СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БОЛЕЗНИ БЛАУНТА НА КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 C12N15/113 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биотехнологии - создание экспериментальной модели болезни Блаунта путем ингибирования экспрессии РАХ3 гена липофильной интерферирующей siРНК в склеротоме куриного эмбриона.

Болезнь Блаунта является одной из наиболее сложных патологий опорно-двигательного аппарата у детей и подростков. Заболевание характеризуется нарушением роста проксимального медиального отдела большеберцовой кости и эпифиза, приводящим к трехмерной деформации нижней конечности. Патология представлена прогрессирующей варусной (О-образной) деформацией области коленных суставов (М. Janoyer. Blount disease. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research Volume 105, Issue 1, Supplement, February 2019, Pages S111-S121. https://doi.org/10.1016/j.otsr.2018.01.009). Болезнь Блаунта это не просто косметический дефект, а значительная ортопедическая проблема, приводящая к нарушению опоры и осанки у ребенка и являющаяся причиной потери трудоспособности во взрослом возрасте. При отсутствии лечения деформация прогрессирует, нарушается нормальное взаимоотношение компонентов коленного сустава и развиваются ранние дегенеративно-дистрофические изменения (J.G Birch. Blount disease. Review. J Am Acad Orthop Surg. 2013. Jul; 21 (7): 408-18.). Пациенты с болезнью Блаунта нуждаются в хирургической коррекции с последующей длительной реабилитацией, нередки случаи рецидивов деформации. Этиологический фактор болезни Блаунта неизвестен (М. Janoyer. Blount disease. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research Volume 105, Issue 1, Supplement, February 2019, Pages S111-S121. https://doi.Org/10.1016/j.otsr.2018.01.009).

Значительным препятствием для понимания причин и механизмов болезни Блаунта является отсутствие экспериментальной модели, позволяющей изучить генетические и биологические механизмы формирования патологии. Создание экспериментальной модели болезни Блаунта с целью определения этиологического фактора патологии является настоятельной необходимостью.

В научной литературе экспериментальная модель болезни Блаунта не представлена.

Наиболее близким к предлагаемому способу моделирования болезни Блаунта на курином эмбрионе является способ моделирования заболевания, основанный на депонировании клеток нервного гребня в формирующемся склеротоме путем ингибирования экспрессии РАХ3 гена липофильной siРНК (Патент №2728927 «Способ моделирования сколиоза на курином эмбрионе», регистрация от 03 августа 2020, Зайдман A.M., Пахомова Н.Ю., Строкова Е.Л., Черноловская Е.Л., Мелешко Е.М., Шило А.Р.). Основанием для моделирования сколиоза явилась предложенная A.M. Зайдман гипотеза о роли клеток нервного гребня в индуцировании сколиоза: причиной идиопатического сколиоза является депонирование клеток нервного гребня в формирующемся позвоночнике эмбриона (A.M. Zaydman, Elena L. Strokova, Elena V. Kiseleva, Lubov A. Suldina, Anton A. Strunov, Alexander I. Shevchenko, Pavel P. Laktionov, Vladimir M. Subbotin. A New Look at Etiological Factors of Idiopathic Scoliosis: Neural Crest Cells. International Journal of Medical Sciences. 2018; 15(5):436-446. doi:10.7150/ijms.22894.). В способе моделирования идиопатического сколиоза на курином эмбрионе поставленная задача решается тем, что индуцирование развития сколиоза осуществляют путем введения в нервную трубку куриного эмбриона на 11 стадии развития по классификации Гамбургер-Гамильтон siРНК к гену РАХ3 в объеме, обеспечивающем полное заполнение нервной трубки.

Способ моделирования болезни Блаунта предполагает формирование варусной (О-образной) деформации области коленных суставов у экспериментальных животных (куры) с возможностью анализа генетического субстрата. Двуногие животные являются наиболее подходящим объектом для моделирования болезни у человека. Двуногие модели, в частности модели на курах, более точно имитируют человеческую позу и подвержены силам гравитации, подобным для человека.

Задача (технический результат предлагаемого изобретения) заключается в создании модели болезни Блаунта.

Поставленная задача решается тем, что в способе моделирования болезни Блаунта на курином эмбрионе, индуцирование развития болезни осуществляют путем введения в нервную трубку куриного эмбриона в 53 часа эмбриогенеза липофильной siРНК к гену РАХ3 в объеме, обеспечивающем полное заполнение нервной трубки.

Стадии эмбрионального развития цыпленка хорошо известны (R. Bellairs, Μ. Osmond. The atlas of chick development. Department of Cell and Developmental Biology, University College London, UK. Elsevier. 2014; Л.И. Сидоренко, В.И. Щербатов. Биология кур: учеб. Пособие. Краснодар. 2016). Известно, что на 16 стадии эмбрионального развития цыпленка по классификации Гамбургер-Гамильтон клетки нервного гребня проходят через сомиты, из которых в дальнейшем формируются зачатки нижних конечностей, являющиеся основой для развития малоберцовой и болыпеберцовой костей и коленной чашки. 16 стадия развития цыпленка по классификации Гамбургер-Гамильтон соответствует 51-56 часам эмбриогенеза. Нами экспериментально установлено, что ингибирование РАХ3 гена в 53 часа эмбриогенеза приводит к «оседанию» мигрирующих клеток в зачатках нижних конечностей и формированию болезни Блаунта у экспериментальных животных.

Нервный гребень - это совокупность клеток, выделяющихся из дорзальных отделов нервного желобка во время его смыкания в нервную трубку на ранних стадиях эмбрионального развития. Клетки нервного гребня образуются практически на всем протяжении замыкающейся нервной трубки -от области промежуточного мозга до сакральных отделов ниже уровня 28-го сомита. После эмиграции из нейроэпителия нервной трубки клетки нервного гребня начинают активно мигрировать в организме развивающегося зародыша и дают начало разнообразным зрелым тканям. Начало миграции клеток нервного гребня связано с эпителио-мезенхимальной трансформацией клеток, когда они выделяются из пласта нейроэпителия замыкающейся нервной трубки и приобретают внешние признаки мезенхимных клеток. Клетки, выделяющиеся из разных отделов нервной трубки, участвуют в образовании различных структур и в связи с этим различают несколько отделов по длине зародыша. В туловищном отделе (8-28 пар сомитов) из клеток нервного гребня образуются чувствительные спинномозговые ганглии и симпатические пара- и превертебральные ганглии, мозговое вещество надпочечников, меланоциты кожи (Н.С. Etchevers, Ε. Dupin, N.M. Le Douarin. The diverse neural crest: from embryology to human pathology. The Company of Biologists. Development. 2019. 146, dev 169821. doi:10.1242/dev. 169821; Сосунов А.А. Нервный гребень и его нейральные производные. Соросовский образовательный журнал. №5. 1999). Клетки движутся по определенным путям миграции. В туловищном отделе зародыша клетки перемещаются по двум направлениям: вентральному - в сторону развивающихся внутренних органов и дорзо-латеральному - в пространстве между сомитами и эктодермой. Перемещающиеся в вентральном направлении клетки, предшественники нейронов и глии спинномозговых ганглиев, проходят только через передние отделы склеротома - совокупности рыхло расположенных клеток, образующихся при разделении сомитов на отдельные компоненты, уже не имеющие эпителиоморфного строения, присущего сомитам. Головные отделы склеротомов обладают тропизмом для клеток нервного гребня. Клетки уже сформированного склеротома являются эмбриональным зачатком для образования хрящевого и костного скелета (позвоночник, ребра, грудина, верхние и нижние конечности). Зачатки нижних конечностей формируются на уровне последних пар сомитов туловищного отдела эмбриона. Формирование участков склеротома, являющихся основой для развития малоберцовой и болыпеберцовой костей и коленной чашки, соответствует 51-56 часам 16 стадии эмбрионального развития цыпленка по классификации Гамбургер-Гамильтон. Контроль за миграцией клеток нервного гребня зависит от экспрессии эмбриональных генов группы PAX (РАХ1, РАХ3, РАХ9), HNK1 и др. Нарушение миграции клеток в вентральном направлении может быть связано с нарушением экспрессии РАХ3 гена, регулирующего синтез матрикса вдоль миграционного пути (Henderson DJ, Ybot-Gonzalez Ρ, Сорр AJ. Over-expression of the chondroitinsulphate proteoglycan versican is associated with defective neural crest migration in the Рах3 mutant mouse (splotch). Mech Dev. 1997; 69:39-51. DOI: 10.1016/ S0925-4773(97)00151-2). Изменение субстрата, по которому продвигаются клетки нервного гребня, может приводить к нарушению пути их продвижения.

Депонированные клетки нервного гребня, как в норме, так и при патологии, приобретают фенотип клеток, в которых они оседают, но исходный генотип сохраняется (Патент №2728927 «Способ моделирования сколиоза на курином эмбрионе», регистрация от 03 августа 2020, Зайдман A.M., Пахомова Н.Ю., Строкова Е.Л., Черноловская Е.Л., Мелешко Е.М., Шило А.Р.). На основании полученных репрезентативных данных о наличии клеток нервного гребня в пластинках роста медиальной стороны проксимального отдела болыпеберцовой кости у пациентов с болезнью Блаунта, возникла гипотеза о нарушении экспрессии РАХ3 гена как причине депонирования клеток нервного гребня в склеротоме, приводящей к формированию варусной деформации области коленных суставов. Этим объясняется отсутствие хондрогенной дифференцировки пластинки роста и дезорганизация костных и хрящевых структур на медиальной стороне проксимального отдела болыпеберцовой кости и как результат формирование варусной (О-образной) деформации области коленных суставов у пациентов с болезнью Блаунта (Radjen R Banwarie, Freek Hollman, Nandi Meijs, Jacobus J Arts, Pascal Vroemen, Prosper Moh, Heleen Μ Staal. Insight into the possible aetiologies of Blount's disease: a systematic review of the literature. J Pediatr Orthop B. 2020 Jul; 29 (4): 323-336). Следовательно, заложенные в эмбриогенезе нарушения морфогенеза коленных суставов реализуются в болезнь Блаунта со всеми клиническими и морфологическими признаками. Экспериментальные данные подтвердили эту гипотезу и позволили установить, что ингибирование РАХ3 гена именно в 53 часа эмбриогенеза приводит к «оседанию» мигрирующих клеток в зачатках нижних конечностей и формированию болезни Блаунта у экспериментальных животных

Принципиальной новизной предлагаемой экспериментальной модели является сочетание двуногости модели (цыпленок) и моделирование на генетическом уровне, позволяющие выявить патогенетические механизмы развития болезни Блаунта.

Фертильное куриное яйцо в физиологическом смысле расценивается как обособленная оплодотворенная яйцеклетка, в результате чего модель создается на формирующемся эмбрионе в период миграции клеток нервного гребня. В связи с этим полученные результаты могут быть экстраполированы на эмбрион млекопитающего.

Для ингибирования экспрессии РАХ3 гена применяли липофильную siРНК.

siРНК представляют собой 21 звенные дуплексы с 2 выступающими нуклеотидами на 3'-концах (19 в дуплексе, 2 выступают). Выбор последовательности siРНК, направленной на мРНК гена Рах3 проводили следующим образом. Последовательность мРНК гена Рах3 курицы брали из банка нуклеотидных последовательностей GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/). Последовательности siРНК выбирали исходя из температуры плавления, наличия термодинамической ассимметрии дуплекса, комплементарности антисмысловой цепи мРНК гена-мишени с помощью программ для выбора последовательности siРНК BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen, https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) или siDESIGN Center (Darmacon, https://dharmacon.horizondiscovery.com/design-center/). Для увеличения устойчивости siРНК к действию рибонуклеаз в CpG, UpA, СрА мотивы последовательности вводили 2’-О-метильные модификации (Volkov et al., Oligonucleotides, 2009, 31-40). Для определения специфичности действия использовали контрольную siРНК (siScr) не имеющую значимой гомологии с мРНК человека и кур. Все выбранные siРНК были получены синтетически с использованием твердофазного автоматического синтезатора, их биологическая активность была определена по способности подавлять экспрессию гена-мишени в культуре фибробластов кур. Последовательности наиболее активной siРНК и контрольной siРНК были использованы для конструирования холестеринсодержащих конъюгатов, конъюгат анти-Рах3 siРНК и конъюгат контрольной siScr (Petrova et al., Nucleic Acids Research, 2012, 40, 2330-2344).

siРНК дуплекс состоит из двух цепей:

смысловая цепь:

Х-5’-GCUmAGAUCmACmAUmGAAGAGUUU-3’

антисмысловая цепь:

5’-ACUCUUCmAUmGUmGAUCUmAGCUU-3’,

Где Χ - остаток холестерина, присоединенный аминогексильным линкером (n=6):

Um, Cm - 2’-О-метильные аналоги уридина и цитидина, соответственно.

siРНК проникает в цитоплазму клетки и связывается с клеточными белками, образуя комплекс RISC (RNA induced silencing complex), после активации этого комплекса, он связывается с комплементарной последовательностью в составе мРНК и находящийся в составе комплекса белок Ago2, обладающий рибонуклеазной активностью, расщепляет мРНК-мишень. После этого комплекс диссоциирует и может взаимодействовать с другой молекулой мРНК, а расщепленная мРНК деградирует.В результате этого снижается концентрация в клетке мРНК-мишени и перестает синтезироваться белок РАХ3, который кодируется мРНК-мишенью.

Предлагаемое изобретение поясняется изображениями, где на фиг. 1 представлен куриный эмбрион в 53 часа эмбриогенеза с полной диффузией введенной в нервную трубку липофильной siРНК к гену РАХ3 в склеротоме куриного эмбриона (Ув. х60); на фиг. 2 - прижизненное фото цыплят (1 день постнатального развития) после ингибирования экспрессии РАХ3 гена липофильной siРНК; на фиг. 3 - результаты рентгенографического обследования экспериментального цыпленка с варусной деформацией области коленного сустава слева (болезнь Блаунта).

Реализация предлагаемого способа поясняется примером конкретного выполнения.

Эксперимент проводился в стерильных условиях. Для реализации поставленной задачи, при выполнении эксперимента, скорлупу фертильного куриного яйца и яйца-донора обрабатывали 70% спиртом. Далее экспериментальное яйцо укладывали на подложку горизонтально, делали прокол стерильной иглой с вертикальной стороны, далее стерильными хирургическими ножницами делали отверстие в размере 0,8x1,5 см, отрезанную скорлупу убирали. Также удаляли подскорлуповую оболочку. Визуально при вскрытии контролировали развитие эмбриона и в 53 часа эмбриогенеза, на 16 стадии по классификации Гамбургер-Гамильтон, отбирали яйцо для проведения эксперимента. Не достигшие 16 стадии яйца в эксперимент не включали. На фиг. 1 видна полость нервной трубки (1) эмбриона. При помощи инжекторного шприца фирмы NARISHAGE и стеклянного капилляра под визуальным контролем через конфокальный микроскоп фирмы Ziess Discovery VI2 SteREO в нервную трубку (1) куриного эмбриона в 53 часа эмбриогенеза вводили липофильную siРНК к гену РАХ3, визуально контролируя заполнение нервной трубки до мозговых пузырей при помощи микроскопа (Ziess Discovery VI2 SteREO). Анатомическая целостность эмбриона и нервной трубки сохранены. На фиг.1 визуализируется полная диффузия введенной siРНК в склеротоме куриного эмбриона.

Из скорлупы яйца-донора стерильными ножницами вырезали фрагмент для закрытия отверстия на скорлупе экспериментального яйца. После выполнения манипуляций накладывали и закрепляли крышечку из скорлупы яйца-донора вместе с подскорлуповой оболочкой. Оставляли на сутки дефектом вверх, после чего ротировали яйцо в соответствии с физиологией развития куриного эмбриона.

До и после проведения эксперимента яйца инкубировали при температуре 38,0°С и влажности 55%. На 21 сутки инкубирования из яиц вылупились цыплята с ингибированием экспрессии РАХ3 гена липофильной siРНК (фиг. 2). Через 100 дней постнатального развития у цыплят при помощи рентгенографического обследования диагностирована варусная деформация области коленных суставов (болезнь Блаунта) (фиг. 3).

Развитие эмбриона после проведения эксперимента показало, что ингибирование РАХ3 гена в 53 часа эмбриогенеза приводит к остановке клеток нервного гребня в зачатках нижних конечностей (области коленных суставов). Механизм ингибирования РАХ3 гена: siRNA блокирует участок мРНК, с которого считывается синтез белка, обеспечивающего миграцию клеток нервного гребня. В результате клетки нервного гребня оседают в зачатке нижней конечности (области коленных суставов) и принимают фенотип малодифференцированных хондроцитов, но фенотип остается нейральным. Нейральные клетки генетически не подвергаются дифференцировке, пролиферации и, соответственно, росту, как это происходит в зоне локализации хондроцитов. Нарушение роста в зоне депонирования клеток нервного гребня приводит к дезорганизации костных и хрящевых структур на медиальной стороне проксимального отдела болыпеберцовой кости и выражается формированием варусной деформации области коленных суставов (болезни Блаунта), которая представлена на рентгенограмме.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к созданию экспериментальной модели болезни Блаунта путем ингибирования экспрессии гена РАХ3 липофильной интерферирующей siРНК в склеротоме куриного эмбриона. Индуцирование развития болезни осуществляют путем введения в нервную трубку куриного эмбриона в 53 часа эмбриогенеза липофильной siРНК к гену РАХ3 в объеме, обеспечивающем полное заполнение нервной трубки. 3 ил., 1 пр.

Способ моделирования болезни Блаунта на курином эмбрионе, заключающийся в том, что осуществляется введение в нервную трубку куриного эмбриона липофильной siPHK к гену РАХ3, представляющей собой дуплекс следующей структуры:

смысловая цепь:

Х-5'-CCUmAGAUCmACmAUmGAAGAGUUU-3',

антисмысловая цепь:

5'-ACUCUUCmAUmGUmGAUCUmAGCUU-3',

где X - остаток холестерина, присоединенный аминогексильным линкером (n=6):

Um, Cm - 2'-O-метильные аналоги уридина и цитидина соответственно,

в объеме, обеспечивающем заполнение нервной трубки, отличающийся тем, что введение липофильной siPHK осуществляют в 53 часа эмбриогенеза.