Способ размножения винограда IN VIтRо Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

логиГ относится к биотехном гг: рГ:гг -°- --

..:;.;.- .

-и вь,садкой в .еплицу д а а о этом в к УСЛОВИЯМ, при

этом в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов кую в ° --яют меристемати ес

.ос;:--/.--e%:i- : в7 ЬЕ

НОИ кислотой Й-ИУК- , - УКСУС ненир н ° укоре Г--ма озлемен ов Г ™ °--- Кроме того, введение эксплантатов в культуру осуществляют на средГму Расиге-Скуга при содержании 6-бензил- аминопурина 0,1-0,2 мг/л. При этом адаптацию полученных растений к не гг„-г- -:-.

S.

СО

I В конце сентября готовят невызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранят во влажных ошлках при О - в течение 2 мес. Б начале декабря приступают к вычленению и культивированию эксплантатов. Перед посевом исходный материал стерилизуют. За отовленные побеги нарезают на одноглазковые черенки, тща- тельно отмывают в теплой мыльной во- ,е (АО-ЗО С) , для чего используют детское мыпо. Затем промывают водо- . проводной и дистиллированной водой, 1 оме1цают в стеклянный бокс и на 40 с заливают 70%-ным этиловым спиртом, а затем на 30 мин 10%-ным раствором ипохлорида кальция, который, отмыва- ют в течение 10 мин в трех-четырех 1брциях дистиллированной автоклави- зованной воды. После этого в cтepiиль- гюм боксе под микроскопом МБС-9 при 25-кратном увеличении с помощью дис - цизионных игл -из почек вычленяют ме- ристематические верхушки размером 0,17-0,25 мм (в зависимости от величины почек) , состоящие из конуса нарастания и двух-трех листовых при- . мордиев. Вьщеленные таким образом . 100 эксплантатов сорта Агат донской помещают на питальную среду Мураси- ге-Скуга следующего состава, мг/л (классическая пропись): 1650; КНОз 1900; CaCl2-6H2,0 ААО; MgS04 х х 7Н20. 370; 1 70; Н дВО 3 6 ,2 ; MnSO,. 22,3; СоСХг бН О 0,025; Си504-5НгО 0,025; ZnSOv 7Н.,0 8,6; Na,Mo04-2H O 0,25; KI 0,83; FeSO, х X 7Н20 27,8; Ыа ЭВТА 2Н2.0 37,3 и дополнительно мезо-инозит 100; пи- . ридоксин 0,2; тиамин О ,2, никотино- вая кислота 0,5; 6-бензиламинопурин (БАП) 0,15; сахароза 3%; агар 7,5 г/л рН среды перед автоклавированием 5, Пробирки с высаженными эксплантатам .помещают в культуральную комнату пр температуре воздуха 25-27 С, фотопериоде 16 ч освещенности 5000 лк, относительной влажности воздуха 7075%.

Через 5 нед из 100 высаженных эксплантатов у 60 отмечается развитие, побегов до 8-10 мм длиной с че- тьфьмя-пятью листочками. Так как образования корней у. этих побегов не происходит, приступают к обработке ба зальных концов побегов раствором 5-ИУК. В боксе в асептических условиях побеги достают из пробирок и

помещают базальными .концами на часовые стекла, в которые наливают раствор А -ИУК в концентрации 100мг/л. Через 20 ч побеги высаживают на модифицированную среду Мурасиге-Скуга (второй состав), не содержащую ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов, мг/л: KNO-j 950; MgS04-7H O 185; CaCl х2Н2П 166, ,68 мг/л. При этом Fe -хелат и микроэлементы оставили по Мурасиге-Скугу, мезоинозит 50 мг/л, пиридокг-ин 0,2 мг/л; сахароза 10 г/л; рН 5,6-6,0.

