КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ CLOSTRIDIUM CELLOBIOPARUM КЭ-157, RUMINOCOCCUS FLAVEFACIENS К-399, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 1082, PROPIONIBACTERIUM ACNES-83, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, производству пробиотиков и может применяться в животноводстве.

Одной из сложных проблем в животноводстве является повышение эффективности использования кормов. В процессе пищеварения у жвачных животных важное место отводится деятельности разнообразной микрофлоры, обитающей в отделах пищеварительного канала. Микроорганизмы, попадая вместе с кормом, трансформируют питательные вещества, образуя различные соединения, которые используются в обменных процессах организма животных и принимают участие в молокообразовании.

Известны пробиотические препараты как моно-, так и комплексные, включающие в свой состав ацидофильную палочку, пропионово-кислые, целлюлозолитические бактерии и другие, применяемые для стимуляции физиологических функций организма, профилактики дисбактериозов, а также повышения продуктивности животных. Сообщается о применении штамма Lactobacillus acidophilus var. coccoideus M-86, сбраживающего крахмал и декстрины, препарата «целлобактерина», представляющего собой ассоциацию целлюлозолитических микроорганизмов из смеси штаммов Clostridium thermocellulociticus, Ruminococcus albus, Clostridium locheadii, выделенных из нормальной микрофлоры пищеварительного тракта молодняка жвачных животных. Препарат способствует повышению эффективности использования грубых кормов, увеличению прироста живой массы животных /1, 2, 3, 4/.

Перспективны комплексные пробиотические препараты, содержащие микроорганизмы, обладающие широким спектром ферментативной активности, в том числе, выраженной целлюлозолитической, амилолитической, лактатферментирующей активностью, а также ускоряющие становление нормальной микрофлоры, способные продуцировать витамины и другие биологически активные вещества.

Целью настоящего изобретения является получение консорциума штаммов бактерий четырех видов, обладающих комплексом свойств, присущих отдельным штаммам и проявляющих повышенную специфическую активность к целлюлозе, крахмалу, моно- и дисахаридам, а также проявляющих протеолитическую и лактатферментирующую активность, который может быть использован для приготовления пробиотического препарата для жвачных животных.

Консорциум получен при выращивании четырех штаммов разных видов микроорганизмов: Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes 83, выделенных из рубцового содержимого коров и имеющих сходные физиолого-биохимические свойства.

Морфологические, культурально-биохимические свойства

консорциума

Штамм Clostridium cellobioparum КЭ-157 имеет форму крупных палочек, расположенных одиночно, образующих споры. Палочки подвижны, грамположительны. Анаэробы. Оптимальная температура роста 30-37°С, рН 6,8-7,0. Сбраживает целлюлозу, целлобиозу, крахмал, маннит, глюкозу, лактозу, фруктозу, галактозу. Не патогенны. Растут на средах с микрокристаллической целлюлозой. Способствуют усилению пищеварительных процессов.

Штамм Ruminococcus flavefaciens K-399 имеет клетки сферические в цепочках от 8 и более клеток, неподвижны, спор не образуют, грамположительные. Колонии на агаре из рубцовой жидкости с глюкозой и целобиозой гладкие, выпуклые. Сбраживает целлюлозу, целлобиозу, глюкозу, лактозу, сахарозу. Оптимальная температура роста 30-37°С. Анаэробы. Оптимальное значение рН 6,5-6,8. Не патогенны. Обладают высоким ферментативным потенциалом.

Штамм Lactobacillus acidophilus 1082 имеет палочковидную форму клеток, расположенных в цепочках по 2-3, неподвижны, спор не образуют, грамположительны. Растут на стерилизованном молоке, среде МРС. Сбраживают глюкозу, мальтозу, галактозу, сахарозу, целлобиозу, фруктозу, маннозу, мелибиозу, рафинозу, трегалозу, сорбит, маннит. Устойчивы к щелочной среде, желчи, хлориду натрия. Обладает высокой ферментативной активностью, продуцирует молочную кислоту.

Штамм Propionibacterium acnes 83 - короткие палочки с закругленными концами, соединенные в короткие цепочки, неподвижны, спор не образуют, грамположительные. На агаризованных средах с глюкозой и лактатом образует чечевицеобразные колонии. Оптимальная температура роста (37±1)°С, рН 6,8-7,0. Молоко не свертывает. Сбраживает фруктозу, галактозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, рибозу, целлобиозу. При ферментации углеводов образует пропионовую, уксусную, янтарную, муравьиную, изовалерьяновую кислоты. Не патогенны.

Способствуют усвоению питательных веществ и синтезу составных частей молока.

Консорциум предназначен для приготовления пробиотического препарата, получение которого может быть осуществлено по способу производства биологически активной кормовой добавки /5/.

Пример 1. Использование штаммов консорциума для получения пробиотического препарата.

Пассаж 1. Штаммы выращивают отдельно при внесении 5% инокулята на питательных средах следующего состава (г/л): Clostridium cellobioparum КЭ-157 - KNH₄HPO₄ - 0,2; КН₂PO₄ - 0,1; CaCl₂ - 0,03; пептон - 0,1; MgSO₄ - 0,05; СаСО₃ - 0,5; микрокристаллическая целлюлоза - 2,0; агар - 1,5; рН - 6,8-7,0. Ruminococcus flavefaciens K-399 - К₂РО₄ - 0,4; MgSO₄ - 0,04; NaCl - 0,6; (NH₄)₂SO₄ - 1,0; целлобиоза - 0,6; агар - 1,5; рН - 6,7-7,0. Lactobacillus acidophilus 1082 выращивают на среде MRS. Propionibacterium acnes 83 - пептон - 2,5; дрожжевой экстракт - 5,0; CoCl₂ - 2,5; глюкоза - 8,0; молочная сыворотка - остальное, рН - 6,8-7,0.

Выращивание штаммов ведут при температуре (37±1)°С в течение 48 час. Определяют количество клеток в 1 мл культуры методом титра.

Пассаж 2. В приготовленную среду накопления, имеющую следующий состав (г/л): гидролизованное молоко - 350-500; дрожжевой экстракт - 3,5; MgSO₄ - 0,05; NaCl - 0,65; КН₂PO₄ - 0,25; микрокристаллическая целлюлоза - 1,5-2,0; рН - 6,8-7,0, вносят выращенную культуру каждого штамма в посевной дозе 5-10% и культивируют 12-14 часов при температуре (37±1)°С. Определяют количество клеток в 10-см³ культуры методом десятикратных разведений до 10^-8-10^-11.

Пассаж 3.Полученный консорциум в объеме 5% вносят в среду накопления большего объема и выращивают 10-12 часов при температуре (37±1)°С, получая необходимую биомассу.

Пример 2. Использование консорциума штаммов для получения пробиотического препарата.

Штаммы Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes 83 - 1,2,3 пассажей выращивают при (37±1)°С в течение 10-12 часов до рН - 4,5-4,6, охлаждают до 6-10°С и подвергают центрифугированию. Полученную биомассу консорциума смешивают с защитной сахаро-желатиновой средой в соотношении 1:1-1:1,5 и высушивают. Содержание клеток в сухом биопрепарате составляет более 300 млрд. в 1 г.

В сухой биопрепарат вносят один из наполнителей: глюкозу, сухую молочную сыворотку, муку. В смеси штаммов и наполнителя содержание жизнеспособных клеток в 1 дозе достигает соответственно: Clostridium cellobioparum КЭ - 157-10⁹-10¹⁰; Ruminococcus flavefaciens K-399 - 10⁹-10¹⁰; Lactobacillus acidophilus 1082 - 10⁸-10⁹; Propionibacterium acnes 83 - 10-10⁹. Причем соотношение сухого биопрепарата и наполнителя составляет 1:6-1:7.

Пример 3. В качестве биологической модели для испытания пробиотического препарата использовали молочных коров в зимний период в хозяйстве с перспективным ростом молочной продуктивности. Контролем были животные, которым препарат в корм не добавляли. Рационы кормления опытной и контрольной групп были равноценны.

Препарат смешивают с концентрированным кормом и скармливают. 1 доза препарата содержит 50 г и соответствует содержанию жизнеспособных клеток не менее 50 млрд.

В опытной и контрольной группах определяют молочную продуктивность, среднесуточный удой, массовую долю жира в молоке.

Опытные данные представлены в таблице.

ТаблицаУчитываемые показателиГруппыОпытнаяКонтрольнаяКоличество коров, гол.140120Среднесуточный удой, кг2624Массовая доля жира в молоке, %3,833,76

Из таблицы следует, что пробиотический препарат, включающий консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes 83, способствует повышению молочной продуктивности коров.

Источники информации

1. Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвачных. М.: Колос. - 1982. - 247 с.

2. Тараканов Б.В. Использование пробиотиков в животноводстве. -Калуга. - 1998. - 53 с.

3. RU 2154102 С2.

4. Ассоциация микроорганизмов для скармливания молодняку крупного рогатого скота. Авторское свидетельство СССР 1671693, опубл. 23.08.91 Бюлл. 31.

5. RU 2173159 С2.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству пробиотиков, и может быть использовано в животноводстве. Способ предусматривает приготовление питательной среды, заквашивание ее консорциумом штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes-83 и накопление биомассы. Смешивают полученную биомассу с защитной средой и сушат. Добавляют наполнитель. Изобретение позволяет увеличить молочную продуктивность коров. 2 н.з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminococcus flavefaciens K-399, Lactobacillus acidophilus 1082, Propionibacterium acnes-83, используемый для приготовления пробиотического препарата для жвачных животных.2. Способ получения пробиотического препарата для жвачных животных, предусматривающий приготовление питательной среды, заквашивание, накопление биомассы и отделение ее от культуральной среды, смешивание биомассы с защитной средой и сушку, отличающийся тем, что заквашивание среды осуществляют консорциумом штаммов по п.1.