НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/118 G01N33/569 

Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для широкомасштабной диагностики хламидиозов животных.

Известен набор для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), содержащий панели для постановки ИФА, антиген Chlamydia trachomatis, сорбированный на твердый носитель, хламидийную сыворотку, антивидовой коньюгат, субстрат для проведения пероксидазной реакции, буферные растворы, детергент (Твин и др.) и стоп-реагент (HCl) (US 4497899, G 01 N 33/54, опубл. 05.02.85). Однако указанный патент позволяет определять антигены Chlamydia trachomatis в клиническом материале и не позволяет определять антитела.

Целью заявляемого изобретения является набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных путем выявления специфических хламидийных антител в сыворотках крови и другом клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что в состав набора входят: специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из высокоиммуногенного производственного штамма 2-Т ВГНКИ, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс, обладающий группо- и видоспецифичностью, в рабочей концентрации 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийная (положительная) и нормальная (отрицательная) контрольные сыворотки в разведении 1:50-1:150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, Твин-20, -40, -80 или Тритон Х-305, лимонная кислота, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки ИФА.

В состав набора входят следующие биологические и химические компоненты:
1. Специфический хламидийный антиген лиофилизированный из штамма 2-Т 1 ампула (фл. ), объем 1 см³, рабочее разведение 1:40, титр в ИФА не ниже 1: 320.

2. Хламидийная (положительная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см³, рабочее разведение 1:100, титр в ИФА не ниже 1:800.

3. Нормальная (отрицательная) сыворотка лиофилизированная 1 амп. (фл.), объем 1 см³, рабочее разведение 1:100
4. Антивидовой коньюгат лиофилизированный 1 амп. (фл.), объем 1 см³, рабочее разведение 1:40.

5. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, K₂HPO₄ • 3H₂O, 1 фл. - 9,12 г.

6. Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH₂PO₄, 1 фл. - 1,36 г.

7. Натрий хлористый NaCl, 1 фл. - 26,1 г.

8. Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305, 1 фл. - 1,5 см³.

9. Кислота лимонная безводная, 1 фл. - 0,276 г.

10. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, K₂HPO₄ • 3H₂O, 1 фл. - 0,586 г.

11. Ортофенилендиамин (ОФД), 1 фл. - 0,02 г.

12. Гидроперит (перекись водорода), 1 табл. - 0,5 г.

13. Стоп-реагент 2,5 н. раствор HCl.

14. В состав набора также входят четыре 96 луночных полистироловых панелей для постановки реакции ИФА.

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов
Адсорбционный фосфатный буферный раствор предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке панелей: 9,12 г K₂HPO₄ • 3 H₂ O и 1,36 г KH₂PO₄ и 26,1 г NaCl растворяют в 3000 см³ дистиллированной воды. Адсорбционный буфер представляет собой прозрачный раствор с pH 7,2-7,4. Корректируют pH 0,1М раствором KOH или HCl.

Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения контрольных, исследуемых сывороток и антивидового коньюгата, а также для промывки панелей. В 2800 см³ адсорбционного буфера растворяют 1,5 см³ Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305.

Субстратный цитратно-буферный раствор pH (5,0-5,2) готовят растворением 0,96 г лимонной кислоты и 2,28 г K₂HPO₄ • 3 H₂O в мерной колбе и доводят объем до 100 см³ дистиллированной водой.

Раствор субстрата готовят не ранее, чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 0,02 г ортофенилендиамина растворяют в 2 см³ спирта-ректификата, добавляют 48 см³ субстратного буфера и вносят 0,8 см³ раствора перекиси водорода, полученного растворением таблетки гидроперита в 10 см³ дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

Раствор, останавливающий ферментативную реакцию - (2,5 н. раствор HCl), готовят путем растворения 8,7 см³ концентрированной HCl (уд. вес 1,13-1,16) в 50 см³ дистиллированной воды. Раствор можно хранить при температуре 20^oC в течение 1 месяца.