В течение месяца побеги укореняются и образуется 60 оздоровленных от вирусных заболеваний растений. После этого приступают к их микроразмножению. Обеззараживанию растений способствует небольшой размер эксплантатов выделяемых из почек невызревших побегов 0,17-0,25 мм. Оздоровленные растения размножают черенкованием: развившиеся растения разрезают, оставля на каждом отрезке один лист и почку в его пазухе. Этот микрочеренок снов помещают в .пробирку с модифицированной питательной средой второго состава, но в нее добавляют -ИУК в количестве 0,3 мг/л. Через 4 нед. укореняются 54 растения (процент укоренения составляет при этой концентрации А -ИУК 90), через 2 нед приступают к микроразмножению растений. До 1 июня проведены три пассажа. Коэф- .фициент составляет 1:480.

Перенос пробирочных укоренённых растений в нестерильные условия осуществляют, используя торфоперегнойные горшочки с субстратом из торфа, почвы и песка (1:1:1). С помощью пинцетов растения извлекают из пробирок, пропаласкивают корни в дистиллированной воде, высаживают, поливаю водой и накрывают на 6 дн полиэтиленовой пленкой. Пленку приоткрывают н несколько часов в день, а затем снимают. В дельнейшем растения регулярно поливают и подкармливают смесью Чеснокова,

После того как происходит адаптация растений, появляются один - два новых щста, растения высаживают в пленочное теплицы на солнечном обогреве с «неполностью контролируемыми условиями выращивания: параметры температуры, влажности,- освещенности складывались и колебались в зависи51

мости от метеоусловий. Экстремальный условия исключают путем регулярных проветриваний и поливов. Таким образом, данные условия приближены к естественным условиям среды произрастания полученного посадочного материала ,

П р и м е р 2. Способ осуществляют на сорте Восторг.

В начале октября готовят невызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранят во влажных опилках при О - в течение 2 мес. В середине декабря приступают к вычленению и культивированию эксплантатов.

Стерилизацию исходного материала осуществляют, как в предыдущем случае. В стерильном боксе под микроскопом МБС-9 вычленяют 100 верхушечных меристем и помещают на среду Мураси- ге-Скуга, которая отличается от среды, на которой культивируют Агат донской, содержанием БАЛ. 6-Бензилами- нопурин вводят в среду в концентрации 0,1 мг/л. Условия культивирэва- ния верхушечных меристем аналогичны условиям сорта Агат донской.

Через 6 нед из 100 высаженных меристем 50 развивают побеги 8-10 мм длиной с тремя-четырьмя листочками. Базальные части этих побегов в асептических условиях обрабатывают раствором |3-ИУК в контентрации 101 мг/л и высаживают на среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO, 955- , 140; MgS047Н О 187; CaCl х X 167; 69; Fe - хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставались без изменения, а мезоинозит 51 мг/л, пиридоксин 0,21 мг/л.

В течение месяца 49 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения. Через 2 нед приступают к их размножению путем микрочеренкования В дальнейшем технология размножения идентична для всех сортов, за исключением (i-ИУК, концентрация которой в данном случае составляет 0,4 мг/л, а Укореняемость микропобегов вино- рада 82,5%. Проведены три пассажа астений. Коэффициент размножения раен 1:330.

Примерз. Способ осуществлят на сорте Русмол.

В конце октября готовят невызрев- ую часть основных и пасынковых поегов и приступают к вычленению и ультивированию эксплантатов. Стериизацию исходного материала осущест55

1

й .

601117

вляют как у сортов Агат донской и Восторг. Также в стерильных условиях вычленяют 100 верхушечньпс меристем и помещают их на среду Мурасиге-Скуга содержание БАЛ в которой составляют 0,2 мг/л.

