КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ LACTOBACILLUS PARABUCHNERI 6, LACTOBACILLUS PLANTARUM 20, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 22, ENTEROCOCCUS FAECIUM 4/6, BRETTANOMYCES BRUXELLENSIS 75, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦ, РЫБ, ПРЕСМЫКАЮЩИХСЯ, ЗЕМНОВОДНЫХ, БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству пробиотических препаратов, и может применяться в качестве кормовых добавок для профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у животных, птиц, рыб, пресмыкающихся, земноводных, беспозвоночных.

В животноводстве, птицеводстве и рыбоводстве в качестве кормовых добавок широко используют пробиотические препараты на основе штаммов лактобактерий рода Lactobacillus, энтерококков или дрожжей, которые являются монокультурными или содержат только группу микроорганизмов одного рода.

Молочнокислые бактерии и энтерококки в частности, являются ключевыми представителями облигатного микробиоценоза здорового организма и распространены, начиная с кожной поверхности, ротовой полости и заканчивая анальной полостью включительно. Антагонизм молочнокислых бактерий и энтерококков, основанный на биосинтезе антибиотических метаболитов белковой природы и кислотообразовании, обусловливает их использование в качестве биопрепаратов естественного происхождения. Молочнокислые бактерии продуцируют нуклеазы, лизоцим, витамины, усиливают активность макрофагов в организме, стимулируют секрецию антител, цитокинов, что в значительной степени способствует повышению общей иммунологической реактивности организма и установлению симбиотических отношений с бифидо- и колибактериями. Энтерококки, являющиеся представителями нормальной микрофлоры животных, обеспечивают гидролиз сахаров, синтез витаминов, расщепление жирных кислот; выполняют функции активных иммуностимуляторов, поддерживая необходимый уровень цитокинов; обеспечивают колонизационную резистентность слизистых, способствуют элиминации из кишечника патогенных бактерий.

Разработка поликультурных пробиотических препаратов связана с необходимостью получения новых высокоактивных штаммов микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры кишечника. При этом важное значение имеют ростовые свойства, интенсивность кислотообразования, антагонистическая активность по отношению к болезнетворным микроорганизмам, а также технологичность штаммов, позволяющая использовать их в технологии промышленного получения биопрепаратов.

Консорциумы по сравнению с монокультурами микроорганизмов обладают такими преимуществами, как универсальность (поливалентность), способность к саморегуляции за счет изменения соотношения численности видов, входящих в консорциум, способность утилизировать неоднородные по составу субстраты, возможность использовать бедные и менее ценные питательные среды за счет обогащения их метаболитами микроорганизмов-ассоциантов, широкомасштабное использование функциональных возможностей микроорганизмов, более высокая активность, чем у отдельного штамма (синергизм), увеличение срока хранения, меньшая стоимость, вариация норм применения, направленная на их сокращение, расширение спектра применения, связанного с микробиологией.

Известен кормовой продукт для сельскохозяйственных животных и птиц (патент РФ №2552872, дата начала отсчета срока действия патента 28.07.2014), содержащий в своем составе сорбционный материал, молочную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, отличающийся тем, что в качестве сорбционного материала он содержит смесь вермикулита и бентонитовой глины в соотношении (40:60)-(20:80) и дополнительно высушенную биомассу Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa при следующем соотношении ингредиентов (мас.%): молочная кислота 12,0-15,0; янтарная кислота (или ее соли) 4,0-8,0; лимонная кислота 4,0-8,0; высушенная биомасса Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa 5,0-10,0; вермикулит и бентонитовая глина до 100%.

Известна кормовая добавка для сельскохозяйственных животных «Лакто плюс» (патент РФ №2350101, дата начала отсчета срока действия патента 20.12.2006), включающая смесь молочнокислых бактерий, отличающаяся тем, что смесь молочнокислых бактерий представлена бактериями видов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus salivarius, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc dextranicum и включает смесь дрожжевых грибов видов Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporas, Torulopsis sphaerica, Torulaspora delbrueskii, Candida kefir, Candida holmii, Candida friedrichii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus при следующем соотношении компонентов: при содержании смеси молочнокислых бактерий и смеси дрожжевых грибов в соотношении 3:1.

Известен консорциум штаммов Clostridium Cellobioparum Э-157, Ruminococcus Flavefaciens K-399, Lactobacillus Acidophilus 1082, Propionibacterium Acnes-83, используемый для приготовления пробиотического препарата для жвачных животных, и способ получения пробиотического препарата для жвачных животных (патент РФ №2260043, дата начала отсчета срока действия патента 17.07.2003).

Существенным недостатком перечисленных препаратов является их сухая форма, имеющая вид порошка, и как следствие этого низкие органолептические качества, длительный срок активации после попадания в кишечник и адаптации к новым условиям. Растворение в воде сухих препаратов требует дополнительных экономических, временных и трудовых затрат, так как некоторые порошки плохо растворяются в воде, в то время как жидкие - мгновенно. В отличие от сухих, жидкие про биотические препараты можно принимать не только перорально, но и вводить в прямую кишку, нос или наносить на кожу, шерсть или перья.

Целью настоящего изобретения является получение консорциума штаммов бактерий пяти видов, обладающего комплексом свойств, присущих отдельным штаммам и характеризующегося устойчивым свойством биосинтеза ферментов, органических кислот, спиртов, а также высокой способностью подавлять патогенные и условно-патогенные бактерии, который может быть использован для приготовления пробиотического препарата для животных, птиц, рыб, пресмыкающихся, земноводных, беспозвоночных.

Консорциум получен при выращивании пяти штаммов разных видов микроорганизмов: Lactobacillus parabuchneri 6 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3553D), Lactobacillus plantarum 20 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3552D), Lactobacillus acidophilus 22 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3563D), Enterococcus faecium 4/6 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3551D), Brettanomyces bruxellensis 75 (депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ Y-3064D). Консорциум представляет собой суспензию коричневого цвета, обладающую кисломолочным запахом. Концентрация водородных ионов рН составляет 3,0-4,0. Количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии составляет, не менее КОЕ/мл:

Lactobacillus parabuchneri 6: 1×10⁶

Lactobacillus plantarum 20: 1×10⁶

Lactobacillus acidophilus 22: 1×10⁶

Enterococcus faecium 4/6: 1×10⁶

Brettanomyces braxellensis 75: 1×10⁵.

Культурально-морфологические свойства консорциума

Штамм Lactobacillus parabuchneri 6 выделен из самоквасных домашних кисломолочных продуктов. На твердых питательных средах Lactobacillus parabuchneri 6 образует непрозрачные, гомогенные, S-формы колонии белого цвета. Профиль колоний выпуклый, край ровный. При культивировании в жидкой питательной среде MRS образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. Диаметр колоний 1-2 мм. В мазках клетки имеют вид коротких палочек, встречаются одиночные, но преимущественно в коротких цепочках. Грамположительные. Размер клеток: 1,0-1,1 × 0,6-0,8 мкм. Не спорообразующие, клетки не подвижны.

Штамм Lactobacillus plantarum 20 выделен из силосного зерна. На твердых питательных средах образует слабовыпуклые, полупрозрачные, колонии R-формы, диаметром 2,0-2,5 мм грязно-белого цвета. В жидкой питательной среде MRS образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. Клетки неподвижны, не спорообразующие. В мазках клетки имеют вид палочек среднего размера, одиночные, парами, иногда в коротких цепочках. Грамположительные.

Штамм Lactobacillus acidophilus 22 выделен из самоквасного кисломолочного продукта. На плотных средах MRS образует слабовыпуклые, круглые, белые, полупрозрачные колонии R-формы диаметром 1,0-1,5 мм. В жидкой среде MRS наблюдается равномерное помутнение и образование рыхлого осадка через 24 часа. В мазках имеет вид прямых палочек, располагающихся поодиночке или в виде цепочек из 2-4 и более клеток. Штамм спор и капсул не имеет, грамположительный.

Штамм Enterococcus faecium изолирован из эпифитной сферы растений. На плотных питательных средах образует точечные, круглые, плоские, гладкие S-формы колонии, на среде MRS - белого цвета, на среде Тернера - красного цвета, на МИС - черного цвета. Морфология: кокки, располагающиеся парами и в коротких цепочках по 4-6 клеток. Неподвижные. Спор и капсул не образуют. Грамположительные.

Штамм Brettanomyces bruxellensis 75 выделен из женских шишек хмеля. На среде Сабура образует круглые колонии с ровным краем, цвет грязно-белый, диаметр - 1-2 мм. Профиль колоний выпуклый, колонии мягкие, гомогенные. В жидкой среде Сабуро наблюдается равномерное помутнение и образование рыхлого осадка через 24 часа. Клетки спор и капсул не образуют, неподвижные, истинного мицелия не образуют. Форма клеток овальная, размер: 1-2,5 × 3-4 мкм.

Физиолого-биохимические свойства консорциума

Метаболизм молочнокислых бактерий Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22 и энтерококка Enterococcus faecium 4/6 бродильный, но возможен рост и в присутствии воздуха (факультативные анаэробы). Бактерии обладают широким спектром потребления единственных источников углерода и энергии: моно-, ди-, олигосахаридов.

Lactobacillus parabuchneri 6 сбраживает следующие углеводы: фруктоза, мальтоза, глюкоза, галактоза, манит, сорбит, манноза, сахароза. Такие углеводы, как арабиноза, рамноза, раффиноза, ксилоза штамм Lactobacillus parabuchneri 6 не сбраживает.

Lactobacillus plantarum 20 ферментирует следующие углеводы: сорбит, ксилоза, маннит, рафиноза, манноза, сахароза, лактоза, мальтоза, галактоза, фруктоза, глюкоза подлежат сбраживанию. Такие углеводы, как арабиноза, рамноза, ксилоза штамм Lactobacillus plantarum 20 не сбраживает.

Lactobacillus acidophilus 22 сбраживает следующие углеводы: целлобиоза, фруктоза, галактоза, глюкоза, лактоза, мальтоза, манноза, сахароза.

Enterococcus faecium 4/6 ферментирует галактозу, глюкозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, лактозу, целлобиозу, декстрин. Ферментацию арабиноза, маннита, ксилозы и сорбита Enterococcus faecium 4/6 не проводит.

Штаммы Lactobacillus parabuchneri 6 и Lactobacillus acidophilus 22 образуют аммиак из аргинина, а штаммы Lactobacillus plantarum 20 и Enterococcus faecium 4/6 - не образуют.

Штаммы лактобактерий Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22 и энтерококка Enterococcus faecium 4/6 устойчивы к факторам среды, обеспечивающим выживаемость в кишечнике: желчи, фенолам, а также солям и спиртам, обладают амило-, лило- и протеолитической активностью. Данные представлены в таблице 1.

Анализ культуральной жидкости молочнокислых бактерий показал наличие низкомолекулярных веществ - органических кислот (г/л культуральной жидкости). Данные приведены в таблице 2.

Среды культивирования

Для Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22: молоко коровье цельное, нормализованное или обезжиренное, мясопептонный бульон с добавлением 1-2% глюкозы или лактозы, молочная сыворотка, лактоагар, агар MRS, жидкая среда MRS, мясопептонный агар, среда Reddy, среда Rogosa. Лактобактерии культивируют аэробно при температуре 37±1°С на протяжении 24-36 часов.

Для Enterococcus faecium 4/6: жидкая и твердая среда Эликера, жидкая и твердая среда MRS, канамицин азидно-эскулиновый агар, агар Сланец-Бертли, щелочная полимиксиновая среда, молочно-ингибиторная среда. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С в течение 24-30 часов.

Для Brettanomyces braxellensis 75: агар Сабуро, глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом, мальт-пептонный агар, мальт-агар, картофельно-глюкозный агар, соево-сахарозный агар, соево-сахарозная среда, солодовый бульон с дрожжевым экстрактом, глюкозо-пептонная среда. Дрожжи культивируют при температуре 28°С на протяжении 24-48 часов.

Длительное хранение штаммов

Штаммы хранят на жидкой питательной среде и на скошенном агаре при температуре 4-6°С, при этом пересев проводят 1 раз в 2 месяца или в полужидкой среде под слоем вазелинового масла, пересев - 1 раз в 6 месяцев.

Средой хранения для Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22 являются: агар MRS, жидкая среда MRS, Keddy; для Enterococcus faecium 4/6 - жидкая и твердая среда Эликера, канамицин азидно-эскулиновый агар, агар Сланец-Бертли, щелочная полимиксиновая среда, молочно-ингибиторная среда; для Brettanomyces braxellensis 75 - агар Сабуро, жидкая среда Сабуро, глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом, картофельно-глюкозный агар.

Консорциум штаммов Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22, Enterococcus faecium 4/6, Brettanomyces braxellensis 75 предназначен для приготовления пробиотического препарата для животных, птиц, рыб, пресмыкающихся, земноводных, беспозвоночных, получение которого может быть осуществлено следующим способом.

Предлагаемый способ получения пробиотического препарата подразумевает содержание в нем в качестве основного активного компонента жизнеспособных микроорганизмов, их метаболитов и остатков культуральной среды (жидкая форма пробиотического препарата) или жизнеспособных микроорганизмов в концентрированной или адсорбированной форме препарата (сухая форма пробиотического препарата).

В данном способе получения пробиотического препарата культивирование осуществляют глубинным методом. Это позволяет наиболее полно использовать компоненты питательной среды и получить препарат с максимальным содержанием микробных клеток.

Способ получения пробиотического препарата состоит из следующих этапов: подготовка посевных культур микроорганизмов из штаммов-симбионтов в лабораторных или производственных биореакторах объемом от 2 до 100 л; совместное культивирование лактобактерий, энтерококков и дрожжей в питательной среде.

Готовят посевную культуру каждого штамма-симбионта. Для Lactobacillus parabuchneri 6, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus acidophilus 22 и Enterococcus faecium 4/6 среда содержит углеводы, источник органического азота, минеральные соли и воду. В качестве источника органического азота питательная среда содержит гидролизат и/или автолизат дрожжей, и/или кукурузную муку, и/или гидролизат казеина, и/или пептон ферментативный и/или пептон дрожжевой и/или белково-витаминный концентрат. Среду можно стерилизовать или использовать нестерильной и засевать посевной культурой. При глубинном культивировании и соблюдении следующих условий: перемешивание, аэрация, температура 36°С и использовании вышеуказанных сред в качестве субстрата для накопления биомассы производственных штаммов лактобактерий, продолжительность культивирования составляет 18-48 часов, а энтерококка - 24-27 часов. Указанная продолжительность культивирования обеспечивает накопление биомассы до 10⁶-10⁸ КОЕ/мл.

Для дрожжевой культуры питательную среду готовят смешиванием глюкозы и источника органического азота. Культивирование осуществляют глубинным методом при перемешивании и аэрации, при температуре 28°С, в течение 36-48 часов.

Культивирование микробной ассоциации проводят в многотоннажном биореакторе (1-15 тонн) глубинным способом. Использование мелассы свекловичной или патоки кукурузной в процессе культивирования лактобактерий, энтерококков и дрожжей позволяет исключить другие углеводы и снизить себестоимость питательной среды, применяемой при накоплении биомассы микроорганизмов. Среда помимо углеводов содержит источник органического азота, минеральные соли и воду. В качестве источника органического азота питательная среда содержит гидролизат и/или автолизат дрожжей и/или кукурузной или соевой муки. Для повышения биологического потенциала препарата, получаемую бактериальную взвесь лактобактерий вида Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium как основы микробного консорциума, смешивают с культурой дрожжей Brettanomyces braxellensis.

Достигаемый результат совместного культивирования лактобактерий и дрожжей заключается в синергичном эффекте данных групп микроорганизмов и повышении его биологической активности (табл. 1, 2). Увеличение зоны подавления тест-организма при совместном действии лактобактерий, энтерококка и дрожжей по сравнению с их монокультурами, отмечено у всех тестируемых видов, т.е. антагонистическая активность монокультур выражена меньше чем у консорциума, состоящего их этих микроорганизмов.

Пример 1. Использование штаммов консорциума для получения пробиотического препарата

Пассаж 1. Штаммы выращивают отдельно при внесении 5% инокулята на питательных средах следующего состава (г/л): Clostridium cellobioparum КЭ-157 - KNH4HPO4 - 0,2; КН2РО4 - 0,1; CaCl2 - 0,03; пептон - 0,1; MgSO4 - 0,05; СаСО3 - 0,5; микрокристаллическая целлюлоза - 2,0; агар - 1,5; рН - 6,8-7,0. Rummococcus flavefaciens K-399 - К2РО4 - 0,4; MgSO4 - 0,04; NaCl - 0,6; (NH4)2SO4 - 1,0; целлобиоза - 0,6; агар - 1,5; рН - 6,7-7,0. Lactobacillus acidophilus 1082 выращивают на среде MRS. Propionibacterium acnes 83 - пептон - 2,5; дрожжевой экстракт - 5,0; CoCl2 - 2,5; глюкоза - 8,0; молочная сыворотка - остальное, рН - 6,8-7,0.

Выращивание штаммов ведут при температуре (37±1)°С в течение 48 час. Определяют количество клеток в 1 мл культуры методом титра.

Пассаж 2. В приготовленную среду накопления, имеющую следующий состав (г/л): гидролизованное молоко - 350-500; дрожжевой экстракт - 3,5; MgSO4 - 0,05; NaCl - 0,65; КН2РО4 - 0,25; микрокристаллическая целлюлоза - 1,5-2,0; рН - 6,8-7,0, вносят выращенную культуру каждого штамма в посевной дозе 5-10% и культивируют 12-14 часов при температуре (37±1)°С. Определяют количество клеток в 10-см³ культуры методом десятикратных разведений до 10-8-10-11.

Пассаж 3. Полученный консорциум в объеме 5% вносят в среду накопления большего объема и выращивают 10-12 часов при температуре (37±1)°С, получая необходимую биомассу.

Пример 2. Использование консорциума штаммов для получения пробиотического препарата

Штаммы Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propiombacterium acnes 83 - 1,2,3 пассажей выращивают при (37±1)°C в течение 10-12 часов до рН - 4,5-4,6, охлаждают до 6-10°С и подвергают центрифугированию. Полученную биомассу консорциума смешивают с защитной сахаро-желатиновой средой в соотношении 1:1-1:1,5 и высушивают. Содержание клеток в сухом биопрепарате составляет более 300 млрд. в 1 г.

В сухой биопрепарат вносят один из наполнителей: глюкозу, сухую молочную сыворотку, муку. В смеси штаммов и наполнителя содержание жизнеспособных клеток в 1 дозе достигает соответственно: Clostridium cellobioparum КЭ - 157-109-1010; Ruminococcus flavefaciens K-399 - 109-1010; Lactobacillus acidophilus 1082 - 108-109; Propionibacterium acnes 83 - 10-109. Причем соотношение сухого биопрепарата и наполнителя составляет 1:6-1:7.

Пример 3.

В качестве биологической модели для испытания пробиотического препарата использовали молочных коров в зимний период в хозяйстве с перспективным ростом молочной продуктивности. Контролем были животные, которым препарат в корм не добавляли. Рационы кормления опытной и контрольной групп были равноценны.

Препарат смешивают с концентрированным кормом и скармливают. 1 доза препарата содержит 50 г и соответствует содержанию жизнеспособных клеток не менее 50 млрд.

В опытной и контрольной группах определяют молочную продуктивность, среднесуточный удой, массовую долю жира в молоке.

Опытные данные представлены в таблице.

Из таблицы следует, что пробиотический препарат, включающий консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes 83, способствует повышению молочной продуктивности коров.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой консорциум штаммов Lactobacillus parabuchneri 6 ВКМ B 3553D, Lactobacillus plantarum 20 ВКМ B 3552D, Lactobacillus acidophilus 22 ВКМ B 3563D, Enterococcus faecium 4/6 ВКМ B 3551D, Brettanomyces bruxellensis 75 ВКМ Y 3064D, используемый для приготовления пробиотического препарата для животных. Изобретение позволяет повысить способности подавления патогенных и условно-патогенных бактерий. 2 табл., 3 пр.

Консорциум штаммов Lactobacillus parabuchneri 6 ВКМ B 3553D, Lactobacillus plantarum 20 ВКМ B 3552D, Lactobacillus acidophilus 22 ВКМ B 3563D, Enterococcus faecium 4/6 ВКМ B 3551D, Brettanomyces bruxellensis 75 ВКМ Y 3064D, используемый для приготовления пробиотического препарата для животных.