СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ МЕТОДОМ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61B10/00 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может использоваться для прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.

По данным различных авторов, частота бесплодных браков на территории России колеблется от 8% до 17,8%, а отдельных регионах превышая определенный ВОЗ критический уровень 15%, при котором бесплодие может рассматриваться как фактор, значительно влияющий на демографические показатели и представляющий собой государственную проблему. Уменьшение частоты бесплодных браков можно рассматривать как один из резервов повышения рождаемости [7].

Важнейшим достижением в лечении бесплодия явилось внедрение в клиническую практику методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Вспомогательные репродуктивные технологии дали возможность реализовать функцию деторождения при абсолютном трубном бесплодии, гипергонадотропных формах аменореи, бесплодии неясного генеза, а также при различных формах мужского бесплодия, ранее считавшихся бесперспективными [7].

Эффективность ЭКО в настоящее время не превышает 35%, и около трети всех беременностей прерывается на ранних сроках. Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцитов-cumulus весьма субъективна и часто не соответствует истинному состоянию ооцита [1].

Фолликулярная жидкость (ФЖ) представляет большой интерес для исследователей, поскольку она легко может быть получена в достаточном количестве во время процедур вспомогательной репродукции и является единственной натуральной средой для ооцитов, обладающей всеми необходимыми компонентами, гормональными и биохимическими [5]. Это биологическая жидкость, которая синтезируется фолликулярным эпителием, расположенным вокруг ооцита второго порядка. Она является своего рода микроокружением развивающегося ооцита. Избыток или недостаток биологически активных веществ в фолликулярной жидкости оказывает негативное влияние на развитие ооцита [10]. Поэтому исследование физико-химических свойств ФЖ представляет несомненный интерес в плане обоснования новых подходов к прогнозу имплантации и успешного течения беременности при ЭКО. В то же время ФЖ исследуют сравнительно редко.

До настоящего времени не определены наиболее информативные и диагностически ценные признаки, эффективные для раннего прогноза результативности лечения бесплодия с помощью ЭКО. Большинство исследований посвящено анализу уровня половых гормонов и других биологически активных веществ в фолликулярной жидкости [12]. Методы определения этих веществ достаточно сложны и дороги, их неудобно применять в повседневной практике, особенно если от одной женщины получено много проб ФЖ.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ прогнозирования эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО, включающий трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ по программе ЭКО и анализ ФЖ на наличие цитокинов методом проточной флюориметрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System ("Bio-Rad", США) с использованием коммерческих тест-систем 17-Р1ех. При критически низком уровне IL-7 (≤6 пг/мл), IL-4 (≤2 пг/мл) и IL-2 (≤7 пг/мл), относительном дефиците G-CSF (≤50 пг/мл) и MIP-1β (≤55 пг/мл), а также избыточной концентрации IL-13 (≥40 пг/мл) и IL-8 (≥25 пг/мл) дается отрицательный прогноз развития беременности. Те же самые цитокины, но в других диапазонах, обладают диагностической ценностью в отношении позитивного прогноза результатов ЭКО (IL-4≥8 пг/мл, IL-7≥11 пг/мл, IL-2≥26 пг/мл, G-CSF≥157 пг/мл, IL-8≤15 пг/мл, IL-13≥26 пг/мл, MIP-1β≥81 пг/мл). Авторы этого метода указывают на то, что чувствительность большинства выделенных диапазонов является недостаточно высокой. Также они обращают внимание на то, что так как лабораторную оценку уровня цитокинов в ФЖ методом проточной флюориметрии нельзя признать доступной для широкого практического использования, то представляется важным поиск более простых и доступных тестов [8].

Недостатками способа-прототипа являются его дороговизна и сложность, необходимость специализированной лаборатории для определения концентрации цитокинов в ФЖ (стоимость определения концентрации одного цитокина 250-350 руб.). В сети городских лечебно-профилактических учреждений подобный анализ вряд ли может быть осуществим.

Недостатками способа-прототипа являются:

1) необходимость в специальной дорогостоящей аппаратуре,

2) необходимость в большом количестве дорогостоящих реактивов,

3) сложность исполнения анализа, большое количество оцениваемых показателей,

4) дороговизна анализа для пациента (стоимость анализа одной пробы ФЖ 1750-2450 рублей),

5) недостаточная чувствительность.

Полученные Н.А.Хониной и соавт. данные говорят о том, что цитокины с провоспалительной/иммуностимулирующей активностью участвуют в регуляции созревания яйцеклетки [11]. О суммарной активности медиаторов, контролирующих воспалительную реакцию, судили по способности исследуемых образцов (сыворотка или ФЖ) стимулировать (воспалительная активность) или ингибировать (противовоспалительная активность) интенсивность продукции перекиси водорода нейтрофилами здоровых доноров. Известно, что при воспалении происходит «респираторный взрыв» с образованием большого количества активных форм кислорода и свободных радикалов, которые могут повреждать мембраны и другие структуры клеток [3]. Можно предположить, что эти механизмы участвуют в овуляции.

В связи с этим интересен метод индуцированной хемилюминесценции, который позволяет определять активность свободнорадикального (CP) окисления и общую антиоксидантную активность (АОА) в биологических субстратах. Он является высокочувствительным, экономичным, быстрым и информативным методом [2].

Метод индуцированной перекисью водорода и сульфатом железа хемилюминесценции основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси водорода ионами металла с переменной валентностью - двухвалентным железом [6]:

ROOH+Fe²⁺→RO°+ОН^-+Fe³⁺ (реакция Фентон).

Образующиеся свободные радикалы RO и ОН" вступают в реакцию активации свободнорадикального окисления в биологическом субстрате, что приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света, регистрируемого на биохемилюминометре. На интенсивность процесса свечения оказывает влияние полный комплекс соединений, обладающих как оксидантным, так и прооксидантным действиями [4].

В доступной литературе данных об исследовании свободнорадикального баланса в ФЖ нами найдено не было.

В задачу предлагаемого изобретения положено удешевление и упрощение прогнозирования результатов лечения бесплодия методом ЭКО.

Поставленная задача в способе прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения по результатам трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ достигается тем, что проводят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ, забирают ФЖ, подвергают ее хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей АОА дают прогноз наступления беременности. При показателях общей АОА 0,05 и выше дается неблагоприятный прогноз, при общей АОА ниже 0,05 прогноз благоприятный - вероятность наступления беременности более 50%.

Нами было обследовано 20 женщин в возрасте от 25 до 36 лет, проходивших лечение на базе ООО «Медицинский центр АИСТ» г.Н.Новгорода со следующими диагнозами: бесплодие, связанное преимущественно с мужским фактором - 5 человек (25%); бесплодие трубного генеза - 15 человек (75%).

Для выявления причин бесплодия пациенткам проводили общеклиническое и гинекологическое обследование, УЗИ органов малого таза, эндоскопическое исследование по показаниям, определяли концентрацию половых гормонов в крови. Индукцию суперовуляции в лечебных циклах ЭКО осуществляли по стандартным протоколам с использованием декопептила и пурегона или диферелина и меногона. В качестве индуктора овуляции использовали прегнил. ФЖ получали путем трансвагинальной пункции преовуляторных фолликулов (от 2 до 11 у одной пациентки). Для исследования бралась только та фолликулярная жидкость, где после просмотра эмбриологом был обнаружен ооцит-cumulus. Всего было исследовано 100 проб ФЖ.

Показатели свободнорадикальной активности ФЖ измерялись методом индуцированной хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-06, сопряженном с компьютером в диалоговом режиме (разработка Нижегородского НИЦ "Биоавтоматика"). Результат распечатывался в унифицированной форме.

Стандартная методика проведения анализа в биологических жидкостях (плазма и сыворотка крови, фолликулярная жидкость)

Реактивы: 0,05 мМ раствор сульфата железа (навеска 0,14 г FeSO₄ растворялась в 50 мл дистиллированной воды), 2% раствор перекиси водорода (2 мл стандартного пергидроля растворялся в 28 мл дистиллированной воды), фосфатный буфер (навески KH₂PO₄ 1,361 г и KCl 3,9144 г на 0,5 л дистиллированной воды, до необходимого рН доводилась с помощью концентрированного раствора КОН (рН=7,5)).

В измерительную кювету вносилось 0,2 мл раствора сульфата железа, 0,2 мл ФЖ, 0,4 мл фосфатного буфера и 0,2 мл свежеприготовленного раствора перекиси водорода. Кювета с приготовленной смесью быстро ставилась на измерительную позицию хемилюминометра и измерялся световой выход за 30 сек.

Результаты представлялись в виде кинетической кривой. Для ее оценки брали наиболее информативные показатели:

1) Imax (мВ) - максимальная интенсивность свечения исследуемой пробы - отражает свободнорадикальную активность образца;

2) S - светосумма хемилюминесценции (за 30 сек) - обратно пропорциональна общей АОА пробы. Общая АОА - суммарная физико-химическая величина, характеризующая способность данного субстрата тормозить реакции окисления. Она зависит от относительного количества и физико-химических параметров каждого из биоантиоксидантов, имеющихся в анализируемой смеси, их взаимного влияния друг на друга, от присутствия веществ, способных усиливать или ослаблять действие биоантиоксидантов.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами непараметрической статистики с помощью программ Microsoft Excel 2000 и Statistics 6.0 [9].

Лечение бесплодия методом ЭКО дало следующие результаты: у 7 (35%) женщин наступила беременность и у 13 (65%) - результат лечения был отрицательным. Наши результаты соответствовали литературным данным [1].

Результаты исследования свободнорадикального баланса фолликулярной жидкости приведены в таблице 1. Видно, что у пациенток, у которых наступила беременность, АОА фолликулярной жидкости статистически значимо ниже, чем у пациенток другой группы, и свободнорадикальный баланс сдвинут в сторону преобладания CP окисления над АОА.

      Таблица 1 Сравнение показателей свободнорадикального баланса фолликулярной жидкости при разных результатах ЭКО Показатель Беременности нет Беременность наступила Отличие по критерию Манна-Уитни I max, мВ 1,05-2,0,
медиана 1,71 1,4-2,4,
медиана 1,76 р=0,08 АОА 0,036-0,092,
медиана 0,047 0,033-0,05,
медиана 0,043 р=0,03

Таким образом, нам представляется, что при лечении бесплодия методом ЭКО уровень общей АОА является прогностически значимым фактором. Метод индуцированной хемилюминесценции требует малых затрат времени (около 5 минут) и недорогих реактивов. Его чувствительность равна 1, специфичность - 0,48. Метод можно применять непосредственно во время пункции фолликулов, что дает возможность оценить необходимость дальнейшей работы эмбриолога с данным ооцитом, что дополнительно может удешевить лечение.

Необходимое оборудование для исследования ФЖ методом индуцированной хемилюминесценции:

1) биохемилюминометр, сопряженный с персональным компьютером, и программа обработки кинетической кривой,

2) пипеточные микродозаторы,

3) лабораторная посуда,

4) реактивы (0,05 мМ раствор сульфата железа, 2% раствор перекиси водорода, фосфатный буфер).

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества в сравнении с прототипом:

1) упрощение и ускорение (один анализируемый показатель),

2) удешевление (стоимость исследования одной пробы ФЖ 100-200 руб.),

3) возможность проведения анализа во время пункции фолликулов.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У больных с бесплодием проводят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ, забирают ФЖ, подвергают ее хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов, и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности. При показателях АОА 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при АОА ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50%.

В качестве иллюстрации заявляемой диагностической технологии приводим примеры, подтверждающие практическое применение данной методики.

Больная К., 33 лет, проходила обследование и лечение в ООО Медицинский центр «Аист» по поводу первичного бесплодия трубно-перитонеального генеза, наружнегенитального эндометриоза, гиперпролактинемии. Менструальная функция: менархе с 14 лет, регулярные, умеренные, безболезненные. Беременностей не было. В анамнезе - двусторонняя тубэктомия в 2000 г., 2006 г.- экстрокорпоральное оплодотворение без эффекта. По данным гистероскопии: эндометриоз тела матки. Проводилось обследование гормонального статуса. Выявлено отклонения содержания пролактина: 1415 мМЕ/л при норме 120-900 мМЕ/л, по поводу чего пациентка получала терапию препаратом «Достинекс» 0,25 мг два раза в неделю в течение 4 недель. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу с использованием диферелина и пурегона. В результате трансвагинальной пункции получено 3 ооцита. Соответствующие пробы ФЖ были подвергнуты хемилюминесцентному анализу со следующими результатами: АОА 1=0,04, АОА2=0,038, АОА3=0,033. Дан благоприятный прогноз. На 2-е сутки после оплодотворения два ооцита остановились в развитии. На 3-й сутки произведен перенос одного 6-8 клеточного бластомера. После переноса назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбриона сдана кровь на β-хорионический гонадотропин, лечение закончено наступлением беременности.

Больная Б., 36 лет, проходила обследование и лечение в ООО Медицинский центр «Аист» по поводу вторичного бесплодия, трубноперитонеального генеза. Менструальная функция: менструации с 13 лет, регулярные, умеренные, безболезненные. Было две беременности: 1989 г. - срочные роды; 2003 г. - правосторонняя трубная беременность. Проводилось гормональное обследование, отклонений не выявлено. При гистеросальпингографии выявлен спаечный процесс малого таза, непроходимость маточных труб; гистероскопическое обследование - без патологии. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу с использованием диферелина и пурегона. В результате трансвагинальной пункции было получено 7 ооцитов. Соответствующие пробы ФЖ были подвергнуты хемилюминесцентному анализу со следующими результатами: АОА1=0,047, АОА2=0,051, АОА3=0,051, АОА4=0,05, АОА5=0,052, АОА6=0,058, АОА7=0,057. Дан неблагоприятный прогноз. По настоянию пациентки процедура ЭКО была продолжена. На третьи сутки после оплодотворения 5 клеток остановились в развитии. Перенос одного 6-8 клеточного бластомера и одной ранней бластоцисты проводился на пятые сутки. На 14-е сутки после переноса эмбриона сдана кровь на β-хорионический гонадотропин. Лечение без эффекта, на 18-е сутки началась менструация.

Источники информации

1. Адамян Л.В., Торганова В.А. Состояние фолликулярного аппарата яичников // Акушерство и гинекология. - 2002. - №2. - С.22-25.

2. Бурлакова Е.Б. Роль антиокислительной активности липидов в клеточном метаболизме // Витамины. - Киев, 1975. - Т.8 - С.37-42.

3. Владимиров Ю.А. Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки. Сер. Биофизика. - М.: ВИНИТИ, 1999. - Т.29. - 249 с.

4. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных. - М.:ВИНИТИ, 1989. - 170 с.

5. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Грищенко Н.Г. Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов // Проблемы репродукции. - 1999. - №6. - С.34-37.

6. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободно-радикальных реакций в биологических субстратах // Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. - Горький, 1983. - С.179-183.

7. Кулаков В.И., Корнеева И.Е. Диагностика и лечение женского бесплодия // Практическая гинекология. / Под ред. В.И.Кулакова и В.Н.Прилепской. - М.: МЕДпресс-информ, 2001. - С.298-317.

8. Останин А.А., Айзикович Б.И., Айзикович И.В., Черных Е.Р. Прогностическая модель оценки эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО // Проблемы репродукции. - 2006. - №4. - С.63-69.

9. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

10. Репродуктивная эндокринология // Под ред. С.С.К.Йена, Р.Б.Джаффе. - М.: Медицина, 1998.

11. Хонина Н.А., И.В. Айзикович, Е.Я.Шевела и др. Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции // Цитокины и воспаление. - 2005. - №2. - С.22-28.

12. Яманова М.В., Светлаков А.В., Салмина А.Б., Пожиленкова Е.А., Гончарова Л.Л. Микроокружение ооцитов при эндокринном бесплодии // Проблемы репродукции. - 2004. - №4. - С.46-49.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может использоваться для прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения. Проводят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости. При этом фолликулярную жидкость подвергают хемилюминесцентному анализу по стандартной методике. Определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности. При показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50%. Способ обладает высокой чувствительностью, позволяет упростить и удешевить прогнозирование эффективности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения. 1 табл.

Способ прогнозирования эффективности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения, включающий проведение трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что фолликулярную жидкость подвергают хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности: при показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50%.