Биологически активная кормовая добавка Российский патент 2023 года по МПК A23K10/10 

Изобретение относится к звероводству, в частности к области приготовления кормов для пушных зверей.

Все исследования по созданию препаратов для внесения в рацион пушных зверей проводятся в двух направлениях.

Первое направление предполагает создание биологических препаратов для профилактики и лечения кишечных токсикоинфекций, обеспечивая сохранность поголовья молодняка пушных зверей.

Второе направление предполагает создание биологически активных добавок, поддерживающих нормальное функциональное состояние макроорганизма, так как использование кормов не обеспечивает потребности организма пушных зверей в микроэлементах, витаминах, аминокислотах, отдельных биологически активных добавках.

Одним из наиболее часто встречающихся заболеваний у пушных зверей являются кормовые токсикозы, с которыми связывают примерно 80 % случаев патологий у зверей. Основным этиологическим фактором этих болезней является энтеропатогенная микрофлора, попадающая в организм животных с кормами.

В настоящее время к числу высокоэффективных профилактических средств специалисты относят микроорганизмы, обладающие пробиотическими свойствами.

Известно, что для становления микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у молодняка сельскохозяйственных животных и птиц предложено использование пробиотических препаратов на основе лактобактерий, бифидобактерий и бактерий рода Bacillus.

Наиболее близкими техническими решениями являются следующие/

Композиция биологически активной кормовой добавки для молодняка сельскохозяйственных животных [патент на изобретение RU 2525920 C2. Заявка №2010115208/13 от 19.04.2010, опубл.: 20.08.2014 в Бюл. № 23]. Композиция добавки включает хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчёл, лактулозу, бифидумбактерин, витамин C, сухие экстракты трав.

Кормовая добавка с пробиотической активностью на минеральной основе [патент на изобретение RU 2569002 C1. Заявка №2014145715/13 от 13.11.2014, опубл.: 20.11.2015 в Бюл. № 32]. Кормовая добавка состоит из жизнеспособных спор бактерий Bacillus subtilis и наполнителя – диатомита.

Кормовая пробиотическая добавка для птиц [патент на изобретение RU 2742867 C1. Заявка №2021100077 от 11.01.2021, опубл.: 11.02.2021 в Бюл. № 5]. Добавка содержит биоконцентрат, представляющий собой смесь, включающую лактобактерии и пропионовокислые бактерии, предварительно сублимированные до состояния лиофилизированного порошка, сухую молочную сыворотку, порошок цеолита и фульвовую кислоту.

Кормовая добавка с пробиотической активностью [заявка на изобретение RU 2016152710 A от 30.12.2016, опубл.: 27.10.2018 в Бюл. №30]. Кормовая добавка состоит из сухого бактериального концентрата жизнеспособных клеток штамма Lactobacillus plantarum, обладающего лизинпродуцирующими свойствами.

В результате применения перечисленных препаратов нормализуется процесс пищеварения, повышается усвояемость корма и показателя неспецифической резистентности, подавляется развитие патогенной микрофлоры.

Недостатком всех представленных препаратов является отсутствие результатов оценки эффективности для пушных зверей.

Другим направлением в создании препаратов для обогащения рациона пушных зверей является использование комплексных кормовых добавок, содержащих биологически активные вещества. Обогащение рационов питания пушных зверей биологически активными кормовыми добавками обусловлено необходимостью поддержания нормального физиологического состояния, поскольку в условиях промышленных зверокомплексов на здоровье животных негативно влияет низкое содержание в рационе питания микроэлементов, витаминов и других биологически активных веществ. Следует отметить, что их использование ограничивается применением витаминно-минеральных добавок в различных сочетаниях, некоторых аминокислот, янтарной кислоты, хитозана, цеолита и других. Известны кормовая добавка для повышения качества меха и шкурок пушных зверей [патент на изобретение RU 2600744 C1. Заявка № 2015116219/13 от 28.04.2015, опубл.: 27.10.2016 в Бюл. № 30], которая содержит диацетофенонилселенид и наполнитель нанобентонит. Использование кормовой добавки обеспечивает повышение качества меха в результате увеличения средней густоты волосяного покрова.

Способ выращивания молодняка пушных зверей [патент на изобртение RU 2569584 C1. Заявка № 2014135320/13 от 28.08.2014, опубл.: 27.11.2015 в Бюл. № 33], который заключается в том, что в рацион молодняка пушных зверей в период роста включают «Лигногумат КД-Б». Использование изобретения позволяет повысить качество шкур.

Недостатком кормовых добавок на основе биологически активных веществ является отсутствие в их составе пробиотиков.

Технический результат заключается в создании биологически активной кормовой добавки для пушных зверей, обеспечивающей профилактику кишечных токсикоинфекций бактериальной природы, нормализацию микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, повышение качественных и количественных характеристик пушно-мехового сырья.

Технический результат изобретения достигается тем, что биологически активная кормовая добавка для пушных зверей состоит из композиции двух штаммов лактобацилл: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747, Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839 и штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ В-13389 в соотношении 1:1:1 по объему с конечной концентрацией не менее 2,0×10⁹ КОЕ/см³ и торфогеля в соотношении с микробным компонентом 1:1 по объему и конечной концентрацией микроорганизмов в биологически активной добавке не менее 9,0×10⁸ КОЕ/см³. Все штаммы микроорганизмов, входящие в состав кормовой добавки, не относятся к микроорганизмам, патогенным для человека и животных согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08, работа с которыми не требует специальных мер защиты. Внесение в состав препарата штаммов лактобацилл основано на том, что наиболее эффективными в животноводстве и птицеводстве считаются пробиотические препараты на основе видов микроорганизмов доминирующих представителей резидентной кишечной микрофлоры молодняка пушных зверей. Лактобациллы за счет своих пробиотических свойств (антагонистической и адгезивной активности, способности к кислотообразованию) обеспечивают подавление микроорганизмов-возбудителей кишечных токсикоинфекций.

Бактерии штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ В-13389 являются транзиторными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта. При этом они обладают широким спектром антагонистической и ферментативной активности. Применение в биологически активных добавках Bacillus subtilis способствует снижению патогенной микрофлоры в микробиоте и увеличению концентрации резидентных микроорганизмов, в том числе Lactobacillus.

Гуминовые кислоты, содержащиеся в торфогеле, снижают уровень токсинов, улучшают переваривание белка и усвоение кальция, микроэлементов, питательных веществ, а также они образуют пленку на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, защищая макроорганизм от инфекционных агентов и токсинов. В результате происходит повышение уровня иммунологического ответа на внедрение в организм патогенной микрофлоры, увеличение привесов пушных зверей, повышение качества пушно-мехового сырья, что дает положительный экономический эффект.

Порядок приготовления активной кормовой добавки, пробиотические свойства лактобактерий, профилактическая эффективность при токсикоинфекциях, изменения качественных и размерных характеристик меха и шкурок пушных зверей подтверждаются следующими примерами.

Пример 1. Приготовление активной кормовой добавки для пушных зверей

Для приготовления кормовой добавки проводили смешение жидких культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747, Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839 и Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ В-13389 в соотношении 1:1:1 по объему. Культивирование микроорганизмов осуществляли в бутылях емкостью 20,0 дм³, содержащих 10,0 дм³ жидких питательных сред следующего компонентного состава.

Для лактобацилл, г/дм³:

- меласса – 15,0 см³;

- лактоза – 5,0;

- кукурузный экстракт – 5,0 см³;

- дрожжевой экстракт – 2,5;

- FeSO₄ ·7 H₂O – 0,05;

- MnSO₄·4 H₂O – 0,05;

- K₂HPO₄ – 2,0;

- ацетат натрия – 5,0;

- KH₂PO₄ – 1,8;

Дистиллированная вода – до 1,0 дм³.

Для Bacillus subtilis, г/ дм³:

- меласса – 20,0 см³;

- MgSO₄·7 H₂O – 1,00;

- KH₂PO₄ – 0,4;

- NaCl – 0,5;

- CaCO₃ – 1,5;

- KNO₃ – 1,0.

Дистиллированная вода – до 1,0 дм³.

Продолжительность выращивания составляла (48 ± 1) часов в анаэробных условиях для лактобацилл и с принудительной аэрацией для Bacillus subtilis при температуре (37 ± 1) °C и (28 ± 1) °C соответственно.

Выход биомассы составлял:

для Lactobacillus plantarum – 2,6×10⁹ КОЕ/см³;

для Lactobacillus buchneri – 2,4×10⁹ КОЕ/см³;

для Bacillus subtilis – 2,1×10⁹ КОЕ/см³.

Полученные культуры тщательно перемешивались в аппарате-смесителе объемом 0,75 м³ в течение 20 минут при температуре (22 ± 2) °C. К полученной композиции добавляли торфогель в объеме 30,0 дм³, получая соотношение биологический компонент – торфогель – 1:1 по объему.

Торфогель с влажностью 82,94 % и показателем pH 6,29 ед. pH имел следующий компонентный состав:

- вода – 80,94 % - содержание общего органического вещества, в т.ч. гуматы и фульваты – 14,39 % - белок общий – 2,06 % - сера общая – 1,21% - фосфаты общие – 253,12 мг/кг - нитраты – 9,14 мг/кг - сульфаты – 2,46 мг/кг - кремний – 0,04 мг/кг - кальций – 0,03 мг/кг - калий – 83,41 мг/кг - зольность – 8,96 % - не гидролизуемая часть
(лигнины) – менее 1,50

Приготовленная готовая форма кормовой добавки должна соответствовать следующим показателям:

– внешний вид и цвет – жидкость от темно-коричневого до черного цвета;

– содержание жизнеспособных микробных клеток – не менее 9,0∙10⁸ КОЕ/см³;

– наличие посторонней микрофлоры – не допускается;

– водородный показатель – (6,5 ± 1,0) ед. pH

Пример 2. Определение антагонистической активности микроорганизмов с помощью двухслойной методики по Фредерику

Оценку антагонистической активности исследуемых штаммов микроорганизмов осуществляли in vitro с помощью двухслойной методики по Фредерику. Для этого при определении антагонистической активности лактобацилл на чашку с плотной питательной средой MRS-4 с помощью бактериологической петли наносили 0,01 см³ суточной бульонной культуры лактобактерий, выращенной на жидкой питательной среде MRS-1. Посевы инкубировали при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 часов. При определении антагонистической активности бацилл на чашку с плотной питательной средой МПА с помощью бактериологической петли наносили 0,01 см³ суточной бульонной культуры бацилл, выращенной на жидкой питательной среде МПБ. Посевы инкубировали при температуре (28 ± 1) °С в течение 24 часов.

Для лизиса клеток микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах в чашках Петри, на крышку перевернутой чашки помещали фильтровальную бумагу, наливали 1,0 см³ хлороформа и экспонировали в течение 30 минут. Затем чашку проветривали в течение 3-5 мин.

В качестве индикаторных культур для оценки антагонистической активности исследуемых штаммов лактобацилл использовали 71 штамм культур различных видов, находящихся в коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия.

Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых оценивали антагонистическую активность, в течение суток подращивали в МПБ, затем добавляли по 0,5 см³ культуры к 2,5 см³ расплавленного и охлажденного до температуры (56 ± 1) °С мясопептонного полужидкого агара, быстро перемешивали и выливали на поверхность чашек с колониями лактобактерий и бацилл. Наклоняя чашку из стороны в сторону, равномерно распределяли полужидкий агар по поверхности чашки Петри. Затем посевы инкубировали в течение 24 ч при температуре (37 ± 1) °С. Антагонистическая активность проявлялась образованием зон ингибирования роста тест-штаммов вокруг колоний лактобактерий и бацилл. Уровень антагонистической активности оценивали по следующим критериям: нулевая – при ширине зоны отсутствия роста до 1,0 мм, низкая – (1,1 ÷ 4,9) мм, средняя – (5,0 ÷ 8,9) мм, высокая – 9,0 мм и более.

