Способ размножения винограда Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 

1

(21)4686654/13 (22) 03.05.89 (46)07.12.91. Бюл.№45

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт винограда и продуктов его переработки Магарач

(72)С.Ю.Дженеев, В.А.Зленко и С.Ж.Губарь (53)581.143.6(088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 1400557, кл. А 01 Н 3/00. 1988.

Методические рекомендации по кло- нальному микроразмножению винограда, - Ялта: ВНИИВ и ПП Магарач. 1986, с. 23 - 24. (54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА

(57)Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к культивированию изолированных растительных тканей, и может быть использовано при производстве вегетативного размножаемого винограда. Целью изобретения является увеличение выхода растений и приживаемости их в нестерильных условиях. Поставленная цель достигается тем, что проводят высадку ме- ристематических верхушек на питательную среду Мурасиге-Скуга. культивируют до получения растений-регенерантов, микро- черенкуют и высаживают микрочеренки для

укоренения и доращивания, после чего их хранят и пересаживают в нестерильные условия, при этом доращивание осуществляют при 8-часовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега. Укоренение и доращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, мг аммоний азотно-кислый 318,0; калий азот- но-кислый 950,0; магний серно-кислый семиводный 233,0; калий фосфорно-кислый однозамещенный 250,0; кальций хлористый 331,0; борная кислота 1,6; марганец сернокислый пятиводный 6,0; цинк серно-кислый семиводный 2,2; калий йодистый 0,21 кобальт хлористый шестиводный 0,006; натрий молибденово-кислый двуводный 0,6; медь серно-кислая пятиводная 0,006; железо серно-кислое семиводное 7,0; натрий - ЭДТА 9,3; мезо-инозит 20,0; никотиновая кислота 0,5; гумат натрия 30,0: сахароза 10000 и агар-агар 7500 на 1 л среды. Способ позволяет увеличить приживаемость растений в нестерильных условиях на 31 %.хранить полученные укорененные черенки в течение продолжительного времени, снижает затраты труда на адаптацию растений при пересадке их в грунт. 1 з п.ф- лы, 5 табл.

Ё

Ov

о ел

00

ел

со

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к культивированию изолированных растительных тканей, и может быть использовано при производстве вегетативно размножаемого винограда.

Известен способ выращивания растений in vitro, включающий культивирование изолированной ткани на питательной среде в контролируемых условиях, по которому для повышения приживаемости при пересадке в нестерильные условия культивационный сосуд покрывают полимерным материалом в виде термоусадочной пленки толщиной 20 - 25 мкм.

Недостатками известного способа являются затраты на выращивание растений, а также невысокое качество растений, требующих значительных затрат на их хранение и адаптацию к условиям открытого грунта.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ размножения растений in vitro, включающий культивирование изолированной ткани на питательной среде в контролируемых условиях до образования узлов побегов. Способ предусматривает последовательное выполнение стерилизации, зысадки на жидкую или твердую питательную среду для пролиферации почек и побегов,пересадку на среду укоренения, расчеренковывание на одноглазковые эксплантаты с листьями, высаживание их на среду для укоренения до образования 4 - 10 узлов (листочков) и активно растущей верхушечной почки. Такие растения хранят до высадки весной на адаптацию в теплицу в особых условиях - в культуральной комнате при 10 - 13°С, освещении 1 -2 тыс лк на протяжении 14 ч в сутки, влажности 70 - 80%, а при хранении более трех месяцев культуральные сосуды закрывают фольгой и дополнительно обворачивают парафином или пищевой пленкой. В теплицу растения высаживаются в вегетирующем состоянии с зеленой лозой и листьями. Первые 10-14 сут их притеняют и для увеличения влажности накрывают.

Недостатками способа является низкое качество получаемых растений, требующих в последующем проведения дорогостоящих и трудновыполняемых работ по хранению и адаптации их к условиям открытого грунта для обеспечения приживаемости после по- саженца на постоянное место.

Цель изобретения - увеличение выхода растений и приживаемости их в нестерильных условиях.

П р и м е р 1. Исходным материалом для размножения в культуре in vitro служат интенсивно растущие зеленые побеги, взятые из кустов винограда сорта Подарок Магзра- ча в мае - июне, а также из выведенной из состояния покоя вызревшей лозы в осенне- зимний период. В первом случае со здоровых кустов срезают побеги, которые затем заворачивают во влажную фильтровальную бумагу и доставляют в лабораторию.

В случае, когда исходным материалом служит вызревшая лоза, в декабре нарезают лозу на 2-3-глазковые черенки длиной 8-10 см, которые в течение 2-3 сут вымачивают при комнатной температуре в растворе /3 -индолилуксусной кислоты в концентрации 2 мг/л, приготовленном на водопроводной воде. Затем черенки ставят на проращивание в растворе того же состава при температуре воздуха 25 - 30°С. Через 20 - 50 сут, в зависимости от сорта и

степени покоя лозы на черенках появляются зеленые побеги.

Из полученных таким образом, либо доставленных с поля зеленых побегов отчленяют верхушки побегов размером 2 - 3 см и стерилизуют их в ламинарном боксе. За 10-15 мин до начала стерилизации бокс включают с целью выдувания пыли из рабочей зоны, а непосредственно перед началом

0 работы поверхность бокса обрабатывают ватным тампоном, смоченным в 96%-ном этиловом спирте.

Подготовленные верхушки побегов стерилизуют в течение 30 - 40 с в 70%-ном

5 этиловом спирте, а затем 5-8 мин в дио- циде. После этого простерилизованные верхушки помещают в стерильную дистиллированную воду для промывки от стерилизующих веществ. Воду сменяют 4-5 раз на

0 протяжении 10 - 15 мин.

Работу по высадке исходных эксплантатов, а также по расчленению и пересадке агрегатов почек растений проводят в ламинарном боксе. С помощью глазных пинце5 та и скальпеля из побегов вычленяют апикальные меристемы с листовыми зачатками размером 0,5 - 0.8 мм и высаживают на мостики из фильтровальной бумаги в жидкой питательной среде MI (табл.1 где

0 приведены питательные среды, рекомендуемые для клонального микроразмножения и вызревания лозы винограда в условиях in vitro) в биологические пробирки 22/200 и культивируют первую неделю при

5 температуре +23 +28°С и освещают 800 - 1000 лк, а затем освещение увеличивают до 2000 - 5000 лк. Пробирки закрывают фольгой и оборачивают пищевой пленкой толщиной 15-20 микрон.

0Через 20 - 30 дней эксплантаты увеличивают в размере до 1 - 2 см. Их повторно пересаживают пинцетом в культуральные стаканы, содержащие слой жидкой среды М2 (табл.1) толщиной 2-3 мм.

5Через 14 дней вырастают побеги длиной 3 - 4 см с 6 - 10 почками. Их извлекают пинцетом из культуральной посуды, кладут в стерильную чашку Петри и с помощью ножниц каждый побег расчленяют на 2 - 3 ч

0 размером 1 - 2 см с 1 - 2 узлами и высаживают каждую отдельно на свежую питательную среду М2.

В течение следующих 14 дней на эксплантатах образовываются многочислен5 ные почки и побеги. Особенно интенсивно происходит пролиферация побегов из нижних узлов. В конце этого пассажа эксплантат представляет собой агрегат почек и побегов площадью 4-6 см2. Его расчленяют на 4 - 6 частей и пересаживают каждую

часть в стаканы на 200 мл, содержащие 10 15мл среды М2. Через 14 дней вырастают эксплантаты площадью 10-16 см2. Их расчленяют на 5 - 7 ч и повторно высаживают на свежую питательную среду того же состава.

Так как пересадки осуществляют два раза в месяц (через каждые 14 дней), каждый раз разделяя эксплантат на 5 - 7 ч (в зависимости от размножаемого сорта), следовательно, коэффициент размножения составляет 20 - 42 эксплантатов в месяц от одного исходного.

Колбы и стаканы с высаженными эксплантатами устанавливают в культуральной комнате и через 8-10 дней после посадки делают отбраковку инфицированных культур. Перед укоренением эксплантаты поме- щают на среду Мз (табл.1) с целью удлинения побегов.

. После размножения достаточного количества побегов их отчленяют от агрегатов и высаживают на среду К для укоренения (табл,1). Из агрегата побегов площадью 1016см2 срезают 5-20 побегов. Укоренение побегов и развитие из них растений проводят при освещенности 3000 лк на протяжении 14 - 16 ч при 20 - 25°С в темновой и 25 - 30°С в световой периоды. Хорошо укореняются побеги размером 1,5 - 2,0 см с 3 - 6 листочками. Первые корни появляются через 4-14 дней.

Через 2 мес у растений развивается по 8-10 новых узлов. Эти растения черенкуют на одноглазковые эксплантаты с листом, которые снова помещают на питательную среду К для укоренения, причем в биологические пробирки 22/200 (диаметр - 22 мм, длина - 200 мм) наливают по 6 мл среды. После того, как растения достигли высоты 10 глазков (т.е. после 2 мес культивирования на среде К у них образовалось 10 узлов) их продолжают культивировать при 8-часовом освещении интенсивностью 3000 лк при 25°С до вызревания не менее одного глазка побега, причем заканчивают культивирование при наличии в сосуде 0,5 мл питательной среды.

Полученные растения помещают в подвал в условия без освещения, где хранят их при температуре в предела от -1 до +7°С. Растения переходят в состояние зимнего покоя и хранятся до весны.

Весной, в апреле, растения извлекают из пробирок, отмывают их корни от питательной среды и высаживают в количестве 20 - 30 шт. на 1 м на поливные гряды, в субстрат, применяемый для теплиц. Корни и нижние узлы растений присыпают, а верхний вызревший узел оставляют на

уровне почвы. Растения поливают, не допуская подсыхания субстрата. Через 1-2 нед из почек начинают развиваться побеги, а к концу вегетации вырастают стандартные са- женцы, пригодные для посадки на постоянное место в поле.

Для определения оптимальной освещенности растений культивируемые на предлагаемой питательной среде и вегети0 рующие растения винограда hi vitro с семью и более узлами побега освещают в течение 6, 8, 10 или 16 ч в сутки.

Результаты испытания различных режимов фотопериода представлены в табл.2.

5 Из данных табл.2 видно, что вызревание растений винограда in vitro наиболее интенсивно проходит при освещении продолжительностью 8 ч в сутки. При освещении продолжительностью 1 - 5 или 17 - 24 ч

0 вызревание растений in vitro не наблюдается, что отрицательно сказывается на их приживаемости при адаптации.

Для определения оптимальной степени вызревания растений культивирование

5 проводилось после вызревания 1, 3, 5, 6 или 9 узлов побега, процесс культивирования прерывали и растения высаживали на адаптацию Результаты экспериментов представлены в табл.3.

0 Данные, полученные в табл.3, свидетельствуют о повышении приживаемости растений винограда с увеличением степени их вызревания in vitro. Вызревание даже одного узла побега повышает приживае5 мость растений на 9 %, Оптимальным же следует считать вызревание у растений винограда in vitro 7-9 узлов, В этом случае приживаемость составляет 81 %, что на 31 % выше приживаемости растений с зеленой

0 лозой.,

Л $ и м е р 2. Определение состава питательной среды для укоренения побе- , го в

Культивирование виноградных растений

5 in vitro (сорт Подарок Магарача) проводят так же, как в примере 1, но для укоренения эксплантатов используют питательные среды различного состава (табл.4).

Кроме указанных в табл.4 компонентов,

0 в каждую из сред были добавлены 1/4 раствора микроэлементов и 1/4 раствора Fe- хеллата.

Результаты испытания сред представлены в табл.5, где прослеживается развитие

5 растений, вызревание лозы и рост корней у растений винограда сорта Подарок Магарача in vitro в зависимости от состава питательной среды.

Из табл.5 следует, что питательной средой, имеющей оптимальный для вызревания древесины растений состав, является среда 14.

Необходимо отметить, что в отличие от растений in vitro с зеленой лозой, такие растения можно хранить в течение продолжительного времени. Не менее важным их достоинством является и более высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в силу чего становится возможным значительно снизить затраты труда при адаптации, одновременно пол- учая высокий процент приживаемости качественного посадочного материала, оздоровленного от болезней и вирусов.

Формула изобретения 1. Способ размножения винограда in vitro, включающей высадку меристематмче- ских верхушек на питательную среду Мура- сиге-Скуга, культивирование до получения растений-регенерантов, микрочеренкование и посадку микрочеренков для укоренения и доращивания, последующее хранение и пересадку растений в нестерильных условиях, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода растений и приживаемости их в нестерильных условиях, укорененные растения доращивают при восьмичасовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега.

2, Способ по п. 1,отличающийся тем, что укоренение и доращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, мг: аммония азотно-кислого 318; калия азотно-кислого магния сернокислого семиводного 233; калия фосфор- но-кислого однозамещенного 250; кальция хлористого 331; борной кислоты 1,6; марганца серно-кислого пятиводного 6; цинка серно-кислого семиводного2,2; калия йодистого 0,21; кобальта хлористого шес- тиводного 0,006; натрия молибденово-кис- лого двуводного 0,6; меди сернокислой

пятиводной 0,006; железа серно-кислого семиводного 7; натрия - ЭДТА 9,3; мезо- инозита 20; никотиновой кислоты 0,5; гума- та натрия 30; сахарозы 10000; агар-агара 7500 на 1 л среды.

Таблица 1

) Среды Mi, M2, Мз, - по известному способу, среда К - для укоренения растений

и получения вызревшей лозы винограда. ) Состав минеральных элементов по Мурасиге-Скугу.

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица А

Таблица 5