Биомедицинский клеточный продукт для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга Российский патент 2023 года по МПК C12N5/71 A61K35/28 A61P35/00 A61P25/28 A61P37/00 

Область техники

Изобретение относится к области физиологии и медицины, в частности, к онкологии, иммунологии, неврологии, травматологии и геронтологии и может применяться в лечении онкологических, нейродегенеративных и аутоиммунных болезней цивилизации (БЦ), также травм головного и спинного мозга, а также для профилактики различных патологических состояний организма человека, вызываемых старением.

Уровень техники

Современный уровень медицинской и биологической науки, уровень медицинской техники и самых перспективных биомедицинских технологий пока не в состоянии обеспечить ни раннюю диагностику, ни эффективное лечение большинства фатальных БЦ, таких как рак и другие злокачественные новообразования (ЗНО), аутоиммунные заболевания (АИЗ) и нейродегенеративные болезни (НДБ), сердечно-сосудистые болезни (ССБ) и так далее. Проблема роста БЦ приобрела глобальный характер во всем мире и пока не контролируется медицинскими мерами Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). В настоящее время в мире раковых больных уже 15,12 млн человек. По прогнозам ВОЗ, к 2030 году количество новых случаев заболевания раком возрастет примерно на 70%, достигнув цифры 21,6 млн больных в год (https://med-info.ru/content/view/6406, дата обращения 24.04.2021). Аналогичная ситуация сегодня сложилась и с НДБ, число которых растет в геометрической прогрессии. Резкое постарение населения в США и Европе привело к увеличению количества больных со слабоумием и болезнью Альцгеймера (БА), число которых может вскоре утроиться – от 4,7 млн в 2012 году к 13,8 млн к 2050 году. Согласно данным Института здорового старения к 2050 году каждый из 85 человек во всем мире будет страдать БА. Каждый третий житель земли страдает нервно-психическими заболеваниями. В геометрической прогрессии возрастает количество людей с тяжелыми органическими заболеваниями мозга, в арифметической прогрессии растет количество самоубийств и социопатов с расстройствами личности. Успехи современной нейрореанимации и нейрохирургии привели к увеличению в мире количества глубоких инвалидов в вегетативном состоянии с массивными поражениями мозговой ткани и интеллектуальным дефектом. Аналогичная ситуация сложилась с целым рядом АИЗ. Количество больных системной красной волчанкой (СКВ), ревматоидным артритом, рассеянным склерозом и другими аутоиммунными заболеваниями вырастет за ближайшие 20 лет на 37%, а количество больных с аутоиммунным сахарным диабетом превысит полмиллиарда человек в 2040 году. Смертность от этих тяжелых БЦ продолжает неуклонно возрастать, поэтому поиск любого способа лечения и терапевтического средства, способного хотя бы незначительно повысить эффективность терапии этих БЦ и снизить смертность от них, приобретает крайнюю актуальность и значимость для всей мировой медицины.

Также нет существенного прогресса в профилактике старения и увеличения продолжительности жизни человека. При этом в настоящее время существенно изменились научно-теоретические взгляды на проблему старения и активного долголетия. Если раньше, до конца 20 века, старение рассматривали как закономерную фатальную неизбежность смерти и неотвратимость увядания и дегенерации органов и тканей, финалом которой является генетически запрограммированная в геноме человека смерть живого существа, то в начале 21 века появились и настойчиво поддерживаются в странах Европы и США научные представления о том, что старение это возраст-зависимая болезнь организма человека, которая связана с неблагоприятным воздействием изменений климата и загрязнением окружающей среды на человека, и эту болезнь можно попытаться лечить и профилактировать. При этом большинство ученых этиопатогенетическими механизмами этой болезни считают локальные молекулярные повреждения в клетках человека – укорочение длины теломер в хромосоме клеток, повреждение ДНК хроматина ядра, метаболические и обменные нарушения к клетке, оксидативный стресс, накопление патоспецифических (онокоспецифических, нейроспецифических и т.д.) белков в цитоплазме клетки и в межклеточном пространстве и т.д.

Теоретической основой настоящего изобретения стали научные представления, полученные в результате проведенных с участием авторов изобретения фундаментальных работ по проблеме старения и механизмах возникновения фатальных БЦ. На основании многолетних генетических, транскриптомных и протеомных исследований гемопоэтических клеток (ГСК) человека в норме, при старении и БЦ были выявлены специфические структурные изменения ДНК в ГСК при раке и других ЗНО, онкопротемные и транскриптомные повреждения ГСК и других стволовых клеток (СК) при различных ЗНО и АИЗ, что позволило сформулировать и опубликовать в России и за рубежом авторскую постгеномную теорию старения и возникновения БЦ. Согласно этой теории старение и все биологические процессы увядания и деградации органов и тканей, связанные с ним, а также возникновение основных онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных болезней это не заболевания отдельных тканеспецифических соматических клеток и тканей организма и не системные заболевания организма вообще, как в настоящее время общепризнано в мировом здравоохранении в отношении ЗНО, АИЗ, ССБ и НДБ, а целый ряд различных эволюционно-наследуемых и приобретенных постгеномных (протеомных, транскриптомных, метаболомных, секретомных и др.) и эпигеномных болезней собственных ГСК человека, возникающих под воздействием различных патогенетических эндогенных факторов организма и экзогенных негативных воздействий окружающей среды и климата. Постгеномные изменения ГСК приводят к формированию системных иммунозависимых, иммуноопосредованных, иммунообоснованных и молекулярно-нацеленных (таргетных) иммунных реакций всех клеток крови организма в отношении определенных высокодифференцированных клеток специализированных тканей, к нозоспецифичным нарушениям гемопоэза и иммунопоэза организма пациента, формирующим клинические и параклинические манифестации этих фатальных заболеваний за счет повреждения специализированных клеток органов и тканей. Очевидно, что приобретенные в процессе жизни и проведенной терапии повреждения генома, эпигенома и протеома ГСК очень нозоспецифически меняют их функциональные свойства, как клеток-родоначальниц всех миллиардов потомков иммунных клеток крови. Эти постгеномные нарушения ГСК нарушают их системообразующий, надзорный, регенеративный и регуляторный потенциал, формируют нарушения кроветворения и всего иммунитета организма, приводят к еще большим эпигенетическим изменениям молекулярно-биологической структуры собственных ГСК пациента, значительно нарушают их свойства как системных регуляторов иммунопоэза и гемопоэза. Изменения генетически детерминированных функций ГСК под воздействием различных мутаций приводят к формированию патологического транскриптома и протеома этих клеток и, как следствие, к целенаправленной трансформации системных функций потомков этих ГСК в виде различных типов иммунокомпетентных клеток. Эти изменения в ГСК становятся основой формирования патоспецифических адаптивных системных и регуляторных гиперреактивных или гипореактивных иммунных реакций собственного иммунитета организма больного человека к собственным тканям и клеткам организма. Эти реакции патологически измененных протеом-модифицированных ГСК есть универсальный способ видового реагирования организма в новых условиях последействия этипатогенетических факторов болезни и формирования определенного адаптационного нозоспецифического типа недостаточности иммунной системы (НИС). Модификация ГСК, получаемая в результате воздействия на организм человека этиопатогенетических факторов БЦ модификация ГСК формирует из своих потомков определенную НИС, при этом не меняет количественного клеточного состава иммунного и кроветворного статуса человека, но качественно меняет их молекулярно-биологическую (преимущественно протеомную) структуру и соответственно модифицирует генетически детерминированные свойства и функции имуннокомпетентных клеток.

Гиперреактивный тип НИС как защитный инструмент иммунитета приводит к необоснованной аутоагрессии собственных регуляторных, антиген-презентирующих, надзорных и киллерных клеток иммунной системы к определенным высокодифференцированным специализированным (нейронам, печеночным клеткам, бета-клеткам поджелудочной железы, эндотелиоцитам, клеткам щитовидной железы и т.д.) клеткам органов и тканей и манифестирует сначала асептическим воспалением, а затем аутоиммунным процессом в клетках и тканях-мишенях (СКВ, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет 1-го типа и т.д.). Болезнь может остановиться на данном этапе, и в этом случае она будет классифицирована как АИЗ. Однако ее исходом всегда будет последующая тканевая дегенерация с дистрофией или атрофией высокодифференцированных клеток и тканей. Зачастую этап системного воспаления и аутоиммунных реакций является кратковременным и болезнь преимущественно манифестирует выраженной дегенерацией и атрофией клеток и тканей и тогда ставится диагноз НДБ (БА, системная корковая атрофия, боковой амиотрофический склероз (БАС)), или эндокринного заболевания (сахарный диабет 2 типа и т.д.), или ССБ. Этот феномен наиболее нагляден в головном и спинном мозге человека, что объясняется высокой пластичностью нервной ткани мозга. Иллюстрацией этого научного факта является изменение научных представлений о БАС. Так, до начала 20 века БАС рассматривался исключительно как аутоиммунное заболевание, а с 2000-х годов его стали рассматривать исключительно как НДБ. Более того, в международной классификации болезней МКБ-10 эта болезнь обозначена как "болезнь моторного нейрона" Благодаря пластичности мозга манифестация клинической картины появляется, когда погибло более 70-80% нейронов в мозге.

Манифестация и выраженность клинических проявлений связана с доминирующим типом иммунных реакций в организме у больного или стареющего человека. Доминирование определенного типа реактивности иммунитета и формирование определенного типа патоспецифической НИС обусловлено особенностями цитопатоморфологии и количеством накапливающихся в высокодифференцированных клетках специфических (онкоспецифических, нейроспецифических и т.д.) белков протеома и эпигенома ГСК. Именно патоспецифичекие протеомные изменения в клетках и тканях определяют тип реагирования иммунной системы на наличие патологии и формируют клиническую картину НИС.

Гипореактивный тип НИС приводит к формированию толерантности регуляторных, киллерных и надзорных клеток собственной иммунной системы крови (НК-клетки, гамма-дельта-Т-клетки, цитотоксические лимфоциты и т.д.), гемопоэтических прогенеторов и ГСК к патологическим и опухолевым клеткам и избыточно пролиферирующим клеткам и тканям, что проявляется в их бесконтрольном росте и пролиферации, делении и миграции патологических клеток. Это, как правило, характерно для таких заболеваний как рак и ЗНО, системный атеросклероз, ожирение и т.д. Авторы настоящего изобретения полагают, что в рамках данной концепции патоспецифические повреждения определенных тканеспецифических клеток органов и тканей это не причина этих фатальных болезней, а закономерный исход их патологического процесса. Поэтому логичным решением проблем старения и блокировки прогрессирования и излечения БЦ является замена ГСК с поврежденным геномом и протеомом на здоровые ГСК или попытка их реставрации, увеличения количества ГСК в костном мозге (КМ) и восстановления их нарушенных функций. Это новое понимание роли ГСК в патогенезе БЦ и принципиально новая концепция терапии БЦ может дать принципиально новые методологические и научно-практические подходы к излечению этих некурабельных заболеваний человечества.