2. Приготовление специфического хламидийного антигена
Известен способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции (Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных. - ТУ 10.19.26-88 утв. ГУВ СССР 22.07.88), включающий культивирование хламидий в куриных эмбрионах, приготовление 20% маточной суспензии, гомогенизацию со стеклянными бусами, инактивацию азидом натрия и 0,1-0,15% формалином, выдерживание при 4^oC в течение 72 часов. Однако известный способ позволяет получить антиген, обладающий низкой активностью и специфичностью для использования его в ИФА для определения антител. Обработка суспензии хламидий 0,1-0,15% концентрации формалина существенно снижает специфическую активность антигена, что уменьшает чувствительность ИФА. В заявляемом наборе хламидийный антиген готовят следующим образом: для этого 4-7-дневные куриные эмбрионы после заражения высокоиммуногенным штаммом 2-Т вскрывают, отделяют желточные мешочки и готовят 10% суспензию на физиологическом растворе, забуференном 0,01М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 и частично гомогенизируют. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц циклично 10-12 раз по 15 секунд. После чего дезинтеграт центрифугируют при 10 тыс. об./мин в течение 25-30 минут. Образовавшийся средний слой (дебрис - нижний и липидный - верхний отбрасывают) переносят в колбу, добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,1% для консервации. Полученный таким способом антиген хламидий является полисахаридно-белковым комплексом следующего состава: 0,20 мг/мл белка, 0,017 мг/% липидов, 0,36 мг/мл сахара. Антиген смешивают со стабилизатором - 1% декстраном T -70 из расчета 1:1, разливают по 1 мл и лиофилизируют. Эффективность обработки ультразвуком в предложенном режиме исследовали шахматным титрованием исходного антигена с хламидийной сывороткой в ИФА (таблица 1).

По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация хламидийного антигена 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера при разведении хламидийной сыворотки 1:50-1:150 в инкубационном буфере.

3. Приготовление контрольных сывороток.

Известен способ получения сухих диагностических сывороток из крови овец (барана) для серологической диагностики в реакции РСК, РДСК (Патент СССР N 1711898, A 61 K 39/02, 39/18, G 01 N 33/531 "Способ получения хламидийного антигена для реакции непрямой флуоресценции", Бюл. N 6 от 15.02.92). Способ заключается в том, что сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 60^oC 25 мин. Затем сыворотку консервируют 2% борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см³ сыворотки, разливают по 1 см³ и лиофилизируют.

Существенным недостатком лиофилизированных сывороток крови овец, полученных данным способом, является их неполная растворимость и образование хлопьев, для удаления которых требуется дополнительное центрифугирование. Указанные недостатки уменьшают объем сыворотки и снижают активность и специфичность хламидийных сывороток. Образование труднорастворимых хлопьев связано с образованием комплекса липидов с сывороточными белками в процессе лиофилизации. Известно, что сыворотки крови многих животных содержат большое количество липопротеидов низкой плотности. В заявляемом наборе хламидийную сыворотку крови от каждого вида животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ) отделяют от сгустка, осветляют, центрифугируют в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют при 60^oC 25 мин и охлаждают до 4-5^oC. Сыворотку наливают в химический стакан и при медленном перемешивании на магнитной мешалке добавляют 1М раствор CaCl₂ и 10% раствор сульфат декстрана - 500 (СД-500) из расчета на 1 см³ сыворотки 0,1 см³ CaCl₂ и 0,02 см³ СД-500. Смесь перемешивают в течение 10 мин, затем центрифугируют 25 мин при 10 тыс. об. /мин. Осадок липидов отбрасывают, а надосадок - сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 г борной кислоты на 100 см³ сыворотки, разливают по 1 см³ и лиофилизируют. Эффективность обработки сывороток крови животных растворами CaCl₂ и СД-500 контролировали по степени растворимости визуально и в реакции ИФА со специфическим хламидийным антигеном. Использование растворов CaCl₂ и СД-500 обеспечивает удаление липидов из нативных сывороток на 85% и обеспечивает полное растворение лиофилизированных сывороток в пределах 2-5 мин без хлопьев. По результатам реакции ИФА оптическая плотность хламидийной сыворотки в разведении 1:100 после обработки была значительно выше, чем до обработки. Отрицательная сыворотка со специфическим антигеном показала отрицательный результат (таблица 2).

Таким образом, положительный эффект от использования предлагаемых контрольных сывороток в заявляемом наборе заключается в полной их растворимости и увеличении специфической активности положительной сыворотки, что отражается на чувствительности ИФА.

4. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки.

У животных (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др.), прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с хламидийным антигеном, производят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см³ от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37^oC, затем делают обводку и для отстаивания сыворотку выдерживают 12-14 час при 4^oC. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в асептических условиях и обрабатывают согласно П.З.

5. Получение антивидового коньюгата
Антивидовые иммуноглобулины анти-IgG (овец, КРС, свиней, лошадей, птиц и др. ), меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с "Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой", утв. ГУВ МСХ СССР 19.12.85 ТУ 46-78-85 и укомплектовывают ими набор.

6. Иллюстрация применения набора.

6.1. Подготовка биологических компонентов набора для иммуноферментной диагностики хламидиозов животных.

Содержимое каждой ампулы или флакона N 1 со специфическим хламидийным антигеном растворяют в 40 см³ адсорбционного буфера, получая рабочую концентрацию антигена 5-15 мкг/мл. Содержимое ампул (фл.) с антивидовым коньюгатом N 4 растворяют в 40 см³ инкубационного буфера. Положительную и отрицательную (ампулы или фл.) N 2 и N 3 сыворотки растворяют в 1 см³ инкубационного буфера, получая разведение 1:100. Растворенные антиген, сыворотки, антивидовой коньюгат можно хранить при температуре (5±1)^oC в течение 3-4 дней.

6.2. Постановка иммуноферментной реакции (ИФА).

Затраты времени на постановку реакции не превышают 4-5 часов.

Сорбция антигена на панели: во все лунки панели вносят по 0,1 см³ раствора антигена в рабочей концентрации, приготовленного по п.6.1, закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±1)^oC 1,5 часа. Панели освобождают от жидкости встряхиванием, промывают три раза по 1 мин промывающим буфером автоматически или вручную и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Титрование сывороток: сыворотки титруют по короткому ряду панели. Во все лунки панели, исключая лунку ряда панели 1A, используемую для контроля субстратной смеси и вывода прибора на "ноль", вносят по 0,1 см³ инкубационного буфера. В лунки ряда N 2 вносят по 0,1 см³ положительной сыворотки, подготовленной согласно п. 6.1. , ряда N 3 - отрицательной сыворотки, подготовленной аналогичным способом, согласно п.6.1. В лунки остальных рядов вносят по 0,1 см³ исследуемых парных проб сывороток, предварительно разведенных 1: 100 в инкубационном буфере в отдельных пробирках или планшетах. Содержимое всех лунок титруют по короткому ряду для каждой сыворотки по 4 лунки, используя при этом сменные наконечники к микропипеткам и получают разведение сывороток с 1:200 до 1:1600. Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см³ содержимого удаляют.

При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления серопозитивных и серонегативных животных сыворотки не титруют, а используют в одном разведении 1:200, но в двух повторностях, используя для каждой сыворотки по 2 лунки плашки. Постановку реакции и подготовку сывороток осуществляют, как описано выше. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±0,5)^oC в термостате 1,5 часа.

Внесение коньюгата: панели промывают три раза по 1 мин, согласно п.6.2, во все лунки вносят по 0,1 см³ рабочего раствора антивидового коньюгата, подготовленного согласно п.6.1, и инкубируют в термостате при (37±0,5)^oC 1 час и снова промывают три раза по 1 мин. согласно п.6.2.

6.3. Проявление реакции: во все лунки панели вносят по 0,1 см³ раствора субстрата и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 мин. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя в каждую лунку 0,05 см³ 2,5 н. раствора соляной кислоты.

7. Учет результатов реакции.

Результат учитывают не позднее 30 мин после проявления реакции визуально или спектрофотометрически.

7.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител лунки с исследуемыми сыворотками имеют оранжево-коричневое окрашивание с разведения сыворотки 1:200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле (2-й ряд панели). Отрицательными считают пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

7.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на ИФА - ридере при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ОП₄₉₂). Положительными считают пробы, ОП₄₉₂ которых, начиная с разведения 1:200, в 2 и более раза превосходят оптическую плотность отрицательного контроля, но при этом не должна быть ниже 0,200 о.е. Сомнительными считают пробы, ОП₄₉₂ которых составляет 0,150-0,199 о.е. Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. свидетельствует об отрицательной реакции.

Предлагаемый набор был испытан при сравнительном титровании исследуемых сывороток методом ИФА, РСК и РДСК.

Установлено, что в 94% случаях положительные результаты были получены в обоих методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательными и в РСК, РДСК. Однако в 6% случаях хламидийная инфекция диагностировалась только при помощи заявляемого набора ИФА.

Изобретение предназначено для биотехнологии и ветеринарии. Набор содержит специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из штамма 2-Т . Антиген представляет собой полисахаридно-белковый комплекс в рабочей концентрации 5-15 мкг/мл адсорбционного буфера. Набор содержит также хламидийную (положительную) и нормальную (отрицательную) контрольные сыворотки в разведении 1: 50-1: 150 в инкубационном буфере и коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой. В состав набора включены калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, твин - 20, или твин - 40, или твин - 80, или тритон Х-305, лимонная кислотa, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Изобретение повышает чувствительность и специфичность иммунологической реакции, сокращает время для проведения диагностики и уменьшает расход антигена и сывороток. 2 табл.

Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза животных, отличающийся тем, что он содержит специфический хламидийный антиген Chlamydia psittaci из штамма 2-Т, представляющий собой полисахаридно-белковый комплекс в рабочей концентрации 5 - 15 мкг/мл адсорбционного буфера, хламидийную (положительную) и нормальную (отрицательную) контрольные сыворотки в разведении 1 : 50 - 1 : 150 в инкубационном буфере, коньюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, твин-20, или твин-40, или твин-80, или тритон Х-305, лимонную кислоту, ортофенилендиамин, перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.