперсной системы ФБР-Т:поликапролактоновые микрочастицы в соотношении 1:1). После чего две пробирки помещают в термостат (температура плюс 37°С) на 1 ч. Далее иммуносорбент и микрочастицы поликапролактона по отдельности три раза отмывают ФБР-Т от сыворотки. После отмывки иммуносорбент и микрочастицы осаждают на дне пробирки, удаляют ФБР-Т и вносят по 1 см³ рабочего разведения иммунопероксидазного коньюгата для выявления антивидовых иммуноглобулинов. Пробирки помещают в термостат (с температурой плюс 37°С) на 40 мин. После инкубации иммуносорбент и микрочастицы 3 раза отмывают от коньюгата и удаляют буферный раствор. Далее в пробирки вносят субстрат-индикаторный раствор. После окрашивания раствора в желтый цвет реакцию останавливают 10% раствором серной кислоты. После осаждения иммуносорбента и микрочастиц из надосадочной жидкости двух пробирок берут по 0,15 см³ раствора и вносят в лунки полистеролового планшета. Учет результатов проводят на регистрирующем устройстве. Исследуемую пробу (ИП) считают положительной, если частное показателя оптического преломления (ОП) опытного образца (пробирка с иммуносорбентом) по отношению к ОП контроля равна или больше 1,2.

Хранят иммуносорбент в 0,01 молярном фосфатно-буферном растворе при температуре плюс 4°С или в глицерине, в соотношении глицерин: иммуносорбент - 1:1, при температуре минус 20°С.

Активность иммуносорбента, изученная в ИФА иллюстрируется следующим примером.

В таблице 1 представлены результаты оценки активности полученного иммуносорбента (3 серии опытов).

Реакцию иммуноферментного анализа ставили по вышеописанной методике определения специфической емкости (активности) полученного иммуносорбента. Регистрацию результатов ИФА проводили с помощью микропланшетного фотометра Bio-Rad 680, при длине волны 490 нм. Результат считали положительным если коэффициент специфичности был равен или выше 1,2.

Как видно из таблицы 1, коэффициент специфичности (К. сп.) в трех сериях опытов был выше 1,2 и варьировался в пределах от 6,3 до 7,1. Среднее значение К. сп. составило 6,8. Полученные данные свидетельствуют о высокой активности полученных иммуносорбентов.

Таким образом, разработанный способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона обеспечивает получаемому иммуносорбенту способность фиксировать на своей поверхности специфические хламидийные иммуноглобулины из иммунных сывороток крови животных. Способ отличается простотой и воспроизводимостью.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммуносорбента. Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов предусматривает получение полимерных микрочастиц из гранул поликапролактона путем их растворения в хлороформе с последующей полимеризацией в спирте, прикрепления к ним линкера с последующим его связыванием с хламидийным антигеном посредством глутарового альдегида. Вышеописанный способ позволяет получить иммуносорбент с высокой активностью. 1 табл., 1 пр.

Способ получения иммуносорбента на основе поликапролактона для выделения хламидийных иммуноглобулинов, предусматривающий получение полимерных микрочастиц из гранул поликапролактона путем их растворения в хлороформе с последующей полимеризацией в спирте, прикрепления к ним линкера с последующим его связыванием с хламидийным антигеном посредством глутарового альдегида.