Малоинвазивный способ диагностики неалкогольной жировой болезни печени на основе идентификации микроРНК и MIP-1β в плазме крови Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 G01N33/68 G01N33/543 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и позволяет диагностировать неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) у больных ожирением с сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа) и без него.

НАЖБП является лидирующим заболеванием в гепатологии [1] и характеризуется избыточным накоплением липидов в гепатоцитах (5-10% от общей массы). К характерным морфологическим изменениям печени при НАЖБП относятся: стеатоз, стеатогепатит, фиброз, цирроз или аденокарцинома. Известно, что больные ожирением и СД 2 типа более всего подвержены развитию НАЖБП; встречаемость этого заболевания у данной категории больных доходит до 93% [2]. Основной теорией формирования НАЖБП при ожирении является поступление большого количества провоспалительных цитокинов из жировой ткани в систему портальной вены печени, что приводит к образованию активных форм кислорода и, как следствие, локальному воспалению в печеночной ткани [3]. Диагностика НАЖБП включает широкий спектр методов исследования: физикальное обследование врачом, биохимический анализ крови, УЗИ печени, компьютерная томография и магнитно-резонансная томография [2]. Однако данные методы неспецифичны для диагностики НАЖБП. Несмотря на высокую и растущую распространенность заболевания [4], золотым стандартом диагностики НАЖБП остается гистологический анализ печени [2]. В качестве диагностического инструмента биопсия печени непрактична и дорогостоящая. Таким образом, потребность в высокочувствительном, специфическом и малоинвазивном методе диагностики НАЖБП очевидна.

Воспалительные белки, продуцируемые макрофагами (макрофагальные воспалительные белки - MIP), в частности МГР-1α (CCL3) и MIP-1β (CCL4), являются провоспалительными факторами и вносят вклад в формирование иммунного ответа на агенты инфекционной и неинфекционной природы. При воспалении, МПМа и MIP-1β способствуют продукции активированными макрофагами и фибробластами других провоспалительных цитокинов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6 [5]. MIP-1β является хемоаттрактантом для иммунорегуляторных клеток, таких как моноциты/макрофаги, Т-клетки, NK- и дендритные клетки [6,7]. MIP-1β продуцируется также моноцитами, Т- и В-клетками, нейтрофилами, фибробластами и эндотелиальными/эпителиальными клетками [8,9]. Продукция MIP-1β нейтрофилами способствует воспалению за счет рекрутирования других лейкоцитов в месте воспаления, что может привести к хронизации воспалительного процесса. Так, высокий уровень MIP-1β в сыворотке крови мышей коррелировал с воспалением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров [10]. Помимо метаболических заболеваний, CCL4 участвует в патогенезе системной красной волчанки [11], рассеянного склероза [12], множественной миеломы [13], псориаза [14], муковисцидоза [15] и саркоидоза [16].

Одной из важных диагностических, а также терапевтических мишеней при НАЖБП являются малые некодирующие РНК (нкРНК), включая микроРНК. МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие молекулы длиной 21-23 нуклеотидов, участвующие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов [17]. В последнее время микроРНК все чаще используются в качестве диагностических молекул, особенно при опухолевых заболеваниях. Важным преимуществом микроРНК является их стабильность в сыворотке и плазме крови [18], а также высокая специфичность для ряда патологических процессов. Так, по результатам скрининговых исследований было выявлено, что miR-15b, miR-21, miR-23a, miR-26a, miR-155, miR-200c, miR-222, miR-224, miR-374a, miR-423, let-7a и let-7c имеют высокий потенциал в качестве диагностических молекул НАЖБП у больных ожирением [17].