Через 6 нед иэ 100 высаженных меристем развивается 66 побегов длиной ,0 8-10 мм с четырьмя - пятью листочка- ми. Базальные части этих побегов обрабатывают водным раствором/3-ИУК в концентрации 99 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга сле- ,5 дующего состава, мг/л: KNO, 945- NH4N03 135; MgS04-7H.,0 183,- CacL х X 2Н,0 165; КН.РО, 67; Ре- елат/м - роэл.ементы, сахароза и рН оставались без изменения, мезоинозит 49 мг/л- 20 пиридоксин 0,19 мг/л.

В течение месяца 60 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения. Через 2 нед приступают к их микроразмножению по технологии, иден- 25 тичной примеру 1, за исключением -ИУК, которую добавляют в питательную среду в концентрации 0,5 мг/л Укореняемость микрочеренков при этом составляет 75%, количество пассажей 30 четыре, коэффициент размножения- : .

П р и м е р 4. Способ осуществляли на сорте Ромулюс.

В начале октября заготовили не- вызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранили во влажных опилках 1 мес. Во второй декаде ноября приступили к. вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилиза- цию исходного-материала проводили так же, как и в предыдущих опытах.

В асептических условиях под микроскопом вычленяют 100 верхущечных меристем и помещают на среду Мураси- ге-Скуга с содержанием БАП 0,25 мл/л. Через 5 нед из 100 высаженньпс меристем развивается 30 побегов длиной .а 1U мм с тремя - четырьмя листочками. Базальные части побегов обра- батыв.ают водным раствором и-ИУК в концентрации 100 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO 950- NH4NO, 138; MgSO .7Н-0 185; CaCl. х X 2Н,0. 166; , ta; Fe:xeлaт 5 микроэлементы оставались без изменения по Мурасиге-Скуга, мезоинозит 50; пиридоксин 0,2.

. В течение месяца 50 побегов укореняются и образуют оздоровленные расте 16011

ния. Через 2 нед приступают к их микроразмножению и адаптации по описанной технологии с содержанием jS-ИУК 0,3 мг/л, как и в примере 1. До 1 июня сделано три пассажа и коэффициент размножения составляет 1:400. Использование предлагаемого способа позволяет получить безвирусный посадочный материал в большом количестве в ускоренный срок.

10

Ф о рмула изобрете ния

1. Способ размножения винограда in vitro, включающий стерилизацию исходного материала, вычленение эксплантатов, посадку их на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин, с последующим культивированием и дальнейщую высадку в теплицу для адаптации к условиям открытого грунта, отличающий- с q тем, что, с целью повьшения выхода безвирусного посадочного матери- ала и ускорения процесса размножения, в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, в качестве эксплантата - находящуюся

8

0

5

0

25

в почке меристему, а культивирование осуществляют в три этапа, первым из которых является получение из эксплантатов побегов, вторым - укоренение полученных побегов и третьим - микроразмножение, при этом перед укоренением проводят обработку базальных концов побегов, полученных на первом этапе культивирования, Д-индолилук- сусной кислотой, а укоренение осуществляют на безгормональной модифицированной среде. Мурасиге-Скуга с умень- щенным вдвое содержанием макроэлементов и последующее микроразмножение осуществляют на той же питательной среде с добавлением -индолилуксус- ной кислоты.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что, с целью уменьшения сомаклональной изменчивости, на первом этапе культивирования в пита- тельную среду вводят 6-бензиламинопу- рин в количестве О,1-0,2 мг/л.

3.Способ по пп. 1 и- 2, о т л и - чающийся тем, что /3 -индоли- луксусную кислоту для обработки базальных концов побегов используют в концентрации 99-101 мг/л.

Изобретение относится к биотехнологии и касается микроклонального размножения винограда. Целью изобретения является повышение входа безвирусного посадочного материала и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что на модифицированную среду Мурасиге-Скуга высаживают меристемы, вычлененные из почек невызревших побегов. Затем получают побеги, обрабатывают их базальные концы βИУК, укореняют, проводят микрочеренкование, после чего адаптируют полученные растения к условиям открытого грунта. 2 з.п.ф-лы.