Сама по себе идея "биологической замены" поврежденных ГСК не нова. Еще в середине прошлого века была показана клиническая эффективность замены ГСК при трансплантации костного мозга (ТКМ) в лечении рака, гемабластозов, ряда ЗНО и АИЗ. Но никто и никогда не рассматривал эту методологию для лечения солидных опухолей и НДБ. Более 15 лет авторы настоящего изобретения применяли интратекальные, интрацеребральные и интрамедулярные фетальные нейральные и кроветворные СК и гемопоэтические прогенеторные клетки (ГПК) пуповинной крови для реставрации повреждений головного и спинного мозга и видели их мощный регенераторный эффект в восстановлении нервной ткани благодаря ее пластичности и иммуннологической привилегированности мозга, расположенного за гематоэнцефалическим барьером. Но клинические эффекты, полученные от алогенных фетальных СК и клеток пуповинной крови, носили случайный характер, эти эффекты было невозможно повторить, так как невозможно найти тот же тканевой состав доноров. С 2002 года авторы изобретения использовали аутологичные и аллогенные ГСК для интратекальной цитотрансфузии в терапии органических неврологических заболеваний и последствий травмы головного и спинного мозга, а также для лечения рассеянного склероза. В 2005 году впервые в России было получено разрешение Росздравнадзора на клиническое применение биомедицинской технологии интратекальной трансфузии ГСК при болезнях и травмах центральной нервной системы. В 2014 году было выполнено фундаментальное изучение протеомики здоровой ГСК и проведено сравнение с онкопротеомикой ГСК при лейкозах, миеломной болезни и протеомикой ГСК с опухолевыми стволовыми клетками при раке молочной железы, раке легких и мультиформной глиобластоме. Был выявлен уникальный механизм формирования разных опухолевых стволовых клеток из различных здоровых тканеспецифичных СК, в том числе, из ГСК. Было показано кардинальное отличие профиля протеомной структуры здоровой ГСК от протеомного профиля белков ГСК при целом ряде патологических состояний и заболеваний и описан универсальный механизм горизонтального и вертикального переноса и накопления опухолеспецифических белков в ГСК и других тканеспецифичных СК при различных опухолях.

Новое понимание роли генома и протеома в молекулярно-структурном повреждении ГСК при различных БЦ и старении позволило разработать и создать новый способ диагностики этих повреждений и новый стандарт оценки степени повреждения ГСК и сделать персонализированный прогноз эффективности их возможного клинического применения. В 2018 году была разработана и внедрен в клинику способ ранней диагностики ЗНО и БАС на основании анализа профиля экспрессии мембранных белков ГСК (патент RU 2706714 C1, МПК G01N 33/53, G01N 33/00, G01N 33/53, опубл. 20.11.2019). В дальнейшем по патоспецифическому профилю мембранных белков ГСК стали диагностировать определенную иммунную недостаточность у пациента при ЗНО, НДБ или АИЗ. Эти молекулярно-биологические исследования показали, что большинство БЦ, таких как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, БА, СКВ, БАС, можно пытаться лечить путем ТКМ с аутологичными или аллогенными ГСК. Так, например, удалось в 90-98% случаев излечивать гемабластозы и другие ЗНО у детей и добиваться многолетней ремиссии при целом ряде АИЗ (рассеянный склероз, СКВ, ревматоидный артрит и т.д.

Итак, полученный в результате тридцатилетних геномных и постгеномных исследований ГСК вывод авторов изобретения был достаточно ортодоксален – повреждение высокодифференцированных специализированных клеток при БЦ (БА, болезнь Паркинсона, БАС, СКВ и т.д.) и старении организма это не причина, а закономерное системообразующее следствие большинства БЦ. Лечение пострадавших специализированных клеток при БЦ и старении без устранения системоообразующей причины этих постгеномных болезней практически бесполезно, что и доказывает неэффективность лечения БЦ до настоящего времени. Например, современное ошибочное понимание БАС исключительно как "болезни моторного нейрона" является причиной невозможности создания эффективных лечебных подходов к этому заболеванию. К сожалению, такое понимание этой болезни позволяет диагностировать её только тогда, когда погибло более 70-80% собственных мотонейронов спинного мозга и около 50-60% других нейронов головного мозга у пациента. Специализированной молекулярно-биологической диагностики данного заболевания нет и в этом случае предложить её невозможно, так как нейрофиламенты, как молекулярные маркеры болезни, в крови и ликворе появляются только в случае появления молекул из распадающихся мотонейронов. Результаты электронейромиографии при БАС лишь констатируют факт необратимого повреждения мотонейронов спинного мозга и невозможность помочь пациенту в принципе. Однако понимание БАС как постгеномного заболевания собственной ГСК дает теоретический и практический шанс для остановки прогрессирования этой болезни и её потенциального излечения путем ТКМ с восстановленной молекулярно-биологической структурой ГСК или с аллогенной гистосовместимой ГСК. Аналогичная ситуация складывается и с БА, когда болезнь диагностируют преимущественно только тогда, когда погибло более 50-60% корковых нейронов головного мозга человека и манифестировало слабоумие, а путей остановки дегенеративного процесса в мозге уже не существует.

Сегодня клинических примеров правильности гипотезы авторов изобретения достаточно много. Стало очевидно, что ряд фатальных БЦ может быть остановлен или даже полностью излечен путем аллогенной ТКМ или аутологичной реконструированной ГСК, если в ГСК пациента будут устранены геномные и постгеномные нарушения. Так, при нормальном геноме и протеоме ГСК их ТКМ при РС позволяет добиться полной и стойкой ремиссии болезни до 15-20 лет (собственные наблюдения авторов изобретения), а при геномной и постгеномной патологии ГСК, подтвержденной протеомикой, будет рецидив заболевания практически в 100% случаев, и ТКМ будет обречена на неудачу. В ряде случаев НДБ, таких как семейные формы БАС, геномная и протеомная патология профиля мембранных белков антигенов ГСК имеет место у всех членов семьи и манифестация заболевания начинается тогда, когда лишь небольшое количество белков протеома ГСК отличает людей в семье пациента с манифестирующей болезнью от ремиссии при одинаковом генетическом повреждении, зарегистрированном при секвенировании их генома.

С другой стороны, с возрастом и болезнями количество ГСК в КМ физиологически сокращается – к 40 годам до 60%, к 60 годам - до 50%, к 70 годам - до 30%, а к 80 годам - до 10-20%. Такого количества ГСК едва хватает для обеспечения собственного гемопоэза и иммунопоэза человека в старческом возрасте. Механизм этого удивительного феномена объяснили профессор Michael Sieweke и его команда из Дрезденского университета (2020). Они показали , что основной механизм иммунной памяти находится не в клетках памяти, как считается во всем мире, а заложен в ГСК человека и млекопитающих на уровне эпигенома. Известно, что иммунная система обладает памятью, которая позволяет ей лучше реагировать на возвращающиеся возбудители инфекции. Они обнаружили, что ГСК могли бы способствовать более быстрому и эффективному иммунному ответу, если бы ранее подвергались воздействию LPS – бактериальной молекулы, имитирующей инфекцию. Профессор Michael Sieweke объяснил, как они обнаружили, что память хранится в ГСК: "Первое воздействие LPS приводит к тому, что следы откладываются на ДНК стволовых клеток, прямо вокруг генов, которые важны для иммунного ответа. Подобно закладкам, метки на ДНК гарантируют, что эти гены будут легко найдены, доступны и активированы для быстрого ответа в случае повторного заражения подобным агентом". Они далее исследовали, как память была записана на ДНК, и нашли белок C/EBP. Это известный энхансерный белок, связывающийся с CCAAT-последовательностью, с которой связываются транскрипционные факторы для активации гена старения SMP30 или Регукальцина (Regucalcin, RGN), также известного как маркер старения protein-30 (senescence marker protein-30). Эти исследования дают возможность для улучшения настройки иммунной системы или улучшения стратегий вакцинации, с одной стороны, и фундаментального понимания механизмов накопления эпигенетических изменений вокруг активных генов ГСК, участвующих в старении, с другой стороны.

Таким образом, рядом с геномом ДНК ГСК происходит постоянное накопление большого количества эпигенетических молекулярных протеомных "закладок" и "меток" белка C/EBP в виде "атласа" перенесенных ранее инфекций и вирусов, болезней и травм и формирование "библиотек памяти необходимых иммунных ответов" на эти антигены за период постоянных фатальных эпидемий особо опасных инфекций, которые уничтожали население на планете и значительно сокращали среднюю продолжительность жизни среднестатистического человека в эпоху возрождения и в средние века. Экономика дымных труб и загазованность атмосферы Земли, урбанизация городов и локализация промышленного производства на реках и озерах с загрязнением воды и пищи, формирование островов мусора в океане привели к необратимым изменениям климата и повышению токсичности окружающей среды и т.д., и все эти факторы оставили свои молекулярные закладки рядом с ДНК генома ГСК.

Неблагоприятные условия среды обитания, травмы и болезни приводят не только к накоплению значительного количества необратимых мутаций в геноме соматических высокодифференцированных клеток, что проявляется в целом ряде наследственных болезней, но также к появлению дополнительных эпигенетических протеомных "молекулярных меток и закладок" C/EBP белка рядом с ДНК генома в ГСК. Под воздействием текущих неблагоприятных факторов окружающей среды и нарушений внутреннего гомеостаза большая часть этих ГСК сначала активирует ген старения, замедляет свой клеточный цикл, а в дальнейшем активно погибает в результате эпигенетического и постгеномного повреждения молекулярной структуры ДНК ГСК в процессе жизни человека. Появление дополнительных атласов молекулярных закладок и библиотек эпигеномно-протеомных изменений вокруг генома блокирует работу клетки, замедляет проведение информации к ней и приводит к её старению. В момент рождения у человека количества ГСК составляет около 20 000, а к 80-ти годам жизни количество ГСК составляет значительно менее 1800, и каждая из них имеет серьезные изменения собственной протеомной структуры.

Способность иммунной системы отслеживать предыдущие инфекции и более эффективно реагировать на них при повторном появлении является основополагающим принципом работы вакцин, но этот уникальный феномен накопления эпигенетических изменений и "молекулярно-биологических закладок быстрого реагирования" рядом с геномом клетки приводит к ее информационной блокаде, нарушению прохождению через нее информации и соответственно к старению и быстрому изнашиванию. Теперь, когда стало понятно, как ГСК крови маркируют цепи иммунного ответа, ученые должны быть в состоянии оптимизировать стратегии иммунизации и профилактики старения, чтобы расширить защиту для инфекционных агентов, а также отработать возможность очистки генома ГСК от эпигенетических антигенных шлаков, накапливающихся вокруг генома, и научиться их удалять. Становится понятно, почему изменяя собственную микробиоту кишечника, можно увеличить продолжительность своей жизни. В более общем плане это также может привести к появлению новых способов усиления иммунного ответа в случае его недостаточной эффективности или его отключения в случае чрезмерной реакции.

Таким образом, в работах дрезденских немецких исследователей было показано, что различные инфекционные и вирусные заболевания оставляют эпигенетический след вокруг ДНК генома в виде протеомных следов, и эти эпигенетические изменения приводят к быстрому старению этих клеток, замедлению их клеточного цикла и гибели значительного количества ГСК в КМ. Поэтому главной задачей в профилактике и борьбе с БЦ, возрастзависимыми заболеваниями и старением является восстановление количественного состава ГСК и восстановление генетически детерминированного качества их молекулярно-биологической (транскриптомной, протеомной, метаболомной и секретомной) структуры.

Одним из реально доказанных путей решения проблемы лечения и профилактики рецидивов большинства БЦ является аутологичная ТКМ и ТКМ с аллогенными ГСК, которая имеет очень большие трудности и ограничения в клинической практике. В стране нет достаточного количества банков КМ для подбора необходимого гистосовместимого аллогенного донорского биоматериала КМ при лечении онкологических больных. Стоимость процедуры в России по квоте Минздрава России составляет 2 500 000 рублей, а в США около 250 000 долларов США, в Евросоюзе около 220 000 евро. Стоимость подбора биоматериала для ТКМ в Евросоюзе составляет от 30 000 до 40 000 евро. Сама процедура аллогенной ТКМ сопряжена с целым рядом объективных трудностей и достаточно небезопасна для больного, имея риск осложнений смертельного исхода в 6-9% случаев. Поэтому в настоящее время маловероятно применение аллогенной ТКМ у целого ряда неонкологических больных с другими БЦ. Более того, по Приказу Минздрава России № 875н от декабря 2018 года проведение ТКМ в России возможно только в государственных учреждениях страны, включенных в список учреждений, которым разрешено проведение ТКМ, и будет сопряжено с большими клиническими трудностями, на которые вряд ли пойдут государственные учреждения.

Возможно ли техническое и технологическое решение этой проблемы? Несомненно возможно, и даже без нарушений существующих приказов Минздрава России по ТКМ и монополию государства на эти услуги. У контингента пациентов с высоким риском возникновения онкологических, аутоиммунных, нейродегенеративных, сердечно-сосудистых болезней можно в молодом возрасте (18-40 лет) забрать терапевтическую дозу КМ или лейкоконцентрата (ЛК) мобилизованных мононуклеаров (МНК) периферической крови (ПК) и ГСК, криоконсервировать их с криопрофилактиком (ДМСО) и хранить в жидком азоте сколь угодно долго. То есть, современные технологии криобанкинга тканей позволяют "вывести" собственные ГСК из процесса старения организма и исключить на них воздействие этиопатогенетических факторов основных БЦ. Реинфузия этих молодых клеток КМ в пожилом возрасте (65-75 лет) позволяет увеличить продолжительность жизни человека на 10-15 лет.

Экспериментальное моделирование на линейных мышах с четко ограниченным сроком жизни показало, что введение ГСК КМ мозга молодых мышей пожилым животным, достигшим возраста 50% летальности своей популяции, увеличило время их жизни на 28% и значительно улучшило качество их жизни, качество шерсти, их внешний вид и восстановило репродуктивные способности. Однако проблема планирования и заготовки собственного КМ у молодых людей для увеличения их продолжительности жизни и профилактики будущих БЦ еще требует своего научного и организационно-административного решения.

Одним из основных известных направлений работы по восстановлению геномных повреждений в ГСК являются подходы современной генной инженерии, основанной преимущественно на применении вирусных векторов, плазмид или других генно-инженерных конструкций для доставки генетического материала в клетку. Любая попытка крайне сложного геномного редактирования патологических ГСК с помощью современных инструментов генной инженерии (цинковые пальцы, CRISP/Cas9 технологии и т.д.) пока что представляется малоэффективной. Это связано с тем, что в каждом конкретном случае будет иметь место персонифицированный тип молекулярного повреждения ДНК-структуры генома ГСК и специфические эпигенетические изменения ядра ГСК у каждого пациента. Геномное редактирование потребует выяснения локации этих структурных нарушений в этих клетках. Но даже путем самых ультрасовременных диагностических технологий секвенирования генома, полнотранскриптомного анализа с микрочипированием экспрессии 34 000 генов или развернутого протемного картирования 8 000 белков можно определить лишь основные нарушения геномно-транскриптомно-протеомной внутриклеточной конструкции, но реального лечения этот подход не обеспечит и будет очень дорогостоящим.

Известен препарат аутологичных ГСК для лечения травматической болезни центральной нервной системы (патент RU 2283119 C1, МПК A61K 35/14, A61P 25/00, опубл. 10.09.2006). Этот препарат представляет собой аутологичные клетки, полученные из ПК пациента, обогащенной гемопоэтическими клетками, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40÷100)×10⁶ клеток/мл. В основу способа получения этого препарата было положено использование ЛК неманипулированных МНК из ПК, в котором ГСК находились в их естественном окружении. К настоящему времени этот препарат клинически безопасно и эффективно применен у более чем 10 000 пациентов из 50 стран мира. Технология получения этого препарата претерпела различные модификации. В частности, количество ГСК в используемом клеточном продукте наращивали путем сепарации ГСК (CD34+,CD45+) из ЛК c использованием стандартных моноклональных антител на иммуносепараторе типа CliniMax. Но такой подход очень сильно удорожает технологию получения препарата.

Известны химерные мутационные векторы с неприродными нуклеотидами, используемые в способе генной терапии, основанном на исправлении точечных мутаций в клетках (патент US 5,795,972, МПК С07Н 21/00, C12N 15/00, опубл. 18.08.1998). Этот способ характеризуется относительно низкой эффективностью лечения и ограниченностью применения, поскольку мутации должны быть точно определены еще до начала лечения. Ввиду того, что ни для одной мутации нет достоверного доказательства того, что именно эта мутация привела к гибели СК или является причиной злокачественного перерождения клеток гемопоэза, применение этого способа требует скрупулезных и длительных исследований по выявлению конкретных мутаций, требующих коррекции. Поэтому существует необходимость в создании методов, которые могли бы применяться на основе уже имеющихся знаний о механизмах коррекции генома без акцента на конкретные мутации, приведшие к гибели СК или их злокачественному перерождению.

Известны способы лечения, основанные на локальном применении ДНК-фрагментов для лечения предраковых состояний в коже пациентов (патент US 5,955,059, МПК A61K 7/42, C12N 15/00, опубл. 21.09.1999; патент US 5,470,577, МПК A61K 8/60, опубл. 28.11.1995). Эти способы также имеет ограниченную применимость, поскольку ни конкретные последовательности, ни источники ДНК в указанных патентах не определены. В них предлагается использовать как природную, так и синтетическую ДНК из "любых подходящих источников", например ДНК лосося длиной от 200 до мононуклеотидов и нуклеозидов, включая димеры, что согласно этим патентам является наиболее эффективным. Однако действие и последствия применения ДНК иной природы на человеческий организм пока изучены неполностью, что предопределяет определенную опасность применения этих известных способов.

Другим из существующих универсальных механизмов самореставрации поврежденного генома ГСК и других СК в организме млекопитающих и человека является молекулярный механизм гомологичной рекомбинации (ГР), который очень широко распространен в природе. Под термином гомологичной рекомбинации или общей рекомбинации понимают тип генетической перестановки в хромосоме, во время которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между похожими или идентичными хромосомами (https://ru.wikipedia.org/wiki/Гомологичная_рекомбинация, дата обращения 02.05.2021). Это наиболее широко используемый клетками способ устранения двух- или однонитевых повреждений ДНК. ГР, происходящая во время репарации ДНК, как правило, приводит к восстановлению молекулы в том же виде, в котором та находилась до повреждения. И это самый главный результат ГР. Поскольку явление ГР прослеживается во всех трёх доменах живой природы, а также у вирусов, его можно считать универсальным биологическим механизмом саногенеза. Открытие ГР-генов у протистов – разнообразной группы эукариотических микроорганизмов – было истолковано как свидетельство того, что мейоз возник на раннем этапе эволюции эукариот и обеспечивал им адекватное восстановление генома при повреждении ДНК.

Известен препарат Полидан, представляющий собой высокоочищенную стандартизированную смесь натриевых солей полихлоргидратов дериватов ДНК и РНК, получаемую из молок осетровых рыб, и предназначенный для лечения и профилактики лейкопении и тромбоцитопении, возникающей при лучевой и цитостатической терапии, а также для лечения иммуносупрессии, возникающей при программной химио- и лучевой терапии. Дозу Полидана вводят подкожно или внутримышечно медленно в течение 1,5-2 минут с предварительным согреванием флакона с препаратом в руке до температуры тела пациента (см., например, https://www.vidal.ru/drugs/polidan_sodium_nucleospermate___1791 или https://www.webapteka.ru/drugbase/name4250.html, дата обращения 02.05.2021). Недостатком лечения этим препаратом является ограниченная область применения, поскольку активная субстанция препарата выделена из тканей ксеногенного организма и содержит как ДНК, так и РНК молекулы. Активная субстанция препарата Полидан действует на геном ГСК сходным с ДНК человека образом, а именно мимикрирует наличие разрывов хромосом присутствием двухцепочечных концов, доставленных в ядро фрагментов ДНК, чем активирует ГСК к терминальной дифференцировке, а также создает условия за счет нахождения частичной гомологии между ДНК препарата Полидан и ДНК хромосом человека для осуществления актов гомологической рекомбинации и сохранения физической длины и структуры хромосом, достаточных для цепи последовательных митозов. Такое действие препарата Полидан спасает гемопоэтическую функцию ГСК за счет восстановления и поддержания функционального размера хромосом этих клеток и, по-видимому, в целом не затрагивает высокоспециализированные свойства дифференцированных клеток крови, одновременно активируя их к терминальной дифференцировке своим мимикрирующим действием. Однако, субстанция препарата Полидан при этом привносит в реципиентный геном чужеродные последовательности. Такие спасенные ГСК нельзя считать в полной мере вернувшими свое исходное генетическое состояние, поскольку любое другое направление дифференцировки, где принимают участие задетые рекомбинацией с чужеродным генетическим материалом хромосомные локусы, неизбежно приведет к дефектам этого пути развития ГСК. Внутренняя структура хромосом при такой рекомбинации приобретает абсолютно непредсказуемые черты, и долгосрочный прогноз лейкостимуляции с использованием препаратов чужеродной ДНК до сих пор не исследован.

Механизм ГР также был использован для реставрации поврежденных ГСК в способе лечения онкологических заболеваний (патент RU 2313349 C2, МПК A61K 31/711, A61P 35/00, опубл. 27.12.2007). Этот известный способ основан на введении в организм животного препарата фрагментированной ДНК, в качестве которой используют гомологическую ДНК, имеющую биологически активный размер, составляющий полный геном физиологически и генетически здорового донора, при этом ДНК вводят в дозе, создающей такую концентрацию ДНК в плазме крови, которая равна или превышает концентрацию собственно ДНК плазмы крови, но не превышает максимально допустимую концентрацию, равную 30 мкг/мл. Существенным недостатком используемого препарата фрагментированной ДНК является применение в нем аллогенной двухцепочечной ДНК (дцДНК) здоровых доноров путем их перорального приема в виде таблеток или внутривенного введения раствора. Для целей дальнейшего использования геном- и протеом-восстановленных и размноженных ГСК в клеточной терапии БЦ реставрацию клеток целесообразно осуществлять экстракорпорально и отмывать фрагменты дцДНК с поверхности реконструированных ГСК.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является создание биомедицинского клеточного продукта (БМКП) для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга, который не имел бы недостатков вышеуказанных известных решений и обеспечивал бы достаточную эффективность и безопасность лечения при достижении технического результата, заключающегося в использовании простых природоподобных путей реставрации геномных и протеомных повреждений ГСК независимо от этиологических факторов этих повреждений с увеличением количества восстановленных ГСК, имеющих достаточные функции иммунопоэза и гемопоэза.

Решение указанной задачи с получением указанного технического результата достигается в настоящем изобретении тем, что предложен БМКП для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга, состоящий из линии аутологичных или аллогенных ГСК и ГПК, выделенных из нативного КМ путем эксфузии или из ПК путем лейкоцитофереза, размноженных путем культивирования в ЛК МНК в среде, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, и инкубированных с лекарственным препаратом дцДНК человека.

Согласно настоящему изобретению среда, препятствующая гемопоэтической дифференцировке, преимущественно содержит смесь цитокинов, состоящую из фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L), интерлейкина 6, тромбопоэтина (ТРО), инсулина и трансферрина, с добавлением антибиотика иономицина (Са²⁺ ionophore). Через 3-7 дней культивирования в выращенной клеточной суспензии содержится около 1.5- 2% клеток CD34+.

В качестве препарата дцДНК человека в настоящем изобретении может быть использована стерильная форма лекарственной субстанции Панаген®. Этот препарат зарегистрирован в Государстенном реестре лекарственных средств Российской Федерации 09.06.2008 за № ЛСР-004429/08. Активный компонент лекарственной субстанции Панаген® это специальным образом подготовленная фрагментированная ДНК, содержащая комплексы с белками ядерного матрикса, выделенная из человеческой плаценты. Субстанция Панаген^® представляет собой смесь фрагментов геномной дцДНК здорового человека, в совокупности которых представлены все геномные последовательности человеческого генома. Фрагменты не содержат в себе посторонних векторных или вирусных последовательностей. Преимущественный размер фрагментов от 200 до 6000 пар нуклеотидов. Фрагменты экстраклеточной дцДНК в лекарственной субстанции Панаген® полностью насыщают внутренние компартменты клетки в течение около 60 минут при соотношении 0,2 мкг экстраклеточной ДНК на миллион (10⁶) клеток в объеме 0,5-2 мл при содержании СК в образце от 0,1 до 5%. Во внутренних компартментах клетки может присутствовать до 10⁶ фрагментов экстраклеточной дцДНК размером 0,5-1 тысячи пар оснований. Фрагменты дцДНК способны путем известного молекулярного механизма интернализоваться в ГСК и ГПК. Интернализованные фрагменты запускают пролиферацию покоящихся ГПК и ГСК и принимают участие в транзитных репаративных процессах, протекающих в клетках этого типа, что сопровождается корректировкой возможных нарушений ДНК ядерного хроматина, восстановлением нарушенных генетических локусов, и как следствие повышением жизнеспособности стволовых кроветворных клеток.

Решение указанной задачи достигается в настоящем изобретении также тем, что предложен способ получения БМКП по настоящему изобретению, включающий выделение ЛК аутологичных или аллогенных мобилизованных МНК путем лейкоцитофереза ПК или эксфузии нативного КМ, очистку выделенного ЛК от эритроцитов и гранулоцитов, культивирование содержащихся в очищенном лейкоконцентрате ГСК и ГПК в среде, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, для увеличения их количества не менее 1,5% от общего количества МНК в БМКП и приобретения ими первичных гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств, а также инкубацию клеточной массы ГСК и ГПК с лекарственным препаратом дцДНК человека для активации гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств этих клеток.

Согласно способу по настоящему изобретению в качестве среды, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, используют преимущественно среду, содержащую смесь цитокинов, состоящую из фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда fms-подобной тирозинкиназы 3, интерлейкина 6, тромбопоэтина (ТРО), инсулина и трансферрина, с добавлением антибиотика иономицина (Са²⁺ ionophore).

Для интратекального или интравентрикулярного введения БМКП пациенту клеточную массу после инкубации отмывают от дцДНК преимущественно путем двухкратного центрифугирования с 0,9% физиологическим раствором NaCl.

В качестве препарата дцДНК человека в способе по настоящему изобретению может быть использована стерильная форма лекарственной субстанции Панаген®. При этом инкубацию проводят в течение не более 1 часа при концентрации субстанции Панаген® не более 30 нмг на 1 мл клеточной массы.

Инкубацию можно проводить после культивирования или в процессе культивирования.

Таким образом, согласно настоящему изобретению количество ГСК и ГПК наращивают непосредственно в ЛК МНК ПК или КМ, т.е. в оптимальном микроокружении этих клеток, что способствует правильной дифференцировке этих прогениторных клеток в СК гемопоэтического ряда, а последующая инкубация наращенной клеточной массы ГСК и ГПК с препаратом дцДНК позволяет восстановить молекулярную структуру клеток, которая была до их повреждения.

Основной принцип настоящего изобретения заключается в том, что для реставрации эволюционно-наследуемых или приобретенных повреждений ДНК в аутологичных или аллогенных ГСК и ГПК больных использовано сочетание культивирования этих клеток в ЛК при наращивании их количества с последующей молекулярно-биологической самореставрацией хромосом клеток, основанной на участии фрагментов экстраклеточной дцДНК в транзитных репаративных процессах, перманентно происходящих в ГСК. Основные биологические механизмы самореставрации хромосом этого типа клеток основаны на следующих свойствах ГСК:

1) На природной способности фрагментов экстраклеточной дцДНК интернализироваться во внутренние компартменты ГСК, включая ядерное пространство клеток этого типа. Во внутреннем пространстве клетки одновременно может находиться 1-10% от гаплоидного генома дцДНК или 10^4-5 фрагментов дцДНК размером около 1000 пар оснований.

2) На способности этих интернализованных фрагментов принимать участие в репаративных событиях при репарации двухцепочечных разрывов, транзитно присутствующих в этих клетках (а) при синтезе РНК, где фрагменты принимают участие в рекомбинационных событиях в виде внешней ДНК матрицы, по которой осуществляется синтез ДНК хромосомы при разных вариантах гомологической рекомбинации, требующей матричного синтеза (NER, SSA, генная конверсия, репарация с участием коротких гомологичных последовательностей) и (б) в ходе репликации, где транзитные нарушения требуют участия Rad51 зависимой гомологической рекомбинации в форме кроссинговера. В обоих случаях репарация происходит таким образом, что участок хроматина, где произошли рекомбинационные события с участием внешней немутированной дцДНК матрицы, изменяет свой нуклеотидный состав, а ген или регуляторный участок хроматина, где эти события произошли, приобретает новые реставрированные качественные свойства. Таким образом ГСК приобретает реставрированный фенотип, где стохастически нарушенные (патологически мутированные) в процессе жизнедеятельности участки хромосом будут заменены на немутированные последовательности, полученные от молодого здорового организма (плацентарный материал здоровых рожениц). Используемый для этих целей препарат Панаген® состоит из множества вариантов двухцепочечных фрагментов ДНК здорового человека, полученной из плацентарного материала абсолютно здоровых женщин, и присутствие "нездоровых" мутаций и возможность их попадания в результате гомологичного обмена крайне мала. Кроме того, нахождение экстраклеточных фрагментов дцДНК во внутренних компартментах ГСК имеет транзитный характер. Это исключает возможность непрерывного количественного давления "нездоровой" последовательности ДНК на определенный локус хромосомы, что еще больше снижает вероятность гомологичного обмена с "нездоровой" последовательностью. В сумме эти факты свидетельствуют о бесконечно малой вероятности попадания дефектного участка ДНК в хромосомы ГСК.

3) На способности двухцепочечных фрагментов, доставленных во внутренние компартменты ГСК, покоящихся в G0 фазе клеточного цикла, индуцировать в "спящих предшественниках" репаративные процессы, связанные с необходимостью элиминации из внутриклеточного пространства такого раздражителя как свободные двухцепочечные концы. Активированные системы cheсk-point контроля и ареста клеточного цикла, необходимые для такой репарации, таким образом должны завершиться проходом активированной клетки по клеточному циклу, что приводит к активации пролиферации "спящих" ГСК и дополнительному увеличению пролиферативного потенциала аутологичного клеточного материала, реинфузируемого пациенту.

Этот новый методологический подход, используемый в настоящем изобретении, позволил создать принципиально новый БМКП, для получения которого из небольшого количества поврежденных и малофункциональных ГСК и ГПК больного человека в их естественном микроокружении (ЛК МНК ПК или КМ) идет их количественное наращивание и последующее качественное восстановление их молекулярно-биологической и функционально-способной геномно-протеомной структуры путем инкубации с лекарственным препаратом дцДНК человека.

Необходимо также отметить, что основной проблемой культивирования высокопластичных недифференцированных ГСК с маркерами CD34+, CD133+, Lin- является их быстрый выход в дифференцировку, а для решения требуемых терапевтических задач регенерации и задач улучшения кроветворения необходимо накопление, увеличение количества и повышение способности колониеобразующих свойств этих СК без развития колоний дифференцированных клеток. При этом способность к последующей дифференцировке у таких культивируемых клеток должна быть сохранена, по возможности, не хуже чем в первоначальном виде или даже лучше.

Выбор компонентов, входящих в состав ростовой среды для культивирования ГСК и ГПК в настоящем изобретении, основан на следующих свойствах этих компонентов.

Фактор роста SCF стимулирует пролиферацию СК, взаимодействуя со специфическим рецептором (протоонкогенным c-kit), обладающим тирозин-киназной активностью, индуцирует активацию киназы и трансфосфорилирование цепей рецептора. Фосфотирозиновые остатки рецептора функционируют как места стыковки протеинов, связывающих c-kit с сигнальными путями, что индуцирует активацию пролиферации. Содержание SCF в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 50-150 мкг.

FLT3G стимулирует пролиферацию ГСК в неменьшей степени, чем SCF. Рецептор FLT3 представляет собой III класс рецептора тирозинкиназы, экспрессированного на ранних ГПК. Взаимодействие рецептора FLT3 с FLTLG активирует сигнальные пути и последующую пролиферацию СК. Содержание FLT3G в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 10-50 нг.

Интерлейкин 6 усиливает стимулирующее действие макрофагального колониестимулирующего фактора и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на рост макрофагальных колоний. Кроме того, сочетание интерлейкина 6 с SCF ускоряет пролиферацию ранних предшественников гемопоэза и формирование ростовых колоний. Содержание интерлейкина 6 в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 1-5 мкг.

Тромбопоэтин (ТРО) - это гликопротеиновый гормон, который относится к классу I гемопоэтических цитокинов и регулирует продукцию тромбоцитов СК в КМ. В суспензионной культуре ТРО в комбинации с SCF стимулирует пролиферацию мультипотентных СК и повышает их количество. Содержание ТРО в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 50-150 мкг.

Инсулин и трансферрин способствуют пролиферации, но не дифференцировке СК. Содержание инсулина и трансферрина в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 0,1-0,5 мкг и 50-70 мкг соответственно.

Иономицин (Са²⁺ ionophore) используется в качестве стимулирующего агента роста недифференцированных СК в условиях ех vivo. Иономицин повышает концентрацию внутриклеточного Са²⁺, начиная с мобилизации внутриклеточных запасов, которые затем поддерживаются притоком внеклеточного Са²⁺, индуцирует гидролиз фосфоинозитидов и стимулирует активацию протеинкиназы С, стимулируя вход катиона регулируемыми запасами кальция, но не прямым действием на плазматическую мембрану. Таким образом, иономицин является агентом первичной активации (сферилизации) клеток (см., например, патент RU 2108579, МПК G01N 33/49, опубл. 10.04.1998). Иономицин использовался как агент роста дифференцированных клеток, таких как гибридом и дендридных клеток (см., например, патентную заявку US 2003/0213008 A1, МПК A01K 67/027, опубл. 13.11.2003; патентную заявку US 2002/0194637 A1, МПК A01K 67/027, опубл. 19.12.2002; патент US 6458585 B1, МПК C12N 5/00, опубл. 01.10.2002). Согласно настоящему изобретению содержание иономицина в 1 мл ростовой среды составляет преимущественно 10-100 мкг.

Необходимый уровень стволовости ГСК обеспечивается в процессе их культивирования тем, что из равноценного перечня известных цитокинов была выявлена такая их смесь, которая в определенных подобранных концентрациях оказалась способной вместе с новым фактором стимуляции пролиферации СК – иономицином – индуцировать только клеточную пролиферацию и таким образом не потребовалось использовать дополнительные агенты для подавления дифференцировки клеток. Кроме того, неожиданным результатом для настоящего изобретения было достижение очень больших скоростей пролиферации клеток, что позволило сократить время культивирования клеток до 7-9 дней. Более того, культивирование в этой среде позволило не изменять базовые процентные соотношения фундаментальных клеточных элементов в ЛК МНК и при этом нарастить количество ГСК до 1,5-2%.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее получение БМКП и его применение описано более подробно по стадиям.

Стадия 1. Получение ЛК МНК

А. Получение ЛК МНК из неманипулированного КМ

Процедура выделения КМ широко известна и описана, например, в патенте RU 2741769 C2, МПК A61 K35/14, опубл. 28.01.2021 (с. 31, строки 3-34). Указанная часть описания к этому патенту включена в данное описание посредством ссылки. Полученный образец КМ в стерильном биксе и изотермическом транспортном контейнере доставляют в лабораторию для выделения МНК.

Б. Получение ЛК МНК из мобилизованной ПК

Процедуру сбора МНК условно разделяют на два этапа. 1-й этап сбора МНК проводят путем лейкоцитофереза на 5-й день стимуляции ПК колониестимулирующим фактором (Г-КСФ), собирая полученный материал МНК в 1-й криомешок МНК). 2-й этап сбора МНК проводят повторным лейкоцитоферезом на 6-й день стимуляции (2-й мешок МНК). Дальнейшие манипуляции с биоматериалом, собранном в двух криомешках, проводят одинаково.

Более подробно технология сбора МНК ПК с мобилизацией ГСК в ПК, сбором ГСК и ГПК и их определением описана в патенте RU 2741769 C2, МПК A61 K35/14, опубл. 28.01.2021 (с. 31, строка 37 – с. 34, строка 25). Указанная часть описания к этому патенту включена в данное описание посредством ссылки.

Стадия 2. Культивирование ГСК и ГПК в ЛК МНК

и инкубация с лекарственной субстанцией Панаген®

Цель этой стадии получения БМКП является увеличение общего количества собственных ГСК пациента в собранном биоматериале и улучшение качества их кроветворных и регенеративных функций для повышения эффективности воздействия БМКП на основные терапевтические цели и мишени в поврежденной ткани организма человека.

Транспортировку криомешков с ЛК МНК, полученным на стадии 1, осуществляют в термоконтейнерах ТермоКонт при комнатной температуре (18-25°С).

Все дальнейшие процедуры проводят в ламинарных шкафах класса II, расположенных в стерильном блоке, с подачей воздуха по регламенту GMP и с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.

Клеточную взвесь МНК забирают шприцем, прокалывая мембрану соединительной трубочки на мешке, делят на пробирки по 50 мл и далее работают с каждой пробиркой индивидуально. Клеточную взвесь МНК разводят в соотношении 1:4 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca2+ Mg2+ free) и затем наслаивают на градиентный раствор (d=1,077 г/мл, MP Biomedicals). Пробирки центрифугируют при 400 g в течение 30 мин при 20°С. В результате градиентного центрифугирования эритроциты и гранулоциты опускаются на дно пробирки, а фракция МНК в виде плотного кольца концентрируется между двумя слоями, на поверхности градиента. Фракцию МНК отбирают пипеткой, разводят в свежем PBS и три раза отмывают центрифугированием в течение 10 мин при 300 g и температуре 10°С.

Далее осуществляют подсчет клеток и фенотипический анализ фракции МНК. Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляют 20 мкл трипанового синего (Gibco). Подсчет клеток производят в гемоцитометре, содержание живых клеток не должна быть ниже 95%. Для оценки количества клеток CD34+, CD133+ во фракции МНК 0,1 мл клеточной суспензии окрашивают соответствующими антителами и определяют содержание ГСК и ГПК в клеточной взвеси на приборе FACSCalibur (Beckton Dickinson).

Пример культивирования и инкубации

ЛК МНК был получен от донора Н. Содержание клеток донора в ЛК было следующим: ГСК (СD34+, CD45+) - 0,5%, NK-клетки - 5%, Т-лимфоциты - 84%, В-клетки - 1,2%.

В качестве культуральной (ростовой) среды использовали среду Искова в модификации Дульбекко (Iscove's modified Dulbecco's Medium IMDM, Gibco, UK) с добавлением 0,5 г/л бычьего сывороточного альбумина (Sigma Aldrich). В культуральную среду добавили также SCF (c-KitL, R&D Systems) в количестве 100 нг/мл, FLT3G в количестве 20 нг/мл, интерлейкин 6 в количестве 1,2 мкг/л, ТРО в количестве 60 мкг/мл, а также человеческий инсулин в количестве 0,39 мкг/мл, трансферрин (Gibco) в количестве 60 мкг/мл и иономицин (Sigma Aldrich) в количестве 0,1 мкM/мл.

Клетки культивировали при 37°С во влажной атмосфере с притоком 5% CO₂. Свежую среду и цитокины добавляли каждый третий день. Время культивирования составило 6 дней. За 1 час до окончания культивирования начали инкубацию, для чего в культуральную среду добавили стерильную субстанцию Панаген® в количестве 30 мкг/мл. Предварительную стерилизацию субстанции Панаген® проводили с использованием системы антибактериальных фильтров.

Использованные при культивировании факторы роста способствовали пролиферации СК, при этом не было необходимости добавлять агенты, подавляющие дифференцировку. Полученный БМКП любого индивидуума может быть сохранен в замороженном виде, либо введен больному непосредственно после культивирования, стандартизации и сертификации полученного БМКП.

Провели оценку чистоты полученной клеточной суспензии БМКП на основании данных проточной цитометрии. Содержание возможных для анализа лимфоцитов составило 84,7%, из них содержание зрелых Т-клеток – 81,2% с преобладанием CD4+ субпопуляций. γδ-Т-клетки составили 1,2%. Гетерогенные NK-клетки были представлены популяциями CD94+, CD16+, CD56- и СD94-, CD56+, CD16- и CD16++, CD56++, суммарно составляющими 14,0% от лимфоцитов. Популяции CD16+, CD56low не выявлено. Заключение: материал сохранный. Полученные данные представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Оценка чистоты полученной клеточной суспензии БМКП

Маркеры Содержание антиген-позитивных лимфоцитов, % ГСК СD34+, CD45+ 2,2 СD34+, CD45- 1,1 Т-клетки CD3+, CD56-, CD16- 81,2 CD3+, CD56+, CD16+ 2,06 CD3+, CD4+ 50,2 CD3+, CD8+ 31,4 Cd3+, γδ+ 1,2 NK-клетки СВ94+, CD16+, CD56-, CD3- 10,63 CD16+, CD56+ 0,12 CD16+, CD56low 0,0 CD16-, CD56+ CD94-, CD3- 3,3 Субпопуляции NK-клеток (в пределах CD56-, CD16+) CD94- 100,0

Стадия 3 . Криоконсервация и хранение клеточного материала

Полученный БМКП в условиях стерильности собирают в ламинарном шкафу из пробирок в мешок и направляют на криоконсервацию.

Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении стерильного ДМСО к охлажденной суспензии БМКП в конечной концентрации 10% и стандартного замораживании со скоростью 1ºС в минуту до –170ºС с использованием стандартных программ электронного программного замораживания. Далее БМКП хранят в жидком азоте или парах жидкого азота в специализированных термоконтейнерах на складе GLP-производства, лицензированного Росздравнадзором Минздрава России.

Стадия 4. Транспортировка БМКП на клиническую базу

и применение БМКП в клинике.

А. Транспортировка БМКП

Транспортировка готового к клиническому применению БМКП со склада должна осуществляться в специализированном контейнере для перевозки клеточных продуктов медицинской организацией, имеющей лицензию на транспортировку БМКП в соответствии с Федеральным Законом "О биомедицинских клеточных продуктах" от 23.06.2016 № 180-ФЗ. Перед транспортировкой БМКП сотрудник лицензированной транспортной организации, осуществляющий его транспортировку на клиническую базу, должен проверить сертификат качества данного БМКП, сохранность первичной и вторичной упаковки БМК, инструкцию клинического применения и обеспечить сохранность качества БМКП при его доставке в специализированном транспортном контейнере в сухом льде или парах жидкого азота на автомобиле. Перевозка БМКП в общественном транспорте категорически запрещена.

Размораживание БМКП производится непосредственно перед трансплантацией или трансфузией в процедурном кабинете на водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем путем центрифугирования при 1500 об/мин БМКП осаждают на дно центрифужной пробирки, отсасывают надосадочную жидкость и заливают 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl. Процедуру повторяют дважды. БМКП в размороженном состоянии может применяться в течение 6 часов после приготовления. Если клеточный препарат за это время не был использован, то он подлежит утилизации.

Б. Трансфузия размороженного БМКП

Внутривенная или внутриартериальная трансфузия БМКП

Внутривенное или внутриартериальное введение аутологичных БМКП производится путем стандартного внутривенного или внутриартериального медленного болюсного введения клеточного продукта в дозе от 5х10⁶ до 200 х10⁶ МНК, содержащей не менее 1-2% СD 34+, CD45+ клеток, разведенного 10 мл или 100 мл 0,9% физиологическим раствором NaCl.

Интратекальное введение БМКП

Интратекальное введение препарата аутологичного или аллогенного БМКП должно производиться только в условиях реанимационного отделения. Трансфузия БМКП осуществляется через люмбальный прокол, выполненный в типичном месте (в L3-L4 промежутке) под местной анестезией 1% раствором лидокаина. Затем забирают 3 мл ликвора и смешивают с 100 мкл БМКП (максимальный объем до 1 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят в субарахноидальное пространство. Накладывают асептическую повязку. При необходимости повторяют интратекальные трансфузии БМКП, но не чаще чем 1 раз в неделю. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью перед интратекальной трансфузией делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).

Интраветрикулярное введение БМКП

По стандартной методике путем открытой нейрохирургической операции пациенту в боковые желудочки мозга устанавливается интравентрикулярный порт. Трансфузию аутологичных или аллогенных БМКП у больных осуществляют в перевязочной хирургического отделения стационара. После имплантации порта проверяется отсутствие крови в желудочках мозга путем чрезкожной пункции порта специализированными тонкими иглами с карандашной заточкой. Затем забирают 1-2 мл ликвора и смешивают с 100 мкл БМКП (до 1 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят через порт в боковые желудочки мозга.

При всех путях трансфузии БМКП для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью перед интравентрикулярным введением делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона). Повторные введения БМКП в ликвор можно производить только после полной санации спинномозговой жидкости, подтвержденной лабораторными данными.

Послетрансфузионное ведение пациента осуществляется круглосуточно в течение 7 дней после клинического применения БМКП. Реаниматолог вместе с лечащим врачом должны осуществлять контроль состояния пациента для оценки степени риска развития возможных осложнений. Кроме того, показано наблюдение нейрохирурга или невролога, которые должны работать в тесной кооперации с гематологами, трансплантологами, иммунологами и врачами-лаборантами.

Основными критериями эффективности проведенного вмешательства является улучшение клинической симптоматики. Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависят от объема повреждения органа, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии проявляется в период от 1–3 дней до 12-16 месяцев после трансфузии, и оценивается клиническими шкалами и электрофизиологическими методами исследования (ЭКГ, церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией), а также комплексным уродинамическим исследованием у больных с повреждением спинного мозга.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

БМКП по настоящему изобретению может длительно храниться в замороженном виде, чтобы быть использованным в случае острой необходимости. При этом способность к последующей дифференцировке у клеток БМКП сохранена на уровне первоначально выделяемых СК.

Возможные осложнения в применении БМКП,

способы их профилактики и устранения

Не было отмечено ни одного факта осложнений после 1370 проведенных инфузий БМКП в кровь пациентов, что связано с применением аутологичного биоматериала. Применение аллогенного и аутологичного БМКП при введении с ликворное пространство также не сопровождалось витальными осложнениями. Иммунопривелигированность мозга позволяет вводить аллогенные клеточные системы, содержащиеся в БМКП, абсолютно спокойно, не подвергая больных риску отторжения вводимого биоматериала. Однако теоретически возможны аллергические реакции на криопрофилактик ДМСО в случае недостаточной его отмывки перед употреблением. Способы устранения подобных аллергических реакций являются стандартными. Для профилактики возможных аллергических реакций пациента на трансфузию БМКП целесообразно за 20 минут до манипуляции произвести однократное внутримышечное введение препарата дексометазон в дозе 4 мг/мл.

Наличие возможных осложнений после интратекальных и интравентрикулярных трансфузий БМКП заставляет проводить эти трансфузии только в условиях реанимации стационарного отделения. Возможные осложнения, их профилактика, диагностика и лечение суммированы в Таблице 2.

Таблица 2

Профилактика, диагностика и лечение возможных осложнений после интратекальных или интравентрикулярных трансфузий

аутологичных и аллогенных БМКП

Побочные эффекты Профилактика осложнений Диагностика и лечение Боль в месте пункции Применение спинальных игл малого диаметра Терапевт, невролог. Компрессы местно. Спинальная дуральная гематома (сдавление конского хвоста) Применение спинальных игл малого диаметра. Невролог, уролог, нейрохирург. Компрессы местно. Вплоть до хирургического вмешательства. Раздражение оболочек мозга Минимизация травматизации при люмбальной пункции Окулист, невролог, реаниматолог.
Обильное питье, кофеин, внутривенное введение кристаллоидных растворов. Отек головного мозга Нет Окулист, невролог, нейрореаниматолог. При необходимости дегидратационная терапия, дренирование желудочков с налаживанием постоянного мониторинга внутричерепного давления, поддержание адекватного перфузионного давления головного мозга, ИВЛ. Субарахноидальное кровоизлияние Отмена антиагрегенов и антикоагулянтов за несколько дней до люмбальной пункции Невролог, нейрохирург, реаниматолог. Люмбальная пункция, КТ головного мозга, гомеостатическая, дегидратационная терапия, поддержание адекватного перфузионного давления головного мозга, ИВЛ при необходимости. Повышение внутричерепного давления Нет Окулист, невролог, реаниматолог. МРТ головного мозга, поддержание адекватного перфузионного давления головного мозга, диагностическая люмбальная пункция. Инфекционные осложнения и обострение хронической инфекции, менингит, эпидуральный абсцесс, остеомиелит тел позвоночника Соблюдение правил асептики и антисептики Терапевт, невролог, хирург, реаниматолог. КТ или МРТ головного мозга, спинальная пункция. Антибиотикотерапия, дезинтоксикационная терапия. Выявление очагов инфекции. Головокружение
(несистемное, системное) Нет Контроль артериального давления. Осмотр невролога. Головные боли Применение спинальных игл малого диаметра Осмотр невролога. Обильное питье, кофеин, внутривенное введение кристаллоидных растворов. Повышение тонуса по спастическому типу Нет Осмотр невролога.
Центральные миорелаксанты или их комбинация, ЛФК, массаж, ботулотоксин. Повышение артериального давления Коррекция эмоционального статуса перед трансплантацией БМКП, премедикация перед люмбальной пункцией Осмотр терапевта. Гипотензивная терапия. Локальные и системные аутоиммунные реакции на клеточные препараты Десенсибилизирующая терапия, глюкортикоиды Терапевт, иммунолог, реаниматолог. Температурные системные реакции Десенсибилизирующая терапия, глюкокортикоиды Терапевт, иммунолог, реаниматолог.

Эффективность использования БМКП

За 17 лет экспериментального и клинического применения БМКП по настоящему изобретению (2003-2020 г.г,) было произведено сравнение эффективности применения 500 интратекальных инфузий неманипулированного аутологичного клеточного препарата ГСК (АКП ГСК) 120 пациентам с различными неврологическими заболеваниями с 1000 интратекальными и внутривенными трансфузиями БМКП по настоящему изобретению 150 пациентам с неврологическими болезнями и 100 пациентам с онкологическими заболеваниями. Эффективность регенераторного потенциала БМКП составила 71,2% и была доказана в клинике у больных с органическими заболеваниями центральной нервной системы. Было показано, что эффективность БМКП выше эффективности АКП ГСК на 10,1%, причем большая эффективность БМКП была показана у тяжелых пациентов с последствиями травм головного и спинного мозга в сравнении с клеточной терапией и традиционным медикаментозным лечением.

Для оценки эффективности терапии БМКП в комплексном лечении последствий тяжелой спинальной травмы были включены в клинический протокол 280 пациентов с травматической болезнью спинного мозга. Все пациенты с последствиями травмы спинного мозга были распределены на три группы: группа 1 (экспериментальная) – пациенты, получавшие лечение трансфузией БМКП (120 пациентов); группа 2 (контрольная № 1) – пациенты с травматической болезнью спинного мозга, получавшие лечение с применением АКП ГСК (80 пациентов) и группа 3 (контрольная № 2) – пациенты с травматической болезнью спинного мозга, получавшие традиционную медикаментозную терапию, которым проводилась диагностическая люмбальная пункция с введением 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl (80 пациентов). С целью объективизации полученных клинических результатов использовали специализированные шкалы: ASIA (Scale Аmerican Spinal Injuri Association) – Шкала Американской ассоциации спинальных повреждений и FIM (Scale Functional Independens) – Шкала функциональной независимости, а также данные магнитно-резонансной томографии, электронейромиографии, церебрального картирования ЭЭГ, комплексного уродинамического исследования, иммунохимического исследования крови и ликвора. Достоверно доказана высокая эффективность трансплантации БМКП в отличие от контрольных групп (p<0,05). Полученные данные подтверждены результатами обработки данных шкал ASIA и FIM, которые представлены в таблице 2.

Таблица 2

Ограниченные клинические исследования БМКП

№ Пациент,
возраст Уровень
трав
мы Время
после
трав-
мы
(годы) Статус
до
лечения Препарат
для
трансфузии Статус после лечения Время
после
лечения
(годы) Чувстви-
тельность Восста-
новление
движений Контроль
тазовых
органов ASIA FIM ASIA FIM 1 Г-на Р.,22 Т12 2,5 A 77 БМКП C 106 1,5 L3 Полное Полный 2 С-в Г., 35 С6 4 B 95 БМКП D 108 2 С6 Частичн. Полный 3 K-в Д., 24 С5 0, A 83 БМКП C 102 1 C6 Частичн. Частичн. 4 И-на Ж., 31 Т6 4 A 70 БМКП С 70 0,6 Т12 Частичн. Частичн. 5 А-в С., 46 T8 10 B 76 БМКП Д 108 0,5 T12 Частичн. Полный 6 Я-та А.,36 T11 5 A 57 БМКП B 96 0,5 L2 Частичн. Полный 7 Щ-в С.,42 C6 10 A 64 БМКП A 96 2 C7 Частичн. Полный 8 М-ва Б.,21 T6 3,5 B 66 БМКП C 122 1,5 T7 Частичн. Полный 9 С-в. Д, 24 С5 4 A 46 БМКП B 98 2 С5 Нет Полный 10 Т-в С.,30 T6 3 A 70 БМКП B 106 0,6 Т6 Нет Нет 11 Т-х О.,23 T2 4 A 62 БМКП В 97 0,6 Т4 Нет Полный 12 K-ен , 40 C5 5 A 46 АКП ГСК A 66 0, С6 Частичн. Частичн. 13 Л-ка М., 42 С5 2 A 36 АКП ГСК В 64 0,5 С5 Частичн. Полный 14 Ч-ва С, 14 T12 2,5 A 86 АКП ГСК C 122 3 Т10 Част. Частичн..

Таким образом, эффективность применения БМКП для лечения пациентов с травматической болезнью спинного достигает 71,5%. Применение традиционной медикаментозной терапии не приводит к значительному улучшению неврологической симптоматики.

Применение аутологичного БМКП у различных онкологических больных в процессе проведения курсового противоопухолевого лечения опухолей с применением высокодозной химиотерапии или лучевой терапии в 96% случаев позволило обеспечить стабильное и программное проведение сеансов конвенциональной лекарственной и лучевой терапии, даже несмотря на наличие критических повреждений гемопоэза и иммунопоэза у пациента в процессе данного лечения, что позволило значительно (в 60,5% случаев) повысить эффективность проводимой противоопухолевой терапии.

БМКП и способ его получения по настоящему изобретению обеспечивают восстановление постгеномных генетически и эпигенетически детерминированных регуляторных, кроветворных и саногенетических молекулярно-биологических характеристик ГСК пациента путем трансплантации БМКП в организм пациента в миелоаблативном режиме после лечения химиотерапией или лучевой терапией и позволяют "перезапустить" гемопоэз и восстановить нормальную работу всех клеток иммунной системы, а при интратекальном введении БМКП обеспечить регенерацию нервной ткани.

БМКП может быть рекомендован для применения в лечения целого ряда онкологических болезней, нейродегенеративных заболеваний и последствий нейротравм, а также аутоиммунных заболеваний, для профилактики старения и увеличения продолжительности жизни и активного долголетия человека.

Клиническое применение БМКП для лечения травм головного и спинного мозга

Пример 1

Больной Щ, 40 лет. Поступил в клинику с диагнозом: Отдаленные последствия тяжелой вертеброспинальной травмы в 1994 г. Последствия компрессионного перелома С6-С7 позвонков с повреждением спинного мозга в виде интрамедуллярной кисты на уровне С5-С6 с нижней спастической параплегией и парапарезом верхних конечностей, нарушением функции тазовых органов. Травма позвоночника и шейного отдела спинного мозга получена в 1994 году в автоаварии. Длительное время лечился в специализированных учреждениях и реабилитационных центрах для спинальных больных. В клинической картине преобладают симптомы нижней спастической параплегии и глубокого парапареза верхних конечностей, нарушение функции тазовых органов в виде недержания мочи и кала. В течение 10 лет адаптировался к своему состоянию, самостоятельно себя обслуживал в пределах дома. После полного обследования в рамках протокола отраслевой программы "Новые клеточные технологии – медицине" было принято решение о проведении больному курса терапии аутологичным БМКП по настоящему изобретению. Для этого после стимуляции кроветворения нейпогеном в течении 4 дней через периферические вены произведен сеанс сбора периферических СК на сепараторе СОВЕ Спектра. Длительность сеанса 60 минут, скорость кровотока 60 мл/мин. За сеанс получено 1,6×10⁸ ядросодержащих клетокг и 2,7(0,005)×10⁶ СД34+ клеток на кг массы тела. Клетки были прокультивированы в среде, препятствующей дифференцировке, согласно настоящему изобретению, затем обработаны ДМСО и криоконсервированы в 20 пробирках, каждая равным объемом по 1 мл в пробирке. Взвесь БМКП в объеме 1 мл, смешанная с 2 мл ликвора, вводилась пациенту интратекально. Побочные эффекты не отмечены. В клинической картине в течение 7 дней после трансфузии отмечалась положительная динамика: появились движения в пальцах кисти правой и левой руки, восстановилась мелкая моторика (использует пальцы для самообслуживания, берет пальцами предметы туалета), расширился объем движений в предплечьях больше слева, появилось несколько "пятен" нормальной чувствительности на ногах, появились незначительные движения большого пальца правой стопы, стал управлять мышцами брюшного пресса. Через 1,5 месяца появились отводящие и приводящие движения в обеих нижних конечностях, движение стопой вверх и вниз. Отмечены отчетливые улучшения электропроводимости в руках и ногах больше слева при контрольной электронейромиографии. Через 3 месяца восстановилась функция тазовых органов: стал контролировать дефекацию и мочеиспускание, что подтверждено данными комплексного уродинамического исследования.

Катамнез через 2 года. Все позитивные изменения после трансплантации клеток БМКП стойко удерживаются, улучшилось общее состояние, изменилось в лучшую сторону качество жизни, значительно расширился объем движений в ногах и руках, полностью контролирует мочеиспускание и дефекацию, в течении 2-х лет не использует катетер, полностью отказался от памперсов, самостоятельный ежедневный полностью контролируемый стул. Очень доволен результатами лечения.

Пример 2

Больной Г., 22 лет, повторно находился в клинике с 08.03.2004 г. по 15.04.2004 г. с клиническим диагнозом: Последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы, перелома Th₁₂ позвонка. Нарушение функции тазовых органов.

Сопутствующие диагнозы: Очаговый атрофический гастрит. Хронический цистит. Хронический пиелонефрит. Мочекаменная болезнь. Состояние после эпицистостомии (2003). Состояние после операции - трансуретральной эндовезикальной механической цистолитотрипсии, цистолитотапаксии (2004).

При поступлении предъявлял жалобы на отсутствие движений и чувствительности в нижних конечностях, нарушение мочеиспускания и дефекации.

История заболевания: 20.10.2001 г. упал с высоты 10 м. После травмы, со слов родственников, была длительная потеря сознания. Сразу был доставлен в больницу по месту жительства, где, придя в себя, больной обнаружил, что отсутствуют движения и чувствительность в ногах. На третий день пребывания в больнице была выполнена декомпрессионная ламинэктомия Th₁₂, установлена титановая стабилизирующая система. Движения и чувствительность в ногах не появились. Неоднократно проходил обследование и лечение в различных лечебно-профилактических учреждениях без значительного эффекта. Поступил повторно в клинику "НейроВита" для обследования и лечения в рамках отраслевой научно-исследовательской программы РАМН "Новые клеточные технологии – медицине".

Неврологический статус при поступлении: сознание ясное. Зрачки равные, средней величины. Фотореакция живая, D≥S. Несколько сглажена правая носогубная складка. Небольшая девиация языка вправо. Выраженная девиация язычка вправо. Глоточный рефлекс сохранён. Остальные ЧМН без видимой патологии. Мышечный тонус в конечностях несколько снижен. Двигательных и чувствительных нарушений в верхних конечностях нет. Патологический симптом Россолимо с обеих сторон.

Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя спастическая параплегия. Рефлексы на ногах оживлены, больше справа. Клонические подёргивания нижних конечностей при исследовании пассивных движений. Проводниковая анестезия всех видов чувствительности с дерматома Th₁₂ слева и L₁ справа. Симптомы Бабинского, Пуссепа, Гордона и Шеффера вызываются с обеих сторон. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу. Менингеальных знаков нет. При повторной госпитализации отмечается улучшение неврологического статуса - больной способен производить движения в тазобедренных суставах с помощью медиальной и латеральной групп мышц бедер.

МРТ грудо-поясничного отдела позвоночника и головного мозга, заключение: состояние после ламинэктомии Th₁₂, установка титанового фиксатора на уровне Th₁₁–Th₁₂. Отмечается клиновидная деформация тела Th₁₂; лёгкая клиновидная деформация тела Th₁₁. Отмечается неравномерное снижение высоты и изменение МР-сигнала межпозвонкового диска Th₁₁—Th₁₂ с небольшой (~ 0,2 см) его протрузией сзади. При исследовании поясничного отдела патологических изменений не выявлено. При исследовании головного мозга патологических сигналов в веществе мозга не получено. Имеются умеренное асимметричное расширение переднего рога левого бокового желудочка; лёгкое расширение конвекситальных субарахноидальных пространств в лобно-теменной области. Заключение: Состояние после ламинэктомии Th₁₂; титановый фиксатор Th₁₁—Th₁₂; компрессионный перелом тела Th₁₂, признаков блока ликворопроводящей системы не выявлено.

Трижды, 22.03.2004, 25.03.2004 и 05.04.2004 г. с информированного согласия больного была проведена инфузия аутологичного БМКП в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось 6,3×10⁶ CD34+ клеток. Все манипуляции больной перенёс удовлетворительно.

Таким образом, больной, перенёсший тяжёлую позвоночно-спинномозговую травму с нижней параплегией, поступал в клинику для лечения в рамках отраслевой программы РАМН "Новые клеточные технологии – медицине", а также реабилитационного лечения. В ходе дообследования были установлены показания для введения аутологичного БМКП: отсутствие антител к нейроспецифическим белкам в сыворотке крови и в ликворе, отрицательный результат анализа на нейротропные вирусы в сыворотке крови и в ликворе, благополучный клинический анализ ликвора и нормальные показатели анализов крови. Параллельно больному активно проводились лечебная физкультура, занятия в тренажёрном зале (в том числе на тредмиле), массаж, физиопроцедуры. Также больному проводилась симптоматическая консервативная терапия.

Во время нахождения в клинике больному проводилась электростимуляция, электрофорез на область мочевого пузыря. Также, совместно с клеточными технологиями была продолжена поэтапная реабилитационная программа, которая помогла получить неврологическую положительную динамику. Активно проводились индивидуальные занятия с инструктором ЛФК: комплексы упражнений в горизонтальном положении, на тренажёре Дикуля и тредмиле, силовой гимнастики, дыхательной гимнастики, массаж. С целью улучшения моторики мочевого пузыря применялась электростимуляция области мочевого пузыря. На фоне проведённого лечения у больного наросла мышечная масса, он стал уверенно в сопровождении персонала ходить в ортезах, начал сгибать бёдра в тазобедренных суставах в облегчённом положении, стали замыкаться коленные суставы, может осуществить шаговую фиксацию.

Катамнез через 2 года. Больной нарастил мышечную массу ног практически до нормального состояния, самостоятельно ходит с опорой на "ходунки", восстановилась половая функция, полностью стал контролировать дефекацию, но мочеиспускание осуществляет с использованием катетеризации, появилась мозаичная болевая чувствительность в ногах. Врачи, направившие его на лечение и сам больной удовлетворены результатами проведенной терапии

Пример 3

Больная Б., 1957 г.р., поступила в клинику "НейроВита" 06.10.2004 г. с диагнозом: Состояние после тяжелой сочетанной травмы от 11.07.2004 г. Ушиб головного мозга тяжелой степени с очагами ушиба и внутримозгового кровоизлияния в подкорковых образованиях левого полушария, правой лобной доли и стволе головного мозга. Диффузное аксональное повреждение. Хроническое вегетативное состояние, апаллический синдром. Правосторонняя гемиплегия.

Сопутствующие заболевания: Перелом основания левой дужки С6 позвонка и остистых отростков С6-Д1 позвонков. Открытые оскольчатые внутрисуставные переломы обеих голеностопных суставов.

Осложнения: Дисбактериоз кишечника, псевдомембранозный колит. Трахеобронхит, последствия перенесенной аспирационной и гипостатической респиратор-ассоциированной пневмонии. Пиелонефрит. Пролежни.

Краткий анамнез: 11.07.2004 г. попала в ДТП. По данным медицинской документации доставлена в ЦРБ (г. Великие Луки) из Горонецкой ЦРБ 12.07.2004 г. в бессознательном состоянии. С ушибом головного мозга тяжелой степени, переломом голеностопных суставов и шоком 3-й степени. После стабилизации состояния 22.07.04 переведена в нейрореанимационное отделение. Во время транспортировки состояние с отрицательной динамикой – прогрессирующее нарастание глубины комы, появление дыхательных расстройств, в связи с чем переведена на продленную ИВЛ с последующим наложением трахеостомы. Течение заболевания осложнилось развитием респиратор-ассоциированной пневмонии с эндотоксикозом и паренхиматозной ОДН, тяжелым дисбактериозом с длительной диареей. Выставлялся предположительный диагноз: псевдомембранозный колит (нормализация стула после курса ванкомицина и вералапирама). По стабилизации состояния 26 августа 2004 года переведена в 1 ПНО 3 ЦВКГ для дальнейшего лечения. В сентябре 2004 г. в крови высевалась синегнойная палочка (получала курс цефтриаксона, дифлюкана, сульперазона). На фоне проведения психостимулирующей терапии (ноотропил + малые дозы кетамина) у больной отмечался эпистатус, после купирования которого, продолжена нейропротекторная терапия.

Больная госпитализирована в клинику "НейроВита" 06.10.2004 г. По данным обследования в 3 ЦВКГ:

Состояние при поступлении: Состояние больной средней тяжести. Правильного телосложения, обычного питания. Кожа обычного цвета, чистая. Пролежни в крестцовой области и в области голеностопных суставов сухие, чистые, без признаков перифокального воспаления. Видимые слизистые обычного цвета, чистые. Подкожные лимфатические узлы не увеличены, безболезненны при пальпации. На шее посттрахеостомический рубец. На обеих голеней наложены гипсовые лангеты, иммобилизация по поводу переломов голеностопных суставов. Отеков, цианоза нет. Дыхание самостоятельное, адекватное. Признаков рубцового стеноза трахеи нет. В легких дыхание проводится во все отделы, с жестким оттенком. Проводные хрипы. Редкий продуктивный кашель. ЧДД 18 в мин. Сердечные тоны ясные, ритмичные, шумов нет. АД 110/75 мм рт. ст. Пульс 102 в 1 мин., ритмичный, удовлетворительных качеств. Температура тела - 36,7 гр. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный во всех отделах, участвует в акте дыхания, перитонеальных знаков нет. Перистальтика активная. Диспепсии нет. Назо-гастральный зонд. Зондовое питание усваивает. Нарушена функция тазовых органов: не контролирует мочеиспускание и дефекацию.

Неврологический статус: Словесному контакту недоступна, команды не выполняет. Речь отсутствует. Глотает с трудом. Сходящее косоглазие. Спонтанный нистагм. Попытки фиксации взора. Сглажена правая носогубная складка. Правосторонняя спастическая гемиплегия, гемианестезия. Движений в правых конечностей нет. Движения (в т.ч. на раздражители) в левых конечностях непроизвольные. Рефлексы с рук высокие выше справа. Брюшные не вызываются. Симптом Бабинского справа. Менингеальных знаков нет.

С целью определения возможности осуществления программы применения аутологичного БМКП проведен комплекс клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования.

МРТ головного мозга (3.10.2004): В левой теменно-затылочной области головного мозга определяется обширный участок атрофии, некоторое расширение субарахноидальных пространств и заднего рога левого бокового желудочка. В правой лобно-теменной и левой теменной областях определяются небольшие очаговые участки атрофии до 1 и 0,7 см соответственно. Очаг хр. гематомы до 1 см в области левой ножки мозга. В шейном отделе позвоночника определяются протрузии межпозвоночных дисков С4-5, С5-6, С6-7.

УЗИ органов брюшной полости (12.10.2004): Печень незначительно увеличена в размерах (КВР пр. доли 16,6 см) с ровным контуром, однородная. Желчный пузырь без особенностей. Поджелудочная железа не увеличена, не изменена. Почки обычных размеров, формы и расположения, ЧЛС не расширена. Селезенка увеличена в размерах 13,5–6,8 см (норма 12-6), однородной структуры.

ЭХО-КГ (12.10.2004): Аорта не расширена. Камеры сердца не увеличены. Миокард утолщен. Зон гипокинеза не выявлено. Глобальная сократительная способность удовлетворительная. В полости перикарда около 100 мл жидкости.

ЭЭГ (11.10.2004): Грубые диффузные изменения биопотенциалов коры головного мозга с признаками дисфункции стволово-диэнцефальных структур с очаговыми нарушениями и эпилептиформной активностью в левой теменно-затылочной области. Признаки снижения порога судорожной готовности.

Электромиография (22.10.2004): При стимуляции n. medianus с 2х сторон получен М–ответ. Справа – амплитуда умеренно снижена до 3,7 мВ, показатели латентности и длительности в пределах нормы. СПИ снижена до 39 м/с (норма 55-65). Слева – показатели М-ответа в пределах нормы. СПИ 50 м/с. При исследовании n. peroneus справа М-ответ не вызывается, слева – вызывается лишь из проксимальной точки стимуляции со сниженной амплитудой до 2,9 мВ (норма 4-5 мВ).

Rg костей голени, коленных и голеностопных суставов (22.10.2004): В коленных суставах отмечается неравномерное сужение суставных щелей преимущественно в медиальных отделах, субхондральный остеосклероз суставных поверхностей большеберцовых костей. Признаков костной деструкции не выявлено. В костях голеней справа определяются линии перелома латеральной лодыжки малоберцовой кости и медиальной лодыжки большеберцовой кости со смещением отломков. Слева определяются линии оскольчатого перелома латеральной лодыжки малоберцовой кости и косая линия перелома нижней трети диафиза левой большеберцовой кости со смещением отломков. Признаки консолидации отломков не выявлены.

Rg - грудной клетки (8.10.2004): Легочный рисунок усилен, сгущен. Явных очаговых и инфильтративных изменений не выявлено. Сердце расширено влево. Синусы свободны.

Rg - правого локтевого сустава: Определяются признаки артроза.

Дуплексное сканирование брахиоцефальных сосудов: Тромбоз яремной вены справа, извитость позвоночных артерий.

Проводилась интенсивная нейропротекторная (глиатилин, актовегин, кортексин, семакс), сосудистая (нимотоп), метаболическая (милдронат), а/б с учетом данных посевов и антибиотикограмм (курс максипима, затем амикацин + ципрофлоксацин), антистафилококовый бактериофаг, иммунозаместительная терапия (антисинегнойная плазма), иммунокоррекция (полиоксидоний, иммунофан), эубиотики, бронхо-муколитическая (АСС) терапия, санационные бронхоскопии, нутритивная поддержка (парентеральное и зондовое питание с постепенным переходом на самостоятельное. ЛФК, массаж, токи низкой частоты и УФО на пролежни. Динамическое наблюдение нейрохирургом и неврологом.

На фоне проводимой терапии отмечалась стабилизация состояния: нормализация температуры тела, уровня лейкоцитов, уменьшение количестваа мокроты и изменение ее характера (слизистая), повышение уровня бодрствования. Гемодинамика стабилизировалась, тахикардия ушла. Сохранялись умеренные явления трахеобронхита без признаков дыхательной недостаточности. После достижения стабилизации в соматическом статусе произведен сбор ГСК и изготовлен аутологичный БМКП согласно настоящеему изобретению. При отсутствии противопоказаний, с согласия родственников 20.10.2004, произведена субарахноидальная цитотрансфузия (без осложнений) аутологичного БМКП. После динамического наблюдения и продолжения плановой терапии в течение 6 дней при отсутствии противопоказаний 26.10.2004 произведена повторная субарахноидальная цитотрансфузия аутологичного БМКП. В течение последующих суток отмечено ухудшение состояния: гипертермия до 39ºС, резистентная к нестероидным противовоспалительным препаратам, заторможенность, умеренная ригидность затылочных мышц, рвота, тахикардия, одышка. При этом данных об активизации очагов хронической инфекции не выявлено: отсутствие лейкоцитоза, палочкоядерного сдвига, динамике на рентгенограмме органов грудной клетки. При диагностической люмбальной пункции получен бесцветный прозрачный ликвор, отмечено высокое ликворное давление. Состояние расценено как осложнение цитотрансфузии. Проводилось наружное охлаждение, инфузии охлажденных растворов, литические смеси, неспецифическая дезинтаксикационная терапия, противоотечная терапия. С учетом возможности активизации очагов хронической инфекции и данных посевов проведен курс а/б терапии меронемом. Проводимая терапия с эффектом: в течение последующих 5 дней состояние стабилизировалось, осложнения цитотрансфузии купированы.

В течение ноября 2004 г. произошла полная стабилизация в соматическом статусе. Полностью купированы явления трахеобронхита, дисбактериоза, мочевой инфекции. При отсутствии нарушений глотания полностью переведена на самостоятельное питание. Прекращена инфузионная терапия. При наличии признаков полной консолидации переломов сняты гипсовые лангеты с голеней. Пролежневые дефекты кожи полностью закрылись. Расширена реабилитационная программа. Активизирована до сидячей каталки (сидит до 4-5 часов в день). Стабилизация в соматическом статусе позволила интенсифицировать программу клеточной реконструкции нейрональной ткани. Цитотрансфузии проводились до 2-3 раз в месяц. Осложнений не наблюдалось. По данным ЭЭГ с ноября 2004 г. отмечалась явная положительная динамика. Вначале уменьшение признаков снижения порога судорожной готовности, затем уменьшение признаков дисфункции стволово-диэнцефальных структур с очаговыми нарушениями и эпилептиформной активностью в левой лобно-височно-теменной области.

В неврологическом статусе отмечается положительная динамика: фрагментарно ориентирована в пространстве, собственной личности. Появилась реакция на слуховые и зрительные раздражители. На фоне сходящегося стробизма за счет левого глаза фиксирует взгляд на предметах правым глазом с одновременным закрыванием левого. Правильно выполняет простейшие команды. Периодически произносит отдельные слова и предложения. Отмечаются персеверации, эхолалия. Нарушение памяти на текущие события. Эмоционально лабильна. Уменьшился спастический тонус мышц в правой руке. С декабря 2004 г. отмечалась более яркая положительная динамка. Стала узнавать медперсонал, родственников, знакомых. Появились самостоятельные попытки установить словесный контакт. Расширился словарный запас. Попытки самостоятельного построения фраз, предложений (экспрессивная речь). Расширилась психоэмоциональная сфера (стремление к невербальному контакту дополнило вербальный). С февраля 2005 г. значительно повысился уровень сознания. В ходе занятий с психологом стала выполнять пробы на обобщение понятий, выделение лишнего (синтез и анализ – основные операции мышления).

В настоящий момент отмечается синусоидально-прогрессивный уровень сознания, что проявляется, прежде всего, на вербальном уровне в изменении удельного веса этой активности слова (речевой автоматизм, эхолалия, словесная окрошка, самостоятельная речь). Относительная устойчивость навыка самообслуживания (прием пищи, одевание). Эмоционально лабильна. Устойчиво проявляется потребность в общении с родственниками. Неустойчиво осознает собственную личность и свое настоящее положение.

В целом - за время наблюдения состояние положительной динамикой, в настоящий момент ближе к средней тяжести. Тяжесть состояния обусловлена посттравматической энцефалопатией, неврологическим дефицитом, общей астенизацией.

Катамнез через 3,5 года. Полностью ориентирована в месте времени и собственной личности. Эмоционально неустойчива. Интеллект соответствует возрасту и жизненному опыту. Амнезирует обстоятельства травмы и время в течение 6-7 месяцев после травмы. Стойкое сходящееся косоглазие. Речь обеднена, глотание не нