Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05517 для защиты растений от фитопатогенных грибов Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и стимуляции роста растений Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности касается нового штамма ризосферных бактерий рода Bacillus в качестве действующего компонента для разработки микробного биопрепарата для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных грибов.

В настоящее время в сельском хозяйстве широко известны бактериальные препараты для растениеводства. Их роль и разнообразие на мировом рынке средств защиты и повышения продуктивности растений продолжают расти. Это обусловлено безопасностью микробных биопрепаратов для окружающей среды по сравнению с химическими средствами [1-5]. Однако штаммы, давно выделенные из природных условий, могут снижать свою эффективность при борьбе с фитопатогенами растений, поэтому важно постоянно пополнять коллекцию новыми эффективными штаммами для своевременной замены действующих компонентов и разработки новых биопрепаратов.

Известны штаммы Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D и Pseudomonas fluorescens ВКМ B-2955D, применяемые для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий, а также стимуляции роста растений [6,7].

Недостатком штаммов является то, что они не способны образовывать споры, а, следовательно, менее устойчивы при хранении и к воздействию неблагоприятных факторов, чем спорообразующие бактерии.

Известен штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11443, обладающий широким спектром фунгицидного действия против фитопатогенных грибов [8]. Данная бактерия является спорообразующей, но при этом для нее не установлена способность стимуляции роста растений.

В качестве прототипа был выбран штамм Bacillus subtilis В-10 ВИЗР [9], так как он входит в состав известного на отечественном рынке фунгицида «Алирин-Б», а также относится к группе Bacillus subtilis, как и заявленный штамм Bacillus pumilus RCAM05517. Задачей изобретения является получение нового штамма Bacillus pumilus, обладающего фунгицидной активностью по отношению к Phytophthora infestans, Alternaria sp, Aspergillus sp., Penicillium sp.и способностью стимулировать рост растений.

Задача решается выделением нового штамма Bacillus pumilus RCAM05517 из ризосферы рода Rumex и установлением заявленных свойств.

Технический эффект, получаемый от применения нового штамма, заключается в стимуляции роста и устойчивости растений к грибным инфекциям. Описание изобретения

1. Выделение нового штамма

Новый штамм Bacillus pumilus RCAM05517 был выделен из ризосферы p.Rumex в Алтайском крае, Алтайском районе, в окрестностях села Ая, осенью 2018 года. В 2022 году штамм был задепонирован в «Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM)» ФГБНУ «ВНИИСХМ», находящейся по адресу: 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3. Регистрационный номер -RCAM05517.

2. Видовая идентификация заявленного штамма

Видовая идентификация заявленного штамма осуществлялась с помощью метода мультисубстратного тестирования MicroPlate GENIII (BioLog). Согласно полученным результатам анализа, вероятность того, что исследуемый штамм относится к виду Bacillus pumilus составила 89,4%, а к Bacillus safensis - 10,5%. Следовательно, штамм RCAM05517 принадлежит виду Bacillus pumilus (фиг. 1).

3. Микробиологические свойства предлагаемого штамма

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus pumilus RCAM05517: колонии молочного цвета, с максимальным диаметром 0,3-0,6 см, матовые, ровной округлой формы, с кратерообразным профилем. Цвет колоний на окраине белее по сравнению с центром. При микроскопии клетки располагаются преимущественно одиночно, реже - парами.

Физиолого-биохимические свойства штамма Bacillus pumilus RCAM05517: спорообразующие грамположительные палочки с положительной реакцией на каталазу, ферментируют сахарозу, арабинозу, маннит и ксилозу. Не восстанавливают нитрат, не усваивают цитрат, реакция Фогеса-Проскауэра - отрицательная.

4. Среды и условия культивирования штамма

Предлагаемый штамм бактерий инкубируется на качалочных колбах в течение 18-24 ч при 30-37°С в шейкер-инкубаторе на L-жидкой питательной среде (%): дрожжевой экстракт -0,5, пептон - 1,5, NaCl - 0,5, вода дистиллированная - 1,0 л. Для приготовления агаризованной питательной среды необходимо добавить к перечисленным выше ингредиентам 1,5% агара.

В ферментационных установках штамм Bacillus pumilus RCAM05517 культивируется на мелассно-кукурузной среде, составом (г/л): меласса - 25, кукурузный экстракт - 12,5, дрожжевой экстракт - 1, триптон - 0,5, MgSO₄ - 0,25, MnSO₄ - 0,03, CoCl₂ - 0,046, СаСl₂ - 1, солевой сток - 10 мл (FeSO₄ - 0,1 г/100 мл, CuSCm - 0,1 г/100 мл). В качестве пеногасителя используется лапрол (мл/л) - 2.

Условия культивирования: водородный показатель (рН) - 6,8-7,7, количество оборотов двухуровневой мешалки в минуту - 250, время ведения ферментации - 24 ч, оптимальная температура роста культуры - 37°С, расход воздуха - до 500 л/ч, начало спорообразования - через 6-8 часов, с момента внесения культуры в аппарат, к 24 часам инкубирования культура полностью переходит в споры.

Во всех случаях культивирования фаза экспоненциального роста начинается, примерно, через 2 ч культивирования в биореакторе, соответственно, длительность лаг-фазы составляет около 1,5-2 часов.

5. Фунгицидная активность нового штамма

Фунгицидное действие заявленного штамма Bacillus pumilus RCAM05517 было зафиксировано по отношению к следующим фитопатогенным грибам: Phytophthora infestans, Alternaria sp, Aspergillus sp., Penicillium sp.

6. Ростостимулирующее действие предлагаемого штамма Заявленный штамм стимулирует рост корней Кресс-салата. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение антагонистической активности штамма Bacillus pumilus RCAM05517 по отношению к фитопатогенным грибам

Фунгицидное действие штаммов Bacillus pumilus RCAM05517 и Bacillus subtilis В-10 ВИЗР по отношению к фитопатогенным грибам устанавливали методом агаровых блоков. В качестве тест-культур использовали штаммы Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.

Штаммы-антагонисты газоном засевали в опытные чашки Петри с питательным агаром (для фитофторы) или средой YEP (для других грибов). В центр чашки устанавливали блок с плесенью диаметром 5-7 мм. Контрольные варианты содержали только блоки фитопатогенов. Культуры культивировали при 20-25°С в течение 2-х недель, периодически оценивая взаимодействие микроорганизмов. О наличии фунгицидной активности свидетельствует более слабое развитие мицелия грибов в опытных чашках по сравнению с контролем.

В соответствии с данными, представленными в таблице 1, как штамм прототип, так и предлагаемый штамм Bacillus pumilus RCAM05517 ингибируют рост всех исследуемых тест-культур. В ходе эксперимента отмечается динамика по увеличению диаметра фитопатогенов в контрольных чашках.

К окончанию исследования был установлен абсолютный антагонистический эффект как для штамма прототипа, так и для заявленного по отношению к Phytophthora infestans. Микромицет погиб даже на установленном блоке. Предлагаемый штамм Bacillus pumilus RCAM05517 эффективнее прототипа подавляет рост фитопатогенных грибов, на протяжении всего эксперимента сокращая занимаемый ими диаметр в чашках Петри. Штамм Bacillus pumilus RCAM05517 по сравнению со штаммом Bacillus subtilis В-10 ВИЗР к 10 суткам опыта сильнее угнетает рост Alternaria sp. на 5,00 мм, Aspergillus sp. на 2,50 мм и Penicillium sp. на 5,33 мм.

Пример 2. Установление фитостимулирующего действия у штамма Bacillus pumilus RCAM05517

Ростостимулирующее действие штаммов Bacillus pumilus RCAM05517 и Bacillus subtilis В-10 ВИЗР на семена Кресс-салата устанавливали методом влажных камер. Для этого семена в опытных пробах обрабатывали культуральными жидкостями суточных культур бацилл в количестве 100 мкл на 10 г семян. Контрольные семена не обрабатывали ничем. Повторность опыта - 4-кратная, в каждой чашке Петри было по 20 семян. Результаты по стимуляции роста корней снимали через 5 суток.

Как видно из таблицы 2, оба штамма обладают фитостимулирующим эффектом на семена Кресс-салата. Однако заявленный штамм Bacillus pumilus RCAM05517 дает прибавку в длине корня к контролю в 2 раза больше, чем прототип Bacillus subtilis В-10 ВИЗР.

Всхожесть семян во всех вариантах составила более 95%. Ни в опытных, ни в контрольных чашках не было отмечено инфицированных семян, поэтому в данном эксперименте не представляется возможным сравнить фунгицидный эффект штаммов на возбудителей грибных болезней Кресс-салата. Литература

1. Azizbekyan R. R. Biological Preparations for the Protection of Agricultural Plants (Review) // Applied Biochemistry and Microbiology, 2019. - Vol.55 (8). - P. 816-823. doi: 10.1134/s0003683819080027.

2. Pylak M., Oszust K., Frac, M. Review report on the role of bioproducts, biopreparations, biostimulants and microbial inoculants in organic production of fruit // Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 2019. - Vol.18. - P. 597-616. doi: 10.1007/s11157-019-09500-5

3. Зыков С.А. Биопрепараты в современном земледелии // Агрофорум, 2019. - №3. - С. 21-27.

4. Vishwakarma К., Kumar N., Shandilya С, Mohapatra S., Bhayana S., Varma A.. Revisiting Plant-Microbe Interactions and Microbial Consortia Application for Enhancing Sustainable Agriculture: A Review // Frontiers in Microbiology, 2020. - Vol. 11. - Ar. 560406. doi: 10.3389/fmicb.2020.560406

5. Pylak M., Oszust K., Frac M. Optimization of Growing Medium and Preservation Methods for Plant Beneficial Bacteria, and Formulating a Microbial Biopreparation for Raspberry Naturalization // Agronomy, 2021. - Vol.11. - Ar. 2521. doi: 10.3390/agronomyl 1122521

6. Анохина Т.О., Сиунова Т. В., Сизова О. И., Кочетков В. В., Воронин А. М. Пат.2588473, МПК51 С 12 N 1/20. Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий и стимуляции роста растений, 2016.

7. Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Кочетков В. В., Воронин А. М. Пат. 2646160, МПК51 С 12 N 1/20. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий и стимуляции роста растений, 2018.

8. Кузнецова Н.И., Азизбекян Р.Р., Кузин А. П., Николаенко М. А., Сунь Ч., Лю Ц., Сюн Р., Цзо Ц. Пат. 2701500, МПК 51 С 12 N 1/20. Штамм спорообразующих бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным действием против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания овощных растений, биологический препарат на его основе, 2019.

9. Корнева О.Г., Полякова Е.В., Киселева Г.Н., Соколов А.С. Эффективность применения биопрепаратов для защиты картофеля от болезней в условиях дельты волги // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета, 2019. - №2. - С. 69-72.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Bacillus pumilus, обладающий фунгицидной активностью по отношению к Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) под регистрационным номером RCAM05517. Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05517 может быть использован в составе бактериальных биопрепаратов для защиты растений от болезней и стимулирования их роста. 1 ил., 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05517, выделенный из ризосферы рода Rumex, обладающий фунгицидной активностью по отношению к фитопатогенным грибам Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и фитостимулирующим эффектом.