Результаты определения антагонистической активности микроорганизмов представлены в таблице 1.

Пример 3. Определение уровня адгезивной активности штаммов лактобактерий на модели эпителиальных клеток

Забор материала для получения изолированных эпителиальных клеток производил ветеринарный врач. Материал забирали в стерильную пробирку с жидкой питательной средой №199 и помещали в контейнер со льдом для транспортировки.

В лабораторных условиях эпителиальные клетки дважды отмывали охлажденным забуференным физиологическим раствором (ЗФР) pH 7,2 ед. pH, центрифугировали при 800 об/мин по 10 мин. После определения концентрации взвеси клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом, разводили культуру клеток до концентрации (1,5 ÷ 2,0)×10⁶ КОЕ/см³.

Далее готовые суспензии штаммов лактобацилл с концентрациями, определенными в камере Горяева, не менее 2×10⁹ КОЕ/см³ в количестве 0,5 см³ смешивали с 0,5 см³ взвеси эпителиальных клеток.

Смесь эпителиальных клеток и лактобацилл инкубировали при температуре (37 ± 2) °С в течение 30 минут, периодически встряхивая. После этого смесь отмывали ЗФР три раза от не прикрепившихся микробов и центрифугировали при 600 об/мин по 10 мин.

Далее к осадку добавляли 1 или 2 капли ЗФР и готовили мазки на предметном стекле. Препараты фиксировали в жидкости Никифорова в течение 20 минут, подсушивали на воздухе и окрашивали по Романовскому-Гимзе. На фиксированный мазок наносили азур-эозин по Романовскому, разбавленный фосфатным буфером в соотношении 1:9. Через 40 мин мазок промывали фосфатным буфером, подсушивали на воздухе и микроскопировали.

Под световым микроскопом с объективом х40 подсчитывали среднее количество бактерий, прикрепившихся к эпителиальным клеткам (учитывали 25 эпителиоцитов в каждом препарате).

Подсчитывали средний показатель адгезии (СПА) – среднее количество микробных клеток, прикрепившихся к одной эпителиальной клетке.

Уровень адгезии бактерий условно дифференцировали на четыре степени:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1-5);

- среднеадгезивную (СПА = 5-10);

- высокоадгезивную (СПА выше 10).

Результаты определения адгезивной активности микроорганизмов представлены в таблице 2.

Пример 4. Оценка эффективности биологической кормовой добавки в опытах на пушных зверях.

Для проведения исследования использовались следующие виды животных: енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides), возраста 70 ÷ 80 суток в количестве 50 голов; лисица красная (Vulpes vulpes), возраста 70 ÷ 80 суток в количестве 50 голов; серебристый песец (Alopex lagopus), возраста 45 ÷ 50 суток в количестве 50 голов.

Группы пушных зверей формировали по методу аналогов. В опыт отбирали клинически здоровых особей, которые ранее в опытах не использовали. В период проведения исследований животным опытных и контрольных групп проводили плановые ветеринарные мероприятия. Исследования выполнены с соблюдением международных принципов Хельсинской Декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС).

Для оценки состояния животных определяли наличие аппетита, подвижность, ректальную температуру. Динамику прироста массы тела животных оценивали в течение всего периода наблюдения на основании взвешивания согласно методикам, принятым в зоотехнической практике звероводства, каждые 10 суток.

Животных содержали по 2 особи в клетках. В клетку помещали одного самца и одну самку. Перед началом внесения в рацион кормовой добавки каждое животное взвешивали и производили расчет необходимой дозы биопрепарата. После этого готовили его необходимую навеску, которую разводили дистиллированной водой в необходимом объеме.

Расчет необходимого количества препарата проводили с учетом исходной массы одной особи. На основании разработанной экспериментально нормы внесения кормовой добавки для поросят, сельскохозяйственной птицы составляет 0,3 мл/кг в сутки. При изменении массы тела зверей суточные дозы препарата увеличивали. Коррекцию суточной дозы осуществляли каждые 10 суток от момента исходного взвешивания животных. Препарат вносили в 50,0 г корма на одну особь, тщательно перемешивали и давали в период утреннего кормления. Предварительную оценку влияния кормовой добавки с целью выявления возможных негативных отклонений выполняли с использованием шести щенков каждого вида, за которыми устанавливали наблюдение в течение первых суток. В этот период у наблюдаемых животных не было выявлено снижения аппетита, двигательной активности, повышения ректальной температуры выше нормы, что послужило основанием для включения в рацион кормления изучаемого препарата для всех животных опытной группы. Результаты изучения влияния кормовой добавки «БИОТОРФОГЕЛЬ сухой» на сохранность молодняка пушных зверей представлены на фигуре, где 1 – образец енотовидной собаки, 2 – образец серебристого песца, 3 – образец красной лисицы. Полученные данные свидетельствуют о том, что сохранность особей всех опытных групп составляла 100 %. Аналогичный показатель был для особей контрольных групп енотовидной собаки и красной лисицы. В контроле серебристого песца сохранность составила 77 %.

Проведенные исследования показали, что при длительном ежедневном применении, начиная с возраста молодняка – 45 суток, в течение 80 дней с корректировкой дозы препарата каждые 10 дней наблюдается более быстрый рост и увеличение живой массы у молодняка опытной группы. Наиболее активно этот процесс происходит в возрасте 90 ÷ 120 дней, при этом разность по критерию увеличения живой массы в конечной точке – 135 суток достигает от 32 до 60 % для животных опытной группы по сравнению с контролем.

Оценка интенсивности роста и прироста молодняка пушных зверей показала увеличение этих показателей в группах опытных животных, получавших кормовую добавку. Это опосредованно позволяло предположить о возможных изменениях товароведческих показателей по размерам шкурок. Согласно ГОСТ 27766-88 шкурки были сняты с тушек «трубкой» с разрезом, проходящим от фаланг пальцев одной из задних лап до другой с сохранением меха головы, хвоста, лап. В дальнейшем шкурки были очищены от прирезей мяса, хрящей, костей из лап и хвоста; обезжирены без повреждения корней волос; очищены от грязи и крови; причесаны, оправлены на правилке; законсервированы пресно-сухим способом и вывернуты волосом наружу.

Товароведческую оценку качества шкур осуществляли согласно ГОСТ 27766-88 «Шкурки енотовидной собаки клеточного разведения невыделанные»; ГОСТ 2790-2019 «Шкурки лисицы клеточного разведения невыделанные»; ГОСТ 7907-78 (ГОСТ P57171-2016) «Шкурки песца голубого невыделанные».

Проведенные исследования показали, что внесение кормовой добавки в рацион пушных зверей оказывает опосредованное влияние на качество и размер полученных шкур пушно-мехового сырья, что в обобщенном виде подтверждается результатами, представленным в таблице 3.

Зачет по качеству готовой продукции – это интегральный показатель, учитывающий размер шкур и наличие порезов пушно-мехового сырья.

Показатели качества всех опытных групп достоверно выше, чем для контрольных.

Таблица 1 – Результаты определения антагонистической активности штаммов лактобацилл в отношении культур возбудителей инфекций

Вид индикаторных
культур Кол-во
штаммов Диаметр зон подавления роста индикаторной культуры штаммом … , мм L. buchneri
БХ-99 L. plantarum ПЛ-99 Смесь 2-х штаммов 1 2 3 5 6 Staphylococcus aureus, в т.ч. ЛУ 10 15-40 17-45 18-45 Staphylococcus aureus, NO 89 1 46 60 50 Staphylococcus aureus, NO 101 1 50 54 50 Staphylococcus sciuri NO 95 1 >60 >60 >60 Enterococcus faecium, в т.ч. ЛУ 7 25-60 25-60 25-60 Enterococcus faecalis, в т.ч. ЛУ 4 22-28 25-30 26-30 Enterococcus gallinarum, в т.ч. ЛУ 2 25-27 30-32 30-32 Enterococcus casseliflavus 1 30 28 30 Enterococcus casseliflavus 1 30 28 30 Listeria monocytogenes, в т.ч. ЛУ 10* >60 >60 >60 Klebsiella pneumonia NO 77 1* >60 50 54 Klebsiella pneumonia NO 94/1 1* >60 >60 >60 Acinetobacter baumannii NO 91 1* >60 >60 >60 Pseudomonas aeruginosa NO 128 1* >60 >60 >60 Enterobacter cloacae NO 110 1* 60 60 40 Enterobacter kobei NO 105 1* >60 >60 >60 Raoultella ornithinolytica NO 109 1* >60 >60 >60 Raoultella planticola NO 108 1 27 31 31 Aeromonas hidrophila NO 10 1 28 32 32 Leclercia adecarboxylata NO 112 1 27 30 30 Pluralibacter pyrinus NO 11 1 27 30 30 Stenothrophomonas maltophilia NO 3420 1 34 35 36 Shigella flexneri B 8116 1 26 30 30 Shigella sonney S form 1 25 30 30 Shigella dysenteriae Tuck 1362 1 40 30 40 Escherichia coli 14 20-27 22-32 25-32 Salmonella typhimurium 490/60 1 25 29 27 Salmonella choleraesuis 1 26 30 30 Salmonella infantis Новгород 1 1 28 30 30 Salmonella enteritidis 237 1 20 23 25 Salmonella gallinarum 95 1 25 24 25 Примечания:
1 – «*» – штаммы лактобацилл для определения антагонизма на этих индикаторных культурах выращивали на среде MRS-4 в течение 48 часов, остальные в течение 24 часов;
2 – погрешность измерений ±0,5 мм.

Таблица 2 – Результаты оценки адгезивной активности лактобацилл

Штамм микроорганизма СПА, М±m Степень адгезивности Lactobacillus plantarum ПЛ-99 37,2±4,2 высокая Lactobacillus buchneri БХ-99 30,4±5 высокая

Таблица 3 – Оценка пушно-мехового сырья по среднему размеру и зачетной стоимости готовой продукции

Животные, используемые для получения мехового изделия Группа животных Исследуемые показатели качества шкур Средний размер шкурки, дм², М±m Зачет по качеству готовой продукции, %, М±m Енотовидные собаки опытная 24,28±0,21 113,44±6,83 контрольная 23,51±0,14 98,88±4,13 Серебристый песец3 опытная 42,16±0,34 147,0±8,2 контрольная 37,5 ±0,3 114,7±5,73 Красная лисица «Огнива Вятская» опытная 26,45±0,35 126,2±5,4 контрольная 23,64±0,24 101,7±3,12

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой биологически активную кормовую добавку для пушных зверей, включающую композицию двух штаммов лактобацилл: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747, Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839 и штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ В-13389 в соотношении 1:1:1 по объему с конечной концентрацией не менее 2,0⋅10⁹ КОЕ/см³ и торфогеля в соотношении с микробным компонентом 1:1 по объему и конечной концентрацией микроорганизмов в биологически активной добавке не менее 9,0⋅10⁸ КОЕ/см³. Изобретение позволяет обеспечить профилактику кишечных токсикоинфекций бактериальной природы, нормализовать микробиоценоз желудочно-кишечного тракта, повысить качественные и количественные характеристики пушно-мехового сырья. 1 ил., 3 табл.

Биологически активная кормовая добавка для пушных зверей, включающая композицию штамма лактобациллы Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747, штамма лактобациллы Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839 и штамма Bacillus subtilis BS2017 ВКПМ В-13389 в соотношении 1:1:1 по объему с конечной концентрацией не менее 2,0×10⁹ КОЕ/см³ и торфогеля в соотношении с микробным компонентом 1:1 по объему и конечной концентрацией микроорганизмов 9,0×10⁸ КОЕ/см³.