Патентная ситуация оценена посредством поиска по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг., по направлению: Способ диагностики неалкогольной жировой болезни печени. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

Схожим изобретением является «Способ дифференциальной диагностики стеатоза печени и неалкогольного стеатогепатита у мужчин» (RU 2 753 455 С1, 16.08.2021 г.). В данной разработке диагностической молекулой стеатоза печени является 3-гидроксимасляная кислота, а стеатогепатита - 3-метил-2-оксовалериановая кислота, которые определяли в сыворотке крови. Несмотря на высокие показатели чувствительности и специфичности данного способа, у него есть свои недостатки. Во-первых, данная разработка исследована только у мужчин. Во-вторых, определение 3-гидроксимасляной и 3-метил-2-оксовалериановой кислот проводили с помощью газового хромато-масс-спектрометра GCMSQP2010 Plus (Shimadzu Corporation, Япония), который чаще всего используется в судебной медицине, нежели в поликлиниках и больницах.

Существует принципиально подобный предыдущей разработке «Способ дифференциальной диагностики стеатоза и неалкогольного стеатогепатита у женщин» (RU 2744021 С1, 02.03.2021 г.), который отличается исследуемыми аналитами (молочная и оксаниловая кислоты) с аналогичными преимуществами и недостатками.

Технология диагностики фиброза при НАЖБП представлена в «Способ диагностики фиброза печени у больных неалкогольной жировой болезнью печени с сахарным диабетом 2 типа» (RU 2732526 С1, 18.09.2020 г.) основанная на определении уровней гаптоглобина, альфа2-макроглобулина и гамма-глютаминтранспептидазы в крови. Однако в данной разработке отсутствуют данные о чувствительности и специфичности методики.

Наиболее близким по своим признакам является «Способ диагностики неалкогольного стеатоза печени» (RU 2755974 С1, 23.09.2021 г.), основанный на определении индекса массы тела, сывороточных концентраций гамма-глутамилтранспептидазы, васкулоэндотелиального фактора роста и интерлейкина-6 (ИЛ-6). Недостатками данного способа являются:

1) диагностика наличия стеатоза печени по данным УЗИ органа, что не отображает картину морфологических изменений ткани органа при НАЖБП;

2) гамма-глутамилтранспептидаза, васкулоэндотелиальный фактор роста и ИЛ-6 являются неспецифическими показателями поражения ткани печени.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является малоинвазивное подтверждение диагноза НАЖБП у больных ожирением с СД 2 типа и без него методами ПЦР в реальном времени и иммуноферментным анализом (ИФА).

Технический результат использования изобретения - возможность диагностики НАЖБП у больных ожирением с СД 2 типа и без него лабораторными методами без проведения биопсии печени для гистологического анализа ткани.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе диагностики НАЖБП проводят анализ уровней экспрессии двух микроРНК (miR-423-5p и let-7a-5p) методом ПЦР в реальном времени и концентрации MIP-1β методом ИФА в плазме крови у больных ожирением с СД 2 типа и без него для подсчета коэффициента НАЖБП, что, согласно изобретению, позволит определить наличие/отсутствие патологических процессов в печени, характерных для НАЖБП.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что на сегодняшний день анализ уровня экспрессии микроРНК является перспективным и высокоспецифическим способом диагностики различных патологических процессов, в частности НАЖБП. В практике частных и государственных клиник РФ способов подтверждения наличия/отсутствия НАЖБП на основе идентификации микроРНК на сегодняшний день не существует.В нашей разработке, помимо специфических микроРНК (miR-423-5p и let-7а-5р), необходимо определять концентрацию провоспалительного маркера MIP-1β в плазме крови, повышая чувствительность и специфичность метода, что позволит избежать проведения дорогостоящей и инвазивной процедуры биопсии ткани печени в условиях стационара, а также сократит время постановки диагноза.

Детекция микроРНК может быть осуществлена методом ПЦР в режиме реального времени, а измерение концентрации провоспалительного цитокина - методом ИФА.

Способ осуществляется следующим образом: 1) Анализ уровней экспрессии miR-423-5p и let-7a-5p.

Выделить суммарную РНК из плазмы крови, используя технологию магнитных частиц MagMAX (Thermo Fisher Scientific, США) и магнитную подставку. Процесс выделения произвести в соответствии с протоколом производителя. Выделенные образцы суммарной РНК можно хранить -80°С длительное время. Перед проведением обратной транскрипции необходимо поставить ПЦР NTC (no-template controls) - ПЦР для оценки фонового сигнала и наличия загрязнения выделенной суммарной РНК. Далее провести реакцию обратной транскрипции с помощью набора MicroRNA Reverse Transcription Kit (TermoFischer, США) по программе амплификации: 30 мин 16°С, 30 мин 42°С, 5 мин 85°С. анная технология позволяет получить специфическую зрелую микроРНК, за счет шпилечного праймера для обратной транкрипции. В результате реакции, праймер удлиняет 3'-конец молекулы-мишени и формирует продукт (праймер + зрелая микроРНК). Затем полученную матрицу использовать для проведения стандартной ПЦР в реальном времени с использованием технологии TagMan Universal Master Mix II, no UNG (TermoFischer, США). Общий объем на 1 реакцию 20 мкл. Протокол для амплификации: 95°С 10 мин, 95°С 15 сек, 60°С 1 мин. Для нормализации полученных данных рекомендуется использовать эндогенные контроли (SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-6p).

Уровень экспрессии рассчитывается по формуле Пфаффла. Единица измерения уровня экспрессии - условные единицы.

2) Определение концентрации MIP-1β.

Концентрацию MIP-1β в плазме крови исследуют методом проточной флуориметрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex 200 Systems, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-Plex). Единица измерения MIP-1β - пг/мл. Данный способ рекомендуется заменить методом ИФА с использованием коммерческих наборов.

Оборудование:

1) амплификатор CFX96 («BioRad», США) со стандартным программным обеспечением, магнитный планшет, дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Sartorius», Гермаия или аналог); микропробирки типа эппендорф на 0,2 и 1,5 мл. Реактивы: Набор для выделения суммарной РНК MagMAX (Thermo Fisher Scientific, США); набор для обратной транскрипции MicroRNA Reverse Transcription Kit (TermoFischer, США); набор для ПЦР в реальном времени qPCR TagMan Universal Master Mix II, no UNG (TermoFischer, США). Реактивы хранят при температуре -20°С.

2) двухлучевой лазерный автоматизированный анализатор (Bio-Plex 200 Systems, Bio-Rad, США), автоматическая промывочная станция, дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Sartorius», Гермаия или аналог); микропробирки типа эппендорф на 0,2 и 1,5 мл. Реактивы: коммерческая тест-система Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-Plex. Реактивы хранят при температуре+4°С.

Далее, полученные данные подставляют в формулу для расчета коэффициента НАЖБП, которая выглядит следующим образом:

Коэффициент НАЖБП=38,58+(-0,7479) *MIP-lp+0,04969*miR-423-5p+(-2,082*let-7a-5р),

где 38,58 - константа, рассчитанная множественной регрессией; -0,7479, 0,04969, -2,082 -коэффициенты, рассчитанные множественной регрессией.

При расчетах множественной регрессии зависимым показателем явилось наличие НАЖБП при гистологическом анализе ткани органа (печени). Таким образом, при значении коэффициента НАЖБП равном 6,8 и более - диагностируют наличие НАЖБП, при значении коэффициента менее 6,8 - отсутствие НАЖБП.

Материалом для исследования микроРНК в плазме крови служила периферическая венозная кровь, полученная от 8 пациентов (с ожирением и СД 2 типа с гистологическим подтверждением диагноза НАЖБП (средний возраст 40,4±11,5 лет, ИМТ 44,2±4,7, 3 мужчин и 5 женщин). В контрольную группу были включены 4 условно здоровых донора (средний возраст 32,67±11,7 лет, ИМТ 21,9±0,7, 2 мужчины и 2 женщины). Для анализа концентрации MIP-1β в плазме крови было исследовано 37 больных с ожирением и СД 2 типа и без него (средний возраст 44,2±8,4 лет, ИМТ 46±8,9, 14 мужчин и 23 женщины) и 7 условно здоровых донора (средний возраст 32,67±11,7 лет, ИМТ 21,9±0,7, 2 мужчины и 5 женщин).

Диагноз ожирения, ассоциированного с верифицированным диагнозом СД 2 типа, был поставлен в условиях стационара. Диагноз НАЖБП подтверждался с помощью гистологического исследования биоптатов печени.

За критерии включения принят возраст 18-65 лет; поставленный в условиях стационара диагноз ожирения, который ассоциирован с верифицированным диагнозом СД 2 типа; поставленный в условиях стационара диагноз НАЖБП (подтвержденный гистологически); наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании и использование биологического материала в целях исследования.

Статистическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью программы GraphPad Prism 9.0. Коэффициенты корреляций между значениями концентрации MIP-1β и уровнями экспрессии miR-423-5p и let-7a-5p были равны 0,94.

Диагностическая чувствительность предлагаемого способа определения наличия/отсутствия НАЖБП у больных ожирением с СД 2 типа и без него составила 73,9%, диагностическая специфичность - 95,9%.

Примеры практического выполнения предложенного способа.

Пример 1.

Больной N, женщина, 29 лет, ИМТ равен 47,5 кг/м², что соответствует 3 степени ожирения. В анамнезе верифицированные диагнозы ожирения и СД 2 типа. Жалобы на боли в правом подреберье и слабость, отвергает употребление алкогольных напитков. Данные биохимического анализа крови в норме: АЛТ - 27,1 е/л; ACT - 7,7 е/л; щелочная фосфатаза - 55,5 е/л; ГГТ - 5,28 е/л; общий белок - 54,4 г/л.

Применение предложенного способа: значения уровня экспрессии miR-423-5p -6,72 усл.ед.; let-7a-5p - 5,97 усл.ед.; концентрация MIP-1β в плазме равна 5,98 пг/мл.

Коэффициент НАЖБП=38,58+(-0,7479)*5,98+0,04969*6,72+(-2,082*5,97)=22,02.

Вычисленный коэффициент НАЖБП, равный 22,02 (значение коэффициента НАЖБП более 6,8), свидетельствует о наличии НАЖБП у больного N. Данное утверждение подтверждено гистологическим анализом ткани печени, где обнаружен стеатоз гепатоцитов с признаками воспалительного процесса в органе.

Пример 2.

Больной X, мужчина, 46 лет, ИМТ равен 22 кг/м², что соответствует норме, в больнице по показаниям на плановую лапароскопическую операцию (двухсторонняя паховая грыжа). Данные биохимического анализа крови в норме: АЛТ - 21 е/л; ACT - 20,4 е/л; щелочная фосфатаза - 218 е/л; ГГТ - 16 е/л; общий белок - 85,8 г/л.

Применение предложенного способа: значения уровня экспрессии miR-423-5p-0.07 усл.ед.; let-7a-5p-0,06 усл.ед.; концентрация MIP-1J3 равна 43,97 пг/мл. Коэффициент НАЖБП=38,58+(-0,7479)*43,97+0,04969*0,07+(-2,082*0,06)=5,58

Коэффициент НАЖБП равный 5,58 составил менее 6,8; следовательно, у больного X отсутствует НАЖБП. Данное утверждение подтверждено гистологическим анализом ткани печени.

Таким образом, способ прост в осуществлении, в его основе лежит анализ ПЦР в реальном времени и ИФА с последующим расчетом коэффициента НАЖБП, что позволяет диагностировать наличие/отсутствие НАЖБП у больных ожирением с СД 2 типа и без него.

Список использованной литературы:

1. Brunt, Е.М.; Kleiner, D.E.; Carpenter, D.H.; Rinella, M.; Harrison, S.A.; Loomba, R.; Younossi, Z.; Neuschwander-Tetri, B.A.; Sanyal, A.J. NAFLD: Reporting Histologic Findings in Clinical Practice. Hepatology 2021, 73, 2028-2038, doi:10.1002/hep.31599.

2. Лазебник, Л.Б.; Голованова, E.B.; Туркина, С.В.; Райхельсон, К.Л.; Оковитый, С.В.; Драпкина, О.М.; Маев, И.В.; Мартынов, А.И.; Ройтберг, Г.Е.; Хлынова, О.В.; et al. Неалкогольная жировая болезнь печени у взрослых: клиника, диагностика, лечение. Рекомендации для терапевтов, третья версия. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2021,1, 4-52, doi:10.31146/1682-8658-ecg-185-1-4-52.

3. Polyzos, S.A.; Kountouras, J.; Mantzoros, CS. Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease: From Pathophysiology to Therapeutics. Metabolism 2019, 92, 82-97, doi:10.1016/j.metabol.2018.11.014.

4. Obesity and Overweight Available online: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (accessed on 23 August 2021).

5. Sindhu, S.; Kochumon, S.; Shenouda, S.; Wilson, A.; A1-Mulla, F.; Ahmad, R. The Cooperative Induction of CCL4 in Human Monocytic Cells by TNF-α and Palmitate Requires MyD88 and Involves MAPK/NF-KB Signaling Pathways. IntJMolSci 2019, 20, 4658, doi:10.3390/ijms20184658.

6. Ren, M.; Guo, Q.; Guo, L.; Lenz, M.; Qian, F.; Koenen, R.R.; Xu, H.; Schilling, А.В.; Weber, C; Ye, R.D.; et al. Polymerization of MIP-1 Chemokine (CCL3 and CCL4) and Clearance of MIP-1 by Insulin-Degrading Enzyme. EMBO J 2010, 29, 3952-3966, doi: 10.103 8/emboj.2010.256.

7. Bystry, R.S.; Aluvihare, V.; Welch, K.A.; Kallikourdis, M.; Betz, A.G. В Cells and Professional APCs Recruit Regulatory T Cells via CCL4. Nat Immunol 2001, 2, 1126-1132, doi:10.1038/ni735.

8. Maurer, M.; von Stebut, E. Macrophage Inflammatory Protein-1. Int J Biochem Cell Biol 2004, 36, 1882-1886, doi: 10.1016/j.biocel.2003.10.019.

9. Morrison, M.D.; Lundquist, P.G. Labyrinthine Morphology and Temperature in Cryosurgery (Guinea Pig). Acta Otolaryngol 1974, 77, 261-273, doi:10.3109/00016487409124624.

10. Mathews, J.A.; Wurmbrand, A.P.; Ribeiro, L.; Neto, F.L.; Shore, S.A. Induction of IL-17A Precedes Development of Airway Hyperresponsiveness during Diet-Induced Obesity and Correlates with Complement Factor D. Front Immunol 2014, 5, 440, doi:10.3389/fimmu.2014.00440.

11. Vila, L.M.; Molina, M.J.; Mayor, A.M.; Cruz, J.J.; Rios-Olivares, E.; Rlos, Z. Association of Serum MIP-1 alpha, MIP-1 beta, and RANTES with Clinical Manifestations, Disease Activity, and Damage Accrual in Systemic Lupus Erythematosus. Clin Rheumatol 2007, 26, 718-722, doi: 10.1007/sl0067-006-0387-y.

12. Szczucifiski, A.; Losy, J. Chemokines and Chemokine Receptors in Multiple Sclerosis. Potential Targets for New Therapies. Acta Neurol Scand 2007,115, 137-146, doi: 10.111 l/j.l600-0404.2006.00749.x.

13. Abe, M.; Hiura, K.; Wilde, J.; Moriyama, K.; Hashimoto, Т.; Ozaki, S.; Wakatsuki, S.; Kosaka, M.; Kido, S.; Inoue, D.; et al. Role for Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1 alpha and MIP-1 beta in the Development of Osteolytic Lesions in Multiple Myeloma. Blood 2002,100, 2195-2202.

14. Pedrosa, E.; Carretero-Iglesia, L.; Boada, A.; Colobran, R.; Faner, R.; Pujol-Autonell, I.; Palou, E.; Esteve, A.; Pujol-Borrell, R.; Ferrandiz, C; et al. CCL4L Polymorphisms and CCL4/CCL4L Serum Levels Are Associated with Psoriasis Severity. J Invest Dermatol 2011,131, 1830-1837, doi:10.1038/jid.2011.127.

15. Mrugacz, M. CCL4/MIP-lbeta Levels in Tear Fluid and Serum of Patients with Cystic Fibrosis. J Interferon Cytokine Res 2010, 30, 509-512, doi:10.1089/jir.2009.0102.

16. Barczyk, A.; Pierzchala, E.; Caramori, G.; Sozanska, E. Increased Expression of CCL4/MIP-1(3 in CD8+Cells and CD4+Cells in Sarcoidosis. Int JImmunopathol Pharmacol 2014, 27, 185-193, doi: 10.1177/039463201402700205.

17. Vulf, M.; Shunkina, D.; Komar, A.; Bograya, M.; Zatolokin, P.; Kirienkova, E.; Gazatova, N.; Kozlov, I.; Litvinova, L. Analysis of MiRNAs Profiles in Serum of Patients With Steatosis and Steatohepatitis. Front Cell Dev Biol 2021, 9,1Ъвв11, doi:10.3389/fcell.2021.736677.

18. Muth, D.C.; Powell, B.H.; Zhao, Z.; Witwer, K.W. MiRNAs in Platelet-Poor Blood Plasma and Purified RNA Are Highly Stable: A Confirmatory Study. BMC Research Notes 2018, 11, 273, doi:10.1186/sl3104-018-3378-6.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) у больных ожирением. Проводят анализ уровней экспрессии микроРНК miR-423-5p и let-7a-5p методом ПЦР в реальном времени и концентрации MIP-1β методом иммуноферментного анализа в плазме крови больных ожирением. Для подсчета коэффициента НАЖБП полученные данные подставляют в расчетную формулу. При значении коэффициента НАЖБП, равном 6,8 и более, диагностируют наличие НАЖБП у больных ожирением, при значении коэффициента менее 6,8 диагностируют отсутствие НАЖБП. Способ обеспечивает возможность малоинвазивной диагностики НАЖБП у больных ожирением за счет использования формулы расчета коэффициента НАЖБП на основе значений уровней экспрессии miR-423-5p и let-7a-5p и концентрации MIP-1β в плазме крови. 2 пр.

Малоинвазивный способ диагностики неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) на основе идентификации микроРНК и MIP-1β в плазме крови у больных ожирением, при котором проводят анализ уровней экспрессии микроРНК miR-423-5p и let-7a-5p методом ПЦР в реальном времени и концентрации MIP-1β методом иммуноферментного анализа в плазме крови у больных ожирением; для подсчета коэффициента НАЖБП полученные данные подставляют в формулу для расчета коэффициента НАЖБП: коэффициент НАЖБП=38,58+(-0,7479)*MIP-1β+0,04969*miR-423-5p+(-2,082*let-7a-5p), где 38,58 - константа, рассчитанная множественной регрессией; -0,7479, 0,04969, -2,082 - коэффициенты, рассчитанные множественной регрессией; при значении коэффициента НАЖБП равном 6,8 и более - диагностируют наличие НАЖБП, при значении коэффициента менее 6,8 диагностируют отсутствие НАЖБП у больных ожирением.