Способ оценки специфичности биологических молекул in vitro Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12N15/64 C12N5/09 C12N5/10 C12N5/16 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, медицинской биотехнологии и фарминдустрии и может быть использовано для оценки in vitro специфичности молекул, аффинных к биомаркерам клеточных мембран и создаваемых на основе антител, фрагментов антител, аптамеров или альтернативных каркасных белков.

Создание фармпрепаратов на основе биомолекул, аффинных к биомаркерам клеток человека, является наиболее перспективным вектором современного развития фарминдустрии, особенно в области разработки препаратов для диагностики и терапии опухолевых заболеваний. Основным свойством аффинных к биомаркерам биомолекул является их способность к специфическому связыванию с молекулами-мишенями. Под специфичностью понимают способность биомолекул связываться с определенными, комплементарными структурами биомаркеров и в то же время не образовывать связей с молекулами, не имеющими комплементарных участков. К категории фармакологических субстанций, способных к аффинному специфичному взаимодействию с биомаркерами, относятся препараты, создаваемые на основе антител, их фрагментов, аптамеров или альтернативных каркасных белков.

Более 30% всех белков, кодируемых геномом человека, представляют мембранные белки, которые выполняют широкий спектр важнейших биологических функций. На долю мембранных белков приходится около 50% молекулярных мишеней разрабатываемых лекарственных препаратов (Pedro A.Q, Queiroz J.A., Passarinha L.A. Smoothing membrane protein structure determination by initial upstream stage improvements. 2019; Production of Membrane Proteins: Strategies for Expression and Isolation. Robinson A.S., ed. 2011).

В настоящее время применяются различные способы оценки in vitro специфичности препаратов, аффинных к биомаркерам клеточных мембран. Для этого используют живые или фиксированные клетки (Bonavia A.S. et al. Immunoreactivity assay for α-particle emitting monoclonal antibody constructs. 2006; Lindmo T. et al. Determination of the immunoreactive function of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. 1984), микропланшеты или шарики с иммобилизованными молекулами-биомаркерами (Ngai W.M., Reilly R.M. A simple method to determine the immunoreactivity of radiolabelled monoclonal antibodies to the TAG-72 antigen. 1993; Andersen L. Development of an Analytical Method for the Determination of the Antigen Binding Capacity of Radiolabeled Antibodies. 2012; Sharma S.K. et al. A rapid bead-based radioligand binding assay for the determination of target-binding fraction and quality control of radiopharmaceuticals. 2019), клеточные мембраны на фильтровальных пластинах (Hulme E.C., Trevethick M.A. Ligand binding assays at equilibrium: Validation and interpretation. 2010).

Так известен способ оценки специфичности аффинных биомолекул in vitro с помощью клеток (Pisaneschi F., Viola N.T. Development and Validation of a PET/SPECT Radiopharmaceutical in Oncology. 2022), экспрессирующих на мембране маркерный белок. Носителями биомаркеров служат первичные или постоянные культуры клеток человека или рекомбинантные клетки. Эти клетки инкубируют с тестируемыми биомолекулами, отмывают от несвязавшихся компонентов и оценивают количество аффинно связавшегося препарата при помощи флуоресцентной, изотопной или иной метки. Преимуществом такого подхода, является тестирование биомолекул на биомаркерах, представленных в той же форме, в какой они присутствуют в организме человека. Ограничения при использовании клеток человека состоят в том, что далеко не все биомаркеры представлены на мембранах этих клеток в высокой плотности (Sharma S.K. et al. A rapid bead-based radioligand binding assay for the determination of target-binding fraction and quality control of radiopharmaceuticals. 2019), что не позволяет обеспечить надлежащее качество анализа in vitro (Denoël T. et al. A Robust Method for Assaying the Immunoreactive Fraction in Nonequilibrium Systems. 2019; Pisaneschi F., Viola N.T. Development and Validation of a PET/SPECT Radiopharmaceutical in Oncology. 2022). На воспроизводимость результатов могут оказывать влияние происхождение и возраст клеточной линии, а также условия культивирования. Отдельную проблему составляет подбор клеток для тестирования аффинных препаратов, специфичных одновременно к двум или более биомаркерам. Предполагается, что использование подобных препаратов повысит эффективность визуализации и терапии злокачественных новообразований (Wei W. et al. ImmunoPET: Concept, Design, and Applications. 2020).

Создание рекомбинантных клеток для тестирования аффинных к биомаркерам препаратов способно обеспечить высокий уровень экспрессии биомаркеров, достаточный для выполнения качественного анализа. Например, для тестирования специфичности препаратов, аффинных к PSMA, наряду с постоянной опухолевой линией аденокарциномы простаты человека LNCaP используют рекомбинантные клетки PC-3 PSMA⁺ (PC3 PIP) (Ruggiero A. et al. Targeting the internal epitope of prostate-specific membrane antigen with 89Zr-7E11 immuno-PET. 2011; Nakajima T. et al. Targeted, activatable, in vivo fluorescence imaging of prostate-specific membrane antigen (PSMA) positive tumors using the quenched humanized J591 antibody-indocyanine green (ICG) conjugate. 2011; Frigerio B. et al. Full preclinical validation of the 123I-labeled anti-PSMA antibody fragment ScFvD2B for prostate cancer imaging. 2017; Banerjee S.R. et al. ¹⁷⁷Lu-labeled low-molecular-weight agents for PSMA-targeted radiopharmaceutical therapy. 2019; Umbricht C.A. et al. ⁴⁴Sc-PSMA-617 for radiotheragnostics in tandem with ¹⁷⁷Lu-PSMA-617-preclinical investigations in comparison with ⁶⁸Ga-PSMA-11 and ⁶⁸Ga-PSMA-617. 2017). Эти клетки созданы методом ретровирусной трансдукции на основе постоянной опухолевой линии аденокарциномы простаты человека, не экспрессирующей PSMA (Gong M.C. et al. Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membrane antigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines in response to prostate-specific membrane antigen. Neoplasia. 1999).

Существенным недостатком большинства способов оценки препаратов, аффинных к различным биомаркерам, является отсутствие системного подхода при создании рекомбинантных клеток для их тестирования. В качестве родительских линий для создания экспрессирующих биомаркеры рекомбинантных клеток используют линии опухолевых клеток человека без учета особенностей их культуральных свойств, таких как скорость роста, способность к клонированию, образование агрегатов (Kaighn M.E. et al. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). 1979). Следствием этого является необходимость адаптации условий создания рекомбинантных клеток для каждого конкретного случая, а также получаемые клетки не всегда обладают нужным набором качеств.

Описан способ оценки специфического связывания меченных радионуклидами аффинных биомолекул, основанный на использовании магнитных частиц в качестве носителей биомаркеров (Sharma S.K. et al. A rapid bead-based radioligand binding assay for the determination of target-binding fraction and quality control of radiopharmaceuticals. 2019). Такие частицы инкубируют с тестируемыми биомолекулами, отмывают от несвязавшихся компонентов и оценивают радиоактивность магнитных частиц, связавших биомолекулы. Преимущества метода состоят в быстроте исполнения и возможности стандартизации. К недостаткам метода относится изменение нативной конформации некоторых биомаркеров при их иммобилизации на магнитные частицы, что может приводить к ложноположительным и к ложноотрицательным результатам.

Наиболее близким к предлагаемому является «Способ скрининга противоопухолевых препаратов in vitro на многокомпонентной клеточной тест-системе», опубликованный в патенте РФ № 2695568C1, который взят нами в качестве прототипа.

Способ-прототип включает ко-культивирование опухолевых, стромальных и иммунных клеток на любом из известных аналогов внеклеточного матрикса с получением многокомпонентной клеточной ко-культуры (тест-системы). Затем к полученной многокомпонентной клеточной ко-культуре добавляют исследуемое вещество, проводят инкубирование, определяют противоопухолевую активность исследуемого вещества посредством анализа жизнеспособности многокомпонентной клеточной ко-культуры с использованием известных методов клеточной биологии с получением результатов о наличии либо об отсутствии противоопухолевой активности исследуемого вещества с последующим отбором перспективных веществ с высокой противоопухолевой активностью для дальнейших этапов доклинического скрининга либо отказа от дальнейшего скрининга исследуемого вещества в случае отсутствия у исследуемого вещества выраженной противоопухолевой активности.

Недостатком данного способа является невозможность стандартизации способа и сложность его воспроизведения, связанная с необходимостью проведения ко-культивирования первичных культур клеток разного гистогенеза.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа для одновременной высокочувствительной оценки специфичности связывания различных биомолекул in vitro, которые могут быть использованы для разработки эффективных лекарственных средств.

Этот результат достигается тем, что в известном способе оценки специфичности биологических молекул in vitro, включающем культивирование клеток с получением клеточной культуры, согласно изобретению, для получения последней используют линию клеток С6, затем проводят ретровирусную трансдукцию генов изучаемого биомаркера с последующей экспрессией его на мембране клеток, добавляют изучаемую биомолекулу, связывающуюся с биомаркером на мембране клеток, после чего оценку осуществляют любыми известными способами.

Занимаясь профессионально в течение ряда лет изучением клеточных биомаркеров, ассоциированных с различными заболеваниями, и созданием рекомбинантных клеток, а также учитывая недостатки известных методов, мы пришли к выводу, что необходимо найти новый легко воспроизводимый способ тестирования, который позволит выполнять одновременную оценку специфичности связывания нескольких биомолекул на стандартизированной системе.

При выборе клеток-реципиентов генетического материала для разработки способа тестирования специфичности биомолекул мы руководствовались несколькими требованиями. Во-первых, клетки, предназначенные для трансфекции, должны быть простыми в культивировании. Это значит, что для их поддержания и наращивания можно использовать стандартные коммерческие среды и сыворотку без дополнительных ингредиентов. Время удвоения клеток не должно быть долгим, т.е. культуры должны активно пролиферировать. Необходимо, чтобы клетки можно было легко пересевать. Наконец, нужно было, чтобы клетки-реципиенты обладали высокой эффективностью трансфекции. Соблюдение перечисленных условий было необходимо при создании рекомбинантных клеток, предназначенных для использования в качестве тест объектов in vitro.

Были проведены испытания культуральных свойств клеточных линий НЕК-293, DFK-3, LSP, A20, С6, 35, B-9, B-16, 4T1, SP2/0, CHO, LNCaP, EA.hy926, а также эффективности их трансфекции.

Среди испытанных клеток были суспензионные и монослойные культуры. Суспензионные культуры не требовали специальных условий культивирования и были удобны для пересева. Однако опыты показали низкую эффективность трансфекции этих клеток. При испытании монослойных культур мы столкнулись с тем, что клетки в ряде из них при пересевах с трудом отделялись от поверхности флакона и оставались собранными в агрегаты. Использование агрегированных клеток в тест-системах препятствовало получению воспроизводимых результатов.

После анализа всех вышеперечисленных результатов по подбору условий культивирования и трансфекции клеточных культур различного гистогенеза и видового происхождения сделано заключение, что линия клеток С6 является наилучшей культурой клеток в качестве реципиентов генов биомаркеров для разработки способа оценки специфичности биомолекул in vitro.

Клетки С6 мы выбрали и использовали в качестве реципиентов генетического материала при создании рекомбинантных клеток, экспрессирующих чужеродные биомаркеры. Клетки линии C6 отличаются простотой культивирования, высокой скоростью и плотностью роста, что обеспечивает быстрое и экономически выгодное получение клеточной массы для тестирования аффинных препаратов. Для культивирования клеток С6 используют любые стандартные ростовые среды (F12, DMEM, DMEM/F12, RPMI-1640 и т.д.) с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и стандартные условия: 37°C, 5% CO₂, влажную атмосферу. Клетки C6 растут в виде монослоя, для снятия с пластика используют стандартный раствор трипсина с версеном. Время удвоения клеточной популяции составляет 8 ч, плотность монослоя при 100% конфлюенте - 4×10⁵ клеток/см². Клетки обладают способностью к клонированию. При культивировании, а также при снятии с культуральной поверхности клетки не образуют агрегатов. Перед проведением трансдукции необходимо подтверждение отсутствия контаминации клеточной культуры микоплазмой, бактериями, грибами.

Для создания рекомбинантных клеток на основе клеток C6 гены биомаркеров получают из первичных или иммортализованных клеток человека, экспрессирующих эти биомаркеры. Альтернативно они могут быть получены методом химического синтеза.

Нами было испытано несколько генноинженерных подходов для создания рекомбинантных клеток. Это метод ретровирусной трансдукции и метод трансфекции с использованием транспозонной системы. Оптимальные воспроизводимые результаты с использованием генов разных биомаркеров были получены только при использовании ретровирусных Q векторов (Julius M.A. et al. Q vectors, bicistronic retroviral vectors for gene transfer. 2000). В эти векторы мы клонировали гены биомаркеров длиной до 4-5 тыс. пар нуклеотидов. Это позволило создать рекомбинантные клетки, экспрессирующие различные по размеру мембранные биомаркеры В структуру векторов входили гены устойчивости к антибиотикам, которые встраивались в геном рекомбинантной клетки наряду с геном биомаркера. Q векторы отличались наличием гена устойчивости к пуромицину в pQCXIP и генецитину в pQCXIN, гигромицину в pQCXIH. Выращивание трансдуцированных клеток в присутствии селективного антибиотика позволило выживать только клеткам, включившим в себя гены биомаркеров. В результате селекции мы получали культуры рекомбинантных клеток, стабильно экспрессирующих биомаркеры. При получении рекомбинантных клеток, несущих одновременно несколько биомаркеров, мы использовали контрансфекцию клеток С6 несколькими векторами, каждый из которых включал ген одного биомаркера и ген одного из антибиотиков. Отбор трансдуцированных клеток мы осуществляли в присутствии смеси нескольких соответствующих антибиотиков.

Для оценки экспрессии биомаркера мы использовали рекомбинантные живые клетки из культуры, или ex tempore размороженные, или фиксированные. Для контроля специфичности - родительские нативные клетки С6, не экспрессирующие биомаркер. Количество клеток, необходимое для анализа, определяли с помощью электронного счетчика частиц или визуального подсчета в гемоцитометре. Анализ проводили с использованием фосфатно-солевого буфера (рН 7,4), содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% NaN₃, в качестве разводящего и отмывающего раствора. К монослою или суспензии клеток вносили раствор тестируемых аффинных биомолекул в разных концентрациях. Инкубировали в течение 1-2 ч (в зависимости от свойств биомолекул) при температуре +4°С. Затем раствор удаляли и отмывали клетки от несвязавшихся компонентов. Специфичность биомолекул, конъюгированных с флуорохромами, изотопами или ферментами, оценивали с помощью соответствующих методов (ПЦР, проточная цитофлуометрия, микроскопическая визуализация и вестерн-блоттинг). Для оценки немеченных аффинных биомолекул использовали специфичные для них меченные вторичные компоненты.

Таким образом, заявленные нами отличительные признаки, позволили провести высокоточную оценку специфичности связывания различных аффинных биомолекул in vitro и стандартизировать ее, что может быть использовано для разработки эффективных лекарственных средств.

Способ по сравнению с известными аналогами имеет ряд существенных преимуществ, основным из которых является одновременная высокоточная оценка специфичности связывания различных аффинных биомолекул. Предлагаемый способ легко воспроизводим для специалиста в данной области.

Способ оценки специфичности биологических молекул in vitro разработан в лаборатории гибридомной технологии и отделении циклотронных радиофармпрепаратов ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» МЗ РФ. К настоящему времени прошли апробацию 15 вариантов биомолекул, в том числе би- и полиспецифичных, с положительным результатом.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для оценки in vitro специфичности молекул, аффинных к биомаркерам клеточных мембран и создаваемых на основе антител, фрагментов антител, аптамеров или альтернативных каркасных белков. Представлен способ, который заключается в культивирование клеток с получением клеточной культуры, на основе единой линии клеток С6. Затем проводят ретровирусную трансдукцию генов изучаемого биомаркера с последующей экспрессией его на мембране клеток, добавляют изучаемую биомолекулу, связывающуюся с биомаркером на мембране клеток, после чего оценку осуществляют любыми известными способами. Способ обеспечивает одновременную высокоточную оценку специфичности связывания различных аффинных биомолекул.

Способ оценки специфичности биологических молекул in vitro, включающий культивирование клеток с получением клеточной культуры, отличающийся тем, что для получения последней используют единую линию клеток С6, затем проводят ретровирусную трансдукцию генов изучаемого биомаркера ретровирусными векторами группы Q с последующей экспрессией его на мембране клеток, добавляют изучаемую биомолекулу, связывающуюся с биомаркером на мембране клеток, после чего оценку осуществляют любыми известными способами.