НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЗОНДОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ЧЕТЫРЕХ АЛЛЕЛЕЙ БЕТА-КАЗЕИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано в ветеринарной практике и зоотехнии с целью диагностики четырех важных аллелей бета-казеина (CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1, CSN2^B), ответственных за качество молока. Предложенный набор последовательности праймеров и аллельспецифических зондов позволяют одновременно идентифицировать четыре аллеля в локусе бета-казеина с помощью ПНР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

У молочных пород крупного рогатого скота, локус бета-казеина очень полиморфен. Исследования показали, что бета-казеин представлен 12 аллелями: CSN2^A1, CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^B, CSN2^C, CSN2^D, CSN2^E, CSN2^F, CSN2^H1, CSN2^H2, CSN2^I, CSN2^G. Относительно 13-го CSN2^A4 аллеля, то он выявлен у местного южнокорейского крупного рогатого скота, встречается в виде гетерозигот, образуя генотипы вместе с CSN2^A1, CSN2^A2, CSN2^B вариантами. Структура формируемого им белка бета-казеина слабо изучена, как и большинство других выявленных вариантов [11].

Группой ученых [12], известные аллели в локусе бета-казеина (CSN2), предложено делить на два семейства, с учетом влияния на качество молока. В семейство А1 входят следующие 5 аллелей, продукты которых являются ухудшателями качества молока: CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^C, CSN2^F, CSN2^G. При этом первые два чаще всего встречаются у крупного рогатого скота.

В то же время А2 семейство представлено группой из 7 аллелей: CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^D, CSN2^E, CSN2^H1, CSN2^H2, CSN2^I, присутствие их продуктов оказывает, наоборот, позитивное влияние на качество молока [13].

Установлено, что CSN2^A1 и CSN2^B аллели распространены там, где использовались быки-носители в селекционных мероприятиях. На формирование аллелотипа стада коров с учетом CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1 и CSN2^B аллелей влияют такие факторы, как генетическая генеалогия быка, эффект основателя линии, дрейф мутантного или нормального аллеля.

Таким образом, в молекулярной генетике существует очевидная потребность в разработке высокочувствительного, специфичного и быстрого способа диагностики наиболее часто встречаемых четырех аллелей бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). Кроме того, из-за незнания этих вопросов, закупаемый племенной материал не тестируют на (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3) аллели, в результате происходит «засорение» российских пород крупного рогатого скота нежелательными генотипами по локусу бета-казеина. Ранее нами были созданы аналогичные два Патента по каппа-казеину для оценки качества молока на сыропригодность.

Причем дрейф мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей, как внутри одного государства, так и между странами обусловлен искусственным отбором. Главной причиной такого явления служит жесткая селекция и широкое использование небольшой группы элитных быков-носителей CSN2^A1 и CSN2^B аллелей для искусственного осеменения массива коров, множественной овуляции и эмбриотрансплантации (МОЭТ). Поступление мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей в Россию происходит также за счет покупки не аттестованного племенного материала: животные, семя, эмбрионы [3; 6].

Коровы больше служат резерватом, т.е. биологическим хранителем его в стаде в виде гомозигот (CSN2^A1/A1, CSN2^B/B) или гетерозигот (CSN2^A1/A2, CSN2^A1/B, CSN2^A2/B), в силу более длительного использования [4].

Мутантные CSN2^A1 и CSN2^B аллели проявляются в виде кодоминантного фактора. Следует отметить, что это новое явление в диагностике аномальных аллелей в молочном скотоводстве. Ранее обнаруживаемые мутантные аллели, вызывающие наследственные болезни, встречались только как рецессивные факторы [7; 3; 5; 9; 10].

По материалам многих медицинских источников, А2 молоко является наиболее приемлемым в питании детей и взрослого человека [1; 2]. В то же время, причиной распространения мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей у пород крупного рогатого скота могли оказаться ряд факторов: высокий удой у коров, бык-носитель, семя которого широко использовалось для осеменения коров. Поскольку коммерческие породы крупного рогатого скота, пораженные мутацией, получили широкое распространение в силу высокой молочной продуктивности по всему миру, коров с А1 и В белками стало намного больше.

Известно, что козье, овечье, верблюжье, кобылье, отчасти от коров Bos indicus L. и Bos taurus L. и женское грудное молоко, с точки зрения биохимии относится к А2 бета-казеиновому молоку. Главный вопрос заключается в том, почему это произошло, из-за чего носители CSN2^A1 и CSN2^B аллелей сохранились в процессе эволюции и так широко распространились. Одна из рабочих гипотез говорит о том, что CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2 и CSN2^A3 аллели, располагаются рядом с тем пулом генов, которые оказывают положительное влияние на различные продуктивные признаки современных пород крупного рогатого скота [2; 6].

Известно, что молоко с А1 белком переваривается человеческим организмом иначе, чем с А2. При расщеплении А1 варианта белка бета-казеина выделяется маленький фрагмент - пептид, состоящий из семи аминокислот, он называется бета-казоморфином-7 (БКМ-7), а из А2 белка он не образуется [1; 8; 2;].

Следует отметить, бета-казеин, молочный белок состоит из цепи аминокислот.Когда организм переваривает молоко, пищеварительные ферменты разрушают эти цепи на пептиды, а затем на отдельные аминокислоты. В А1 и А2 бета-казеиновых белках их структура состоит из 209 аминокислот.

Единственная разница между ними - аминокислота в 67 позиции. У А1 бета-казеинового белка - это гистидин, у А2 - пролин (табл. 1). У гистидина в белке А1 бета-казеина, очень слабые связи с соседними аминокислотами в 67 позиции. В результате происходит его расщепление, образуя бета-казоморфин-7.

Бета-казоморфин-7 обладает опиоидными окислительными свойствами. Научные исследования и клинические испытания показывают, что БКМ 7 может негативно влиять на здоровье и самочувствие взрослых и детей. При этом у детей негативная реакция может проявляться даже сильнее. Возможно это связано со слабо сформированной иммунной системой у детей [13; 1; 8; 2].

В таблице 1 показаны принципы формирования других аллелей у крупного рогатого скота. В производственной практике обычно молоко от разных коров смешивают. Поэтому в молоке всегда есть А1, В и другие белки А1 бета-казеинового семейства. Но их количество может меняться в зависимости от страны и разводимых пород.

Известно, что примерно от 16 до 20% людей имеют непереносимость, их желудочно-кишечный тракт не может переваривать обычное молоко. Существует мнение, что это связано с лактозной непереносимостью. С другой стороны, некоторые ученые считают, что во многом виноват белок коровьего молока, - бета-лактоглобулин, вызывая, например, у детей диатез. Установлено, что действительной проблемой людей чаще всего связанной с непереносимостью молока является не лактоза или бета-лактоглобулин, а А1 бета-казеиновый белок, при расщеплении которого образуется бета-казоморфин-7. Т.е., люди, которые не пили молоко вообще, могут пить А2 молоко, а не соевое, рисовое, миндальное [1; 2; 8; 15].

В заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма в локусе бета-казеина с помощью ПЦР-РВ и использованием зондов TaqMan. В ближайшем аналоге, статье Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338 диагностируют бета-казеин, с использованием ПЦР с электрофоретическим методом детекции, что является принципиально другим методом диагностики данного полиморфизма [14]. Он занимает больше времени, для реализации метода необходимо больше оборудования, реактивов и помещений. Кроме этого вероятность контаминации при постановке ПЦР с электрофоретическим методом детекции выше. Метод более трудоемкий и занимает 8-ми часовой рабочий день.

Целью данного изобретения является создание набора последовательности праймеров и аллельспецифических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей бета-казеина (CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1, CSN2^B) у крупного рогатого скота с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

В настоящем изобретении представлен способ одновременной диагностики четырех аллелей у различных пород крупного рогатого скота. Тест-система разработана для аттестации всех половозрастных групп животных: быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтного молодняка, а также семени из спермобанка и эмбрионов.

Предлагаемый к патентованию набор праймеров и зондов в сравнении со всеми изученными аналогами имеет следующие преимущества: специфическая структура праймеров и зондов, а так же, с помощью предлагаемого к патентованию набора праймеров и зондов можно одновременно в одной пробирке провести полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ), что обеспечивает быстроту проведения диагностики и получение результата сразу по четырем наиболее часто встречаемым аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3).

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность диагностики одновременно четырех аллелей (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). Сокращение времени выполнения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) (через 3 часа получен результат); не трудоемкость; возможность выполнять повторности; проводить контроль правильности исследования.

Указанный технический результат достигается тем, что набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей бета-казеина у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, имеет следующую структуру:

Выделение ДНК проводят из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием реактивов.

Согласно заявленному изобретению для диагностики используют реактивы в виде трех комплектов. Каждый комплект состоит из компонентов (реакционная смесь, разбавитель и полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеме непосредственно перед проведением исследования.

При подготовке к проведению реакции рассчитывают необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4, из которых три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец для каждой реакционной смеси. Реактивы смешивают, затем в подготовленные для ПЦР пробирки вносят по 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси, в каждую ПЦР пробирку добавляют по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов. Пробирки помещают в амплификатор при числе циклов амплификации равном 40. Анализ полученных данных проводят путем сравнения амплифицированных участков генов, результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.

Тест-система содержит 3 реакционных смеси: CASB_Pro67His, CASB_His106Gln, CASB_Ser122Arg (состав каждой из смесей: 50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-HCl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl₂, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 200 нМ), разбавитель -деионизированная вода 1 мл, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, и 3 положительных контрольных образца, один отрицательный контрольный образец - для каждой реакционной смеси. Праймеры и флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды имеют следующие последовательности (табл. 2):

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР-анализа. Система рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл (20 мкл реакционной смеси+5 мкл исследуемого образца).

Подбор праймеров и аллельспецифичных зондов (табл.3) проводили при помощи пакета прикладных программ «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей локуса бета-казеина, опубликованных в базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI - National Center for Biotechnology Information USA).

Источником для проведения диагностики служит предварительно выделенная ДНК из образцов биологического материала (цельной крови, спермы, эмбрионов, молока или кожи).

Выделение ДНК проводили сорбентным методом (S-Сорб, компания «СИНТОЛ», Москва). Далее выделенную ДНК использовали в реакции: 5 мкл образца добавляли к реакционной смеси ПЦР.

Набор компонентов для реакции представлен в таблице 3.

Условия хранения: №1-3, при температуре -16-20°С

Компоненты размораживали, перемешивали и центрифугировали. Готовили смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанном в таблице 4.

ПЦР пробирки маркировали. В подготовленные для ПЦР пробирки вносили по 20 мкл смеси компонентов. Затем в каждую ПЦР пробирку вносили по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешивали многократным пипетированием и плотно закрывали крышку. Пробирки помещали в амплификатор, затем программировали работу прибора.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры 94°С - 3 мин, один повтор.

2. Циклирование 1 (без детекции)

94°С - 20 сек

58°С - 20 сек

61°С - 30 сек

Цикл повторяли 10 раз.

3. Циклирование 2 (с детекцией)

94°С - 20 сек

58°С - 20 сек

61°С - 30 сек - детекция по каналам: Green, Yellow, Orange, Red

Цикл повторяли 30 раз.

В процессе циклирования отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК происходил при температуре 61°С. При первом циклировании детекцию не проводили, так как данные не репрезентативны. При втором циклировании проводили 30 повторов, в результате получали стабильные данные, которые являются окончательными в плане диагностики генотипов.

Создание шаблона ПЦР-РВ, а также анализ результатов исследования осуществляли при помощи программного обеспечения «Rotor-Gene 6000 1.8» к прибору Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия). Результатом анализа является определение сочетания четырех аллелей гена бета-казеина (CASB^A2, CASB^A3, CASB^AI, CASB^B) у крупного рогатого скота.

Принцип метода: одна пара праймеров и три пары аллель-специфических зондов были подобраны с учетом трех участков однонуклеотидных замен (полиморфизмов) в гене бета казеина (CASB) крупного рогатого скота. Для каждого полиморфизма зонды подобраны таким образом, чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального (дикого) типа, а второй зонд - с аллелем мутантного типа. Зонды метят различными флуорофорами (в данном случае FAM, R6G, ROX, Су5), а результаты реакции с ними регистрируют на четырех различных каналах детекции прибора для ПЦР-РВ (в нашем случае RotorGene-6000) - Green, Yellow, Orange, Red. Общая пара праймеров и три пары зондов были скомплектованы в три реакционные смеси - каждая смесь детектирует один полиморфизм. В первой реакционной смеси происходит детекция замены аминокислоты пролин на гистидин в положении 67, что соответствует замене азотистого основания цитозин на аденин, во второй смеси - замена аминокислоты серии на аргинин в положении 122, что соответствует замене азотистого основания цитозин на гуанин, в третьей смеси - замена аминокислоты гистидина на глутамин в положении 106, что соответствует замене азотистого основания цитозина на аденин. Вывод об аллельном варианте гена бета казеина делают на основании сочетания результатов детекции для трех реакционных смесей

Интерпретацию результатов анализа исследуемых образцов проводили в соответствии с таблицей 5:

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

1. Аттестация элитных животных различных пород крупного рогатого скота по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3) с помощью заявленного набора последовательности праймеров и аллельспецифических зондов позволит целенаправленно формировать аллелофонд быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов).

2. Наличие генетического паспорта по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3), а также тест-системы для его осуществления, позволит эффективно вести селекционно-племенную работу в племенных стадах крупного рогатого скота Российской Федерации.

3. При завозе племенного материала в Россию из-за рубежа обязательно наличие генетического паспорта по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). С целью подтверждения генотипа по бета-казеину, закупленные животные после карантина должны пройти повторную аттестацию.

Литература

1. Дубынин В.А., Каменский А.А. Бета-казоморфины и их роль в регуляции поведения. Место издания Товарищество научных изданий КМК Москва, 2010. - 306 с.

2. Вудфорд К. Дьявол в молоке. Болезнь, здоровье и политика. Молоко А1 и А2. Издательство РАМН. - Москва, 2018. - 320 с.

3. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Абылкасымов Д.А., Марзанова С.Н., Коновалова Н.В., Либет И.С., Новикова Л.Ф., Попов А.Н., Турбина И.С., Марзанова Л.К. Встречаемость β-CN^A2 и β-CN^A1 аллелей в локусе бета-казеина у пород крупного рогатого скота. В сборнике: повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения, материалы XXV международной научно-практической конференции. Российская академия менеджмента в животноводстве. Г.о. Подольск, пос. Быково, 2019а. - С. 134-143.

4. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н. Генетический груз мутаций в породах крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции: «Молекулярно-генетические технологии для анализа экспрессии генов продуктивности и устойчивости к заболеваниям животных». - М.: Издательство «Сельскохозяйственные технологии». - Москва, 20196.-С. 124-130.

5. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н., Абылкасымов Д.А., Коновалова Н.В., Либет И.С. Характеристика российских молочных пород крупного рогатого скота по встречаемости генотипов и аллелей в локусе бета-казеина. // Ветеринария Зоотехния Биотехнология. - 2020а. - №1. - С. 47-52. DOI: 10.26155/vet.zoo.bio.202001007.

6. Марзанов Н.С., Абылкасымов Д.А., Либет И.С, Девришов Д.А., Марзанова С.Н. Характеристика аллелотипа у коров черно-пестрой породы по локусам бета- и каппа-казеина и качественные показатели молока. Сборник трудов ФГАНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГАНУ «ВНИМИ»), под общей редакцией академика РАН Галстяна Арама Генриховича. - Москва, 2020в. - С. 368-376.

DOI 10.37442/978-5-6043854-1-8-2020-1-368-376.

7. Турбина И.С.Характеристика быков-производителей по различным генетическим маркерам. Дис. канд. биол. наук. - Москва, 2006. - 112 с.

8. Соколов О.Ю. Опиоидные пептиды и психомоторное развитие детей: автореф. дисс. д.б.н. - Москва, 2012. - 48 с.

9. Dar А.Н., Kumar S., Kumari P., Mukesh M., Singh D.V., Sharma R.K., Ghosh A.K., Singh В., Panwar V.A., Sodhi M. Distribution of allelic and genotyping frequency of A1/A2 allele of beta casein in Badri cattle. // Journal Livestock Diversity. - 2018. - Vol.8. -No.2. - P. 115-119.

10. Dinc H. Genotyping of beta-casein, kappa-casein and beta-lactoglobulin genes in Turkish native cattle breeds and efforts to delineate BCM-7 on human PBMC. In partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in biology. September. Turkey, 2009. - 187 p.

11. Chung E.R., Han S.K., Rhim T.J. Milk protein polymorphisms as genetic marker in Korean native cattle. // Asian-Australian Journal of Animal Sciences. -1995. - Vol.8(2). -P. 187-194. DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.1995.187

12. Farrell H.M.Jr., Jimenez-Florez R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K., Hicks C.L., Hollar СМ., Ng-Kwai-Hang K.F., Swaisgood H.E. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision // J Dairy Sci. - 2004. -Vol. 87. - P. 1641-1674.

13. Kaminski S., Cieslinska A., Kostyra E. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health // Journal of Applied Genetics. - 2007. - Vol.48(3). - P. 189-198.

14. Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338.

15. Pal S., Woodford K., Kukuljan S., Ho S. Milk Intolerance, Beta-Casein and Lactose // Nutrients. - 2015. - Vol.7(9). - P.7285-7297. DOI: 10.3390/nu7095339.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в ветеринарной практике и зоотехнии для диагностики 4-х аллелей бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). Представлен набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей бета-казеина у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. 5 табл., 1 пр.

Набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех аллелей бета-казеина у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, имеющих следующую структуру: