СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 G01N33/574 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6886 

Описание патента на изобретение RU2806518C1

Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины и может быть использовано при разработке метода оценки риска рака предстательной железы (РПЖ), на этапе решения вопроса о целесообразности проведения диагностической биопсии или в ходе динамического наблюдения пациентов с пограничными значениями уровня концентрации сывороточного маркера ПСА. Рак предстательной железы (РПЖ) - это злокачественное образование, развивающиеся из эпителиальных клеток предстательной железы. Рак предстательной железы является четвертым в степени по распространенности среди других онкологических заболеваний, уступая раку молочной железы, легкого и прямой кишки. Первые этапы развития заболевания происходят бессимптомно, поэтому в большинстве случаев диагноз РПЖ ставится на стадии местного распространения процесса. Прогноз зависит от стадии и степени злокачественности заболевания. На первой стадии, при своевременном лечении десятилетняя выживаемость составляет более 90%, при второй - 80%, при третьей - 40%, при четвертой - 15%. Поэтому актуальными являются задачи скрининга и ранней диагностики РПЖ [1]. В настоящее время в основе диагностики РПЖ лежит комплекс исследований: определение уровня простатического специфического антигена (ПСА) в плазме или сыворотке крови, пальцевое ректальное исследование (ПРИ) и трансректальное ультразвуковое исследование предстательной железы (ТРУЗИ). В случае подозрения на РПЖ, на основании хотя бы одного из перечисленных исследований, комплекс диагностических подходов расширяется и может включать: биопсию предстательной железы с последующим гистологическим исследованием, эхо-допплерография предстательной железы, магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ). Проблематичным аспектов является низкая диагностическая специфичность ПСА сыворотки, что ведет к необходимости проведения дополнительных, инвазивных и/или дорогостоящих, диагностических исследований. Для решения этой проблемы разрабатываются и внедряются в практику новые технологии «жидкостной биопсии». Например, Индекс здоровья простаты (Prostate health index - PHI) - разработанный компанией Beckman Coulter (Брея, США) тест: на основе определения в крови уровня общего ПСА, свободного ПСА и -2проПСА рассчитывается величина PHI, изменение которого может указывать на наличие РПЖ [2]. Схожая технология реализована компания ОРКО Health (Майами, США): расчет параметра 4k-score проводится по уровням четырех маркеров: общий ПСА, свободный ПСА, интактный ПСА и калликреин-2 (hK2) [3].

Внеклеточные нановезикулы (ВНВ) - являются новым перспективным классом онкомаркеров, который имеет перспективы применения для диагностики различных онкологических заболеваний [4], включая РПЖ [5]. ВНВ - это мембранные нано-везикулы (80-130 нм), которые секретируются всеми клетками многоклеточных организмов во внеклеточное пространство. В состав ВНВ входят факторы трансляции, ферменты метаболизма, протеолитические белки шапероны, различные типы нуклеиновых кислот. Некоторые белки, такие как белки теплового шока (HSP70 и HSP90) и тетраспанины (CD9, CD63, CD81) характерны для нановезикул, независимо от типа клеток, из которых они секретируются. Мембранные белки, белки клеточной адгезии и протеогликаны в составе везикулярной мембраны имеют состав аналогичный или близкий к составу клеток, секретирующих везикулы (клеток-продуцентов). Этот феномен позволяет установить клеточное происхождение специфических фракций ВНВ в составе общей популяции. Кроме того, состав молекул РНК (мРНК и/или микроРНК), которые попадают в везикулы в процессе их образования из клеточной цитоплазмы, также отражает тканевую принадлежность или состояние клеток-продуцентов.

МикроРНК - это класс малых регуляторных молекул РНК, которые выполняют функцию контроля стабильности информационных РНК и эффективности синтеза белковых молекул (трансляции) в клеточной цитоплазме. Состав (или «профиль» микроРНК в клетках различных тканей имеет характерные особенности, развитие различных патологических состояний (включая злокачественную трансформацию) сопровождается характерными изменениями состава внутриклеточных микроРНК. Этот феномен имеет очевидный диагностический потенциал, но предполагает получение и анализ биопсийного материала [6]. Внеклеточные функции микроРНК пока исследованы слабо, но различные типы этих молекул могут быть детектированы в биологических жидкостях в свободном виде (циркулирующие микроРНК), в составе комплексов с рибонуклеопротеинами (белки Argonaute, липопротеины высокой плотности) или в составе ВНВ. МикроРНК в составе ВНВ представляют интерес в качестве диагностических маркеров по двум основным причинам. Во-первых, микроРНК в составе ВНВ сохраняет биохимическую стабильность. Во-вторых, клеточные или тканевые особенности везикулярной поверхности позволяет выделить специфические (например, ткане-специфические) популяции ВНВ. Показано, что профиль микроРНК в составе специфической фракции ВНВ может отражать состав микроРНК соответствующий специфической популяции клеток [7-9]. Этот феномен определят высокий диагностический потенциал методов анализа микроРНК в составе ВНВ определенного происхождения. Так, выделение специфических популяций ВНВ, секретируемых специфическими клетками (например, злокачественными клетками или клетками предстательной железы), и последующий анализ биохимических компонентов этих ВНВ (например, микроРНК) является перспективным методом диагностики онкологических заболеваний, в частности, РПЖ.

Известно несколько примеров патентной защиты этой идеи или способов ее реализации, которые могут быть рассмотрены в качестве аналогов представленного способа.

US 7897356 B2 (Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH): Методы и системы использования экзосом для определения фенотипа / Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes - патент, зарегистрированный в 2012 на территории ряда стран (исключая РФ) охраняет приоритет использования определенного типа ВНВ, а именно экзосом, в рамках диагностики различных заболеваний (более 50 нозологий, включая РПЖ), путем выделения экзосом из всех типов биологических жидкостей (более 20 вариантов, включая плазму крови) и анализа различных биохимических компонентов (более 1000 конкретных молекул, включая микро-РНК miR-205-5p и miR-375-3р). В патенте не описано конкретных диагностических технологий, патент защищает право использования экзосом в качестве объекта анализа с целью медицинской диагностики в целом на территории ряда стран, исключая РФ.

Тест-система для диагностики или/и оценки риска развития/прогрессии РПЖ (Diagnostic Test: ExoDx Prostate - IntelliScore), основанная на выделении и анализе экзосом мочи, была разработана дочерней компанией Exosome Diagnostics GmbH. Тест-система проходила клинические испытания (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03235687). С учетом опубликованных данных, результат анализа может быть полезен при решении вопроса о (1) целесообразности проведения биопсии у пациентов, значение уровня ПСА плазмы которых незначительно повышено или соответствует так называемой «серой зоне» (2-10 нг/мл) [10] и/или (2) проведении хирургического лечения (радикальной простатэктомии) у пациентов с подтвержденным диагнозом РПЖ [11]. От разработанного способа технология ExoDx Prostate - IntelliScore отличается тем, что, во-первых, в качестве источника ВНВ используется моча (а не плазма); во-вторых, исследуемый образец представляет собой тотальную популяцию ВНВ (а не специфическую (PSMA(+)/AMACR(+)) фракцию везикул; в-третьих, проводится анализ трех молекул информационной РНК -продуктов транскрипции генов ERG, PCA3, SPDEF (а не двух молекул микроРНК miR-205-5p и miR-375-3р).

US 20130196355 A1 (Exosomics Siena SpA): Метод и набор для количественного и качественного анализа экзосом для диагностики рака предстательной железы и гиперплазии предстательной железы / Method and a kit to quantify and qualify exosomes for diagnosis of prostate cancer and prostate hyperplasia - патент, зарегистрированный в 2015 на территории ряда стран (исключая РФ) охраняет приоритет использования анализа экзосом плазмы в рамках диагностики РПЖ, путем полуколичественной оценки PSA-позитивных везикул с помощью проточной цитометрии или иммуно-ферментного анализа. Технология пока не была реализована в виде диагностической тест-системы. От разработанного способа технология отличается тем, что, результатом ее применения является полуколичественная оценка специфической популяции экзосом (а не выделение такой популяции и последующий анализа микроРНК), во-вторых, в качестве маркеров используются везикулярные белки Rab5 и PSA (а не PSMA и AMACR), в-третьих, в качестве молекул-лигандов используются антитела (а не ДНК-аптамеры).

US 10494676 В2 (Albert Ludwigs Universitaet Freiburg / Karlsruher Institut fuer Technologie KIT): Процесс диагностики рака с помощью экзосом / Process for the diagnosis of cancer by using exosomes - патент зарегистрированный в 2013 на территории ряда стран (исключая РФ) охраняет приоритет использования технологии анализа различных сплайсиг-форм мРНК (матричной РНК) гена ARG2 в образце экзосом, выделенных из плазмы крови или мочи, в рамках диагностики различных онкологических заболеваний, включая РПЖ. От разработанного способа технология отличается тем, что, во-первых, исследуемый образец представляет собой тотальную популяцию ВНВ мочи или плазмы (а не специфическую (PSMA(+)/AMACR(+)) фракцию везикул, во-вторых, технология предполагает анализа мРНК гена ARG2 (а не молекул микроРНК miR-205-5p и miR-375-3р).

Задачей изобретения являлось создания метода диагностики РПЖ на основе анализа микроРНК в простат-специфической фракции ВНВ плазмы.

Теоретической основой изобретения являлось предположение о том, что в состав мембраны ВНВ, секретируемых клетками предстательной железы, входят простат-специфические белки; а состав микроРНК в клетках предстательной железы и, соответственно в ВНВ, секретируемых этими клетками изменяется в случае злокачественной трансформации этих клеток, или развития РПЖ. Задача изобретения решалась путем разработки метода выделения фракции ВНВ, синтезируемой клетками предстательной железы, и последующего анализа молекул микроРНК, изменение экспрессии которых ассоциировано с развитием РПЖ.

В качестве технического прототипа способа выделения ВНВ может быть рассмотрена технология выделения тотальной популяции ВНВ плазмы с помощью супер-парамагнитных частиц (СПМЧ), поверхность которых «функционализирована» ДНК-аптамерами (патент РФ 2741638), аффинно связывающих маркер CD63, предположительно присутствующий на поверхности всех ВНВ (экзосом). В качестве идейных прототипов разработанного способа могут быть рассмотрены (а) метод выделения тироид-специфичных ВНВ и анализа маркерных микроРНК в выделенной популяции ВНВ с целью диагностики фолликулярного рака щитовидной железы [9], и (б) метод выделения простат-специфичных ВНВ и анализа маркерных микроРНК в выделенной популяции ВНВ с целью диагностики РПЖ [7, 8]. В первом примере в качестве молекулярного лиганда, связывающего специфические ВНВ, использовались антитела к тироид-специфичному белку ТРО (thyroid peroxidase). Во втором примере выделение простат-специфичных везикул проводилось с помощью ДНК-аптамера, для которого характерно аффинное взаимодействие с белком PSMA (prostate-specific membrane antigen). Недостатком представленных выше технологий являлось использование одного типа молекулы - лиганда, что не обеспечивало достаточной эффективности выделения специфических ВНВ и, соответственно, снижало диагностический потенциал метода в целом.

В отличии от прототипов, в разработанном способе суперпарамагнитные частицы «функционализированы» пятью типами ДНК-аптамеров, которые аффинно связывают различные эпитопы простат-специфичных мембранных белков PSMA (prostate specific membrane antigen) и AMACR (α-methyl acyl-CoA racemase). Это позволило эффективно «связывать» специфическую популяция ВНВ, секретируемых преимущественно клетками предстательной железы. Связь поверхности супер-парамагнитных частиц и ДНК - аптамеров (функционализация) осуществляется с помощью технологии «клик-химии» - реакции азид-алконового циклоприсоединения. Далее разработанный способ предполагает количественный анализ двух молекул микроРНК (miR-205-5p и miR-375-3р) в материале выделенных ВНВ с помощью последовательных реакций обратной транскрипции и ПНР.

Технический результат изобретения - способ уточняющей диагностики РПЖ - реализуется путем полуколичественного анализа двух молекул микроРНК (miR-205-5p и miR-375-3р) в материале простат-специфичных (PSMA(+) и AMACR(+)) ВНВ плазмы.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, схематично представленном на Фиг. 1:

1. Сбор венозной крови (5-6 мл) в вакутейнер с EDTA. Форменные элементы отделяются от плазмы центрифугированием 15 минут 1500g, плазма перемещается в чистую пробирку, из плазмы удаляется клеточный дебрис, фибриллы плазменных белков и крупные везикулы путем последовательного центрифугирования по 10 минут при ускорении 300g, 1500g, 2500g. Супернатант фильтруется через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм Minisart High Flow (Sartorius, Германия), после чего очищенная плазма перемещается в чистую пробирку.

2. Выделение тотальной популяции ВНВ плазмы объемом 1,5 мл может быть проведено любым способом, например, с помощью ультрацентрифугирования (патент RU 2556825 C1) или с помощью двухфазной полимерной системы (патент RU 2741776). Тотальную популяцию ВНВ, выделенных любым способом, ресуспендируют в 100 мкл фосфатно-солевого буфера.

3. Создание СПМЧ, поверхность которых функционализирована ДНК - аптамерами с помощью технологии «клик-химии» - реакции азид-алконового циклоприсоединения. Для этого используют СПМЧ размером 0,8-1 мкм, поверхность которых модифицирована азидными группами (-N3), например Azide Magnetic Beads (Click Chemistry Tools, США) и ДНК - аптамеры, последовательности которых представлены в Таблице 1, по 5' концу молекулы ДНК аптамеров модифицированы дибензоциклооктином (ДБЦО). Синтез ДНК - аптамеров проводится стандартным способом, очистка высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Частицы (1 мг/мл) инкубируются с ДНК - аптамерами (100 пМоль) в 100 мкл фосфатно-солевого буфера 3 часа при комнатной температуре. Молекула ДБЦО на 5' конце аптамеров вступает в реакцию азид-алконового циклоприсоединения, промотируемого напряжением цикла с азидной группой на поверхности СПМЧ, благодаря чему образуется комплекс СПМЧ и аптамеров (СПМЧ-Апт), который способен связывать молекулы PSMA и AMACR в составе мембран везикул, секретируемых клетками предстательной железы. СПМЧ с функционализированной ДНК-аптамерами поверхностью отмываются дважды фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с использованием магнитного штатива.

4. Для выделения простат-специфичной фракции везикул 5 мкл суспензии СПМЧ инкубируют в 200 мкл блокирующего буфера, например, 0.2% раствора I-Block™ (Invitrogen, США) 1 час при +4°С, при постоянном перемешивании, отмывают 3 раза в 200 мкл ФСБ и осаждают на магнитном штативе. К полученному осадку из функционализированных и блокированных СПМЧ добавляют 100 мкл выделенной ранее общей популяции ВНВ, инкубируют ночь при +4°С при постоянном перемешивании. Образовавшийся комплекс СПМЧ-Апт-ВНВ отмывают дважды в ФСБ и осаждают на магнитном штативе. Оценка эффективности связывания и выделения из тотальной популяции ВНВ плазмы фракции простат-специфических BHB-PSMA(+)/AMACR(+), может быть оценена с использованием проточной цитометрии. При этом фиксированные к поверхности СПМЧ везикулы окрашиваются с помощью, например, флуоресцентно-меченных антител к пан-везикулярным маркерам CD63 или CD9. Пример визуальной оценки BHB-PSMA(+)/AMACR(+), выделенных из тотальной популяции ВНВ плазмы здорового донора мужчины, представлен на Фиг. 2. Согласно полученным результатам, на поверхности 23% СПМЧ фиксированы ВНВ, интенсивность флуоресцентного сигнала отражает количество фиксированных везикул.

5. Выделение РНК и анализ микроРНК. Осадок используют для выделения микроРНК любым доступным способом, например, с помощью технологии протеолиза / липолиза (набор RNAGEM, производства компании MicroGEM, Новая Зеландия) или технологии твердофазной экстакции (Набор для выделения суммарной РНК и микроРНК из клеток и тканей, производства компании БиоЛабМикс, РФ) в соответствии с протоколами производителей. Выделенный раствор РНК используют для анализа концентрации маркерных молекул микроРНК miR-205-5p и miR-375-3р методом обратной транскрипции и последующий полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Анализ может быть проведен любым доступным набором реагентов для анализа miR-205-5p и miR-375-3р, например, miRCURY LNA miRNA PCR Assays (Qiagen, США) или ALMIR (Альгимед Техно, Беларусь).

6. Анализ результатов проводится путем определения значений пороговых циклов (Ct) для двух молекул при фиксированной позиции «пороговой» линии, и расчета соотношения относительных концентраций miR-205-5p и miR-375-3р по формуле:

где Ct(205) - значение порогового цикла miR-205-5p

Ct(375) - значение порогового цикла miR-375-3р

Значение полученного показателя прВНВ-205/375 < 1 соответствует диагнозу РПЖ, значение полученного показателя прВНВ-205/375 ≥ 1 соответствует нормальному состоянию предстательной железы. Диагностическая чувствительность разработанного способа уточняющей диагностики - 97,22%, специфичность - 77,78%.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Анализа микроРНК (miR-205-5p и miR-375-3р) из специфической фракции ВНВ, секретируемых клетками предстательной железы, у пациентов к РПЖ и здоровых доноров.

Образцы плазмы были получены от 36 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом рака предстательной железы. Средний возраст пациентов - 65 (диапазон 49-74 года), показатель Глисона - в диапазоне 6-9, уровень ПСА: 4,5-82,0 нг/мл. Образцы венозной крови были получены от 18 здоровых доноров, возрастом 20-54 года для формирования группы контроля. Плазма была приготовлена в соответствии с разработанным протоколом путем последовательного центрифугирования по 10 минут при ускорении 300g, 1500g, 2500g. Тотальная популяция ВНВ была выделена методом двухфазной полимерной системы [16]. Для этого в пробирку 2 мл добавили 0,0525 г Декстрана 450-650 кДа (Sigma-Aldrich, США) и 0,0255 г Полиэтиленгликоля 20 кДа (Sigma-Aldrich, США), внесли 1,5 мл плазмы, перемешали и растворили в течение часа при +4°С. Одновременно приготовили промывочный раствор путем растворения аналогичного количества полимеров в 1,5 мл ФСБ. Разделение смеси полимеров в плазме на две фазы провели центрифугированием 10 мин 1000g при 4°С, после чего верхнюю фазу удалили, а нижнюю фазу ресуспендировали в 1,4 мл ранее приготовленного промывочного раствора. Растворы перемешали и снова центрифугируют при 10 мин 1000g 4°С. Супернатант удалили и осадок ресуспендировали в 100 мкл ФСБ. В соответствии с разработанным способом приготовили СПМЧ-Апт и провели выделение простат-специфичной фракции ВНВ (BHB-PSMA(+)/AMACR(+)). РНК из BHB-PSMA(+)/AMACR(+) выделили стандартным методом с использованием коммерческого набора RNAGEM согласно протоколу производителя. В каждом полученном образце был проведен анализ концентрации mir-205-5p и mir-375-3р с помощью ОТ-ПЦР, для этого использовали соответствующие наборы реагентов серии ALMIR (Альгимед Техно, Минск). Расчет диагностического параметра прВНВ-205/375 для каждого биологического образца, включенного в исследование, провели по формуле прВНВ-205/375=Ct(205)/Ct(375).

Для оценки параметров диагностической значимости разработанного способа в качестве референсного метода использовали гистологическое исследование. На Фиг. 3А представлены результаты оценки параметра прВНВ-205/375 в группах доноров (n. 18) и пациентов с РПЖ (n. 36). Статистическая значимость сравнения данных групп рассчитывалась методом Манна-Уитни (р<0,0005). На Фиг. 3Б приведен график ROC-кривой: площадь под кривой (area under curve, AUC - комплексный показатель диагностической значимости метода) = 0,921. Также были рассчитаны показатели диагностической значимости: чувствительность - 97,22%, специфичность - 77,78%, позитивное предиктивное значение - 89,47%, негативное предиктивное значение - 93,52%, общая точность - 90,61%.

Пример 2.

Анализа микроРНК (miR-205-5p и miR-375-3р) из специфической фракции ВНВ, секретируемых клетками предстательной железы, у пациента повышенным уровнем ПСА плазмы и отрицательным результатом диагностической биопсии.

Пациент С., 68 лет, жалоб нет, при профилактическом обследовании ПСА - 25 нг/мл, проведена диагностическая биопсия с последующим гистологическим исследованием материала (заключение: морфологические изменения, соответствующие картине доброкачественной гиперплазии предстательной железы).

Для оценки ситуации был определен параметр прВНВ-205/375, согласно заявленному методу. Полученный результат: прВНВ-205/375 = 1,32, что соответствует отсутствию признаков злокачественной трансформации клеток предстательной железы. Пациенту рекомендовано наблюдение у уролога и контроль уровня ПСА в динамике.

Пример 3.

Анализа микроРНК (miR-205-5p и miR-375-3р) из специфической фракции ВНВ, секретируемых клетками предстательной железы, у пациента уровнем ПСА - 5.5 нг/мл («серая зона»).

Пациент К., 54 года, жалоб нет, при профилактическом обследовании ПСА - 4.5 нг/мл, повторное исследование через 6 месяцев - 5,3 нг/мл. Заключение транс-уретрального ультразвукового исследования предстательной железы (ТРУЗИ): УЗИ признаков патологических изменений не выявлено.

Для решения вопроса о целесообразности проведения диагностической биопсии был определен параметр прВНВ-205/375, согласно заявленному методу. Полученный результат: прВНВ-205/375 = 0.91, что указывает на вероятность злокачественной трансформации клеток предстательной железы. Пациенту проведена диагностическая биопсия с последующим гистологическим исследованием материала (заключение: простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН) высокой степени (high-grade prostatic intraepithelial neoplasia, HGPIN). Данное состояние ткани предстательной железы представляет собой предраковый процесс и является наиболее значимым прогностическим маркером развития РПЖ [17]. Пациенту рекомендована консультация онколога для определения тактики лечения.

Источники информации

1. Shieh, Y.; Eklund, М.; Sawaya, G.F.; Black, W.C.; Kramer, B.S.; Esserman, L.J. Population-based screening for cancer: Hope and hype. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2016, 13.

2. Loeb, S.; Catalona, W.J. The Prostate Health Index: A new test for the detection of prostate cancer. Ther. Adv. Urol. 2014, 6.

3. Zappala, S.M.; Dong, Y.; binder, V.; Reeve, M; Sjoberg, D.D.; Mathur, V.; Roberts, R.; Okrongly, D.; Newmark, J.; Sant, G.; et al. The 4Kscore blood test accurately identifies men with aggressive prostate cancer prior to prostate biopsy with or without DRE information. Int. J. Clin. Pract. 2017, 71, doi:10.1111/ijcp.12943.

4. Czystowska-Kuzmicz, M.; Whiteside, T.L. The potential role of tumor-derived exosomes in diagnosis, prognosis, and response to therapy in cancer. Expert Opin. Biol. Ther. 2021, 21, 241-258, doi:10.1080/14712598.2020.1813276.

5. Samsonov, R.; Shtam, Т.; Burdakov, V.; Glotov, A.; Tsyrlina, E.; Berstein, L.; Nosov, A.; Evtushenko, V.; Filatov, M.; Malek, A. Lectin-induced agglutination method of urinary exosomes isolation followed by mi-RNA analysis: Application for prostate cancer diagnostic. Prostate 2016, 76, doi:10.1002/pros.23101.

6. Siddiqua, A.; Kousar, S.; Jamil, A.; Tabassum, R.; Mehmood, Т.; Shafiq, N. MicroRNA: A Signature for Cancer Diagnostics. In Current Cancer Treatment; IntechOpen, 2020.

7. Zabegina, L.; Nazarova, I.; Nikiforova, N.; Slyusarenko, M.; Sidina, E.; Knyazeva, M.; Tsyrlina, E.; Novikov, S.; Reva, S.; Malek, A. A New Approach for Prostate Cancer Diagnosis by miRNA Profiling of Prostate-Derived Plasma Small Extracellular Vesicles. Cells 2021, 10, 2372, doi:10.3390/cellsl0092372.

8. Zabegina, L.M.; Nikiforova, N.S.; Nazarova, I.V.; Knyazeva, M.S.; Tsyrlina, E.V.; Reva, S.A.; Nosov, A.K.; Malek, A.M. Analysis of miRNAs in the PSMA-positive fraction of plasma nano-sized extracellular vesicles in patients with prostate cancer. Cancer Urol. 2022, 17, 65-75, doi:10.17650/1726-9776-2021-17-4-65-75.

9. Zabegina, L.; Nazarova, I.; Knyazeva, M.; Nikiforova, N.; Slyusarenko, M.; Titov, S.; Vasilyev, D.; Sleptsov, I.; Malek, A. MiRNA let-7 from TPO(+) Extracellular Vesicles is a Potential Marker for a Differential Diagnosis of Follicular Thyroid Nodules. Cells 2020,9, 1917, doi:10.3390/cells9081917.

10. Tutrone, R.; Donovan, M J.; Torkler, P.; Tadigotla, V.; McLain, Т.; Noerholm, M.; Skog, J.; McKiernan, J. Clinical utility of the exosome based ExoDx Prostate(IntelliScore) EPI test in men presenting for initial Biopsy with a PSA 2-10 ng/mL. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2020, 23, 607-614, doi:10.103 8/s41391-020-0237-z.

11. Kretschmer, A.; Tutrone, R.; Alter, J.; Berg, E.; Fischer, C.; Kumar, S.; Torkler, P.; Tadigotla, V.; Donovan, M.; Sant, G.; et al. Pre-diagnosis urine exosomal RNA (ExoDx EPI score) is associated with post-prostatectomy pathology outcome. World J. Urol. 2022, 40, 983-989, doi:10.1007/s00345-022-03937-0.

12. Li, В.; Liu, C.; Pan, W.; Shen, J.; Guo, J.; Luo, Т.; Feng, J.; Situ, В.; An, Т.; Zhang, Y.; et al. Facile fluorescent aptasensor using aggregation-induced emission luminogens for exosomal proteins profiling towards liquid biopsy. Biosens. Bioelectron. 2020, 168, doi:10.1016/j.bios.2020.112520.

13. Almasi, F.; Gargari, S.L.M.; Bitaraf, F.; Rasoulinejad, S. Development of a single stranded DNA aptamer as a molecular probe for LNCap cells using cell-SELEX. AvicennaJ. Med. Biotechnol. 2016, 8.

14. Jin, D.; Yang, F.; Zhang, Y.; Liu, L.; Zhou, Y.; Wang, F.; Zhang, G.J. ExoAPP: Exosome-Oriented, Aptamer Nanoprobe-Enabled Surface Proteins Profiling and Detection. Anal. Chem. 2018, 90, doi:10.1021/acs.analchem.8b03959.

15. Yang, D.K.; Chen, L.C.; Lee, M.Y.; Hsu, C.H.; Chen, C.S. Selection of aptamers for fluorescent detection of alpha-methylacyl-CoA racemase by single-bead SELEX. Biosens. Bioelectron. 2014, 62, doi:10.1016/j.bios.2014.06.027.

16. Slyusarenko, M.; Nikiforova, N.; Sidina, E.; Nazarova, I.; Egorov, V.; Garmay, Y.; Merdalimova, A.; Yevlampieva, N.; Gorin, D.; Malek, A. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation. Polymers (Basel). 2021, 13, 458, doi:10.3390/polym13030458.

17. Киселев, В.И.; Друх, В.М.; Кузнецов, И.Н.; Муйжнек, Е.Л. Андрианова, Е.А. Андреева, Ю.Ю.; Аллина, Д.О.; Лоран, О.Б.; Франк, Г.А. Морфологические изменения в ткани предстательной железы у пациентов с простатической интраэпителиальной неоплазией в процессе химиопрофилактики с помощью новой фармацевтической композиции дииндолилметана. Экспериментальная и клиническая урология 2015, 4, 54-58.

Похожие патенты RU2806518C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2016
  • Шкурников Максим Юрьевич
  • Галатенко Владимир Владимирович
  • Князев Евгений Николаевич
  • Тоневицкий Александр Григорьевич
RU2646790C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2016
  • Шкурников Максим Юрьевич
  • Галатенко Владимир Владимирович
  • Князев Евгений Николаевич
  • Тоневицкий Александр Григорьевич
RU2647433C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МИКРОРНК ПЛАЗМЫ КРОВИ 2016
  • Шкурников Максим Юрьевич
  • Саматов Тимур Рустэмович
  • Князев Евгений Николаевич
  • Алексеев Борис Яковлевич
  • Тоневицкий Александр Григорьевич
RU2618409C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОСОМ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ 2020
  • Никифорова Надежда Станиславовна
  • Сидина Елена Игоревна
  • Назарова Инга Валерьевна
  • Слюсаренко Мария Александровна
  • Забегина Лидия Михайловна
  • Князева Маргарита Сергеевна
  • Малек Анастасия Валерьевна
RU2741638C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ДИСПЛАЗИЙ 2021
  • Князева Маргарита Сергеевна
  • Смирнова Ольга Алексеевна
  • Забегина Лидия Михайловна
  • Сидина Елена Игоревна
  • Слюсаренко Мария Александровна
  • Назарова Инга Валерьевна
  • Никифорова Надежда Станиславовна
  • Берлев Игорь Викторович
  • Малек Анастасия Валерьевна
RU2788860C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА 2021
  • Назарова Инга Валерьевна
  • Никифорова Надежда Станиславовна
  • Сидина Елена Игоревна
  • Слюсаренко Мария Александровна
  • Забегина Лидия Михайловна
  • Князева Маргарита Сергеевна
  • Служев Максим Иванович
  • Семиглазова Татьяна Юрьевна
  • Семиглазов Владислав Владимирович
  • Малек Анастасия Валерьевна
RU2772203C1
Способ удаления внеклеточных нано-везикул из плазмы крови с помощью ковалентно иммобилизированных ДНК-аптамеров 2022
  • Малек Анастасия Валерьевна
RU2806434C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКЗОСОМ КРОВИ 2014
  • Тамкович Светлана Николаевна
  • Лактионов Павел Петрович
  • Тутанов Олег Сергеевич
  • Власов Валентин Викторович
RU2571507C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА ЭКЗОСОМ 2022
  • Ященок Алексей Михайлович
  • Чернышёв Василий Сергеевич
  • Герман Сергей Викторович
  • Шульга Алексей Анатольевич
  • Деев Сергей Михайлович
  • Горин Дмитрий Александрович
  • Коновалова Елена Валерьевна
RU2788198C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛИМФОМЫ ХОДЖКИНА 2021
  • Слюсаренко Мария Александровна
  • Сидина Елена Игоревна
  • Назарова Инга Валерьевна
  • Никифорова Надежда Станиславовна
  • Забегина Лидия Михайловна
  • Князева Маргарита Сергеевна
  • Рудаковская Полина Григорьевна
  • Горин Дмитрий Александрович
  • Шалаев Сергей Александрович
  • Филатова Лариса Валентиновна
  • Малек Анастасия Валерьевна
RU2782326C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 806 518 C1

Реферат патента 2023 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для определения риска злокачественной трансформации клеток предстательной железы. Из плазмы крови выделяют простат-специфическую фракцию внеклеточных нановезикул (прВНВ). Проводят полуколичественный анализ концентраций mir-205-5p и mir-375-3р в материале выделенных прВНВ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Рассчитывают соотношение относительных концентраций mir-205-5p и mir-375-3р по формуле прВНВ-205/375=Ct(205)/Ct(375). При значении показателя прВНВ-205/375<1 определяют риск злокачественной трансформации клеток предстательной железы. При значении прВНВ-205/375>1 определяют отсутствие риска. Способ обеспечивает эффективное определение риска злокачественной трансформации клеток предстательной железы путем полуколичественного анализа mir-205-5p и mir-375-3р в материале прВНВ плазмы. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 806 518 C1

1. Способ определения риска злокачественной трансформации клеток предстательной железы, основанный на последовательных процедурах выделения внеклеточных нановезикул (ВНВ) плазмы крови, выделения простат-специфической фракции ВНВ и полуколичественного анализа концентраций маркерных молекул микроРНК в материале выделенных ВНВ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, включающего определение значений пороговых циклов (Ct) для двух молекул микроРНК: mir-205-5p и mir-375-3р и расчет соотношения относительных концентраций mir-205-5p и mir-375-3р по формуле

прВНВ-205/375=Ct(205)/Ct(375),

где Ct(205) - значение порогового цикла mir-205-5p,

Ct(375) - значение порогового цикла mir-375-3р,

и при значении полученного показателя прВНВ-205/375 < 1 определяют риск злокачественной трансформации клеток предстательной железы, при значении прВНВ-205/375 > 1 определяют отсутствие риска злокачественной трансформации клеток предстательной железы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выделения простат-специфической фракции ВНВ используют супер-парамагнитные микрочастицы (СПМЧ), функционализированные ДНК-аптамерами, которые связывают молекулы PSMA и AMACR на поверхности ВНВ, секретируемых клетками предстательной железы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2806518C1

ЭКЗОСОМАЛЬНЫЕ БИОМАРКЕРЫ 2015
  • Лозупонэ Франческо
  • Гиези Антонио
  • Гуаззи Паоло
  • Заровни Натаса
  • Ферруззи Пиетро
  • Зокко Давид
RU2712223C2
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2016
  • Шкурников Максим Юрьевич
  • Галатенко Владимир Владимирович
  • Князев Евгений Николаевич
  • Тоневицкий Александр Григорьевич
RU2647433C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2016
  • Шкурников Максим Юрьевич
  • Галатенко Владимир Владимирович
  • Князев Евгений Николаевич
  • Тоневицкий Александр Григорьевич
RU2646790C1
WO 2014193999 A2, 04.12.2014
ZABEGINA L
et al
A New Approach for Prostate Cancer Diagnosis by miRNA Profiling of Prostate-Derived Plasma Small Extracellular Vesicles
Cells
Способ регенерирования сульфо-кислот, употребленных при гидролизе жиров 1924
  • Петров Г.С.
SU2021A1

RU 2 806 518 C1

Авторы

Забегина Лидия Михайловна

Князева Маргарита Сергеевна

Слюсаренко Мария Александровна

Шалаев Андрей Владимирович

Шаронова Татьяна Валерьевна

Гаранин Александр Юрьевич

Плевако Даниил Сергеевич

Кацуба Константин Евгеньевич

Рева Сергей Александрович

Носов Александр Константинович

Беркут Мария Владимировна

Зятчин Илья Владиславович

Малек Анастасия Валерьевна

Даты

2023-11-01Публикация

2022-11-16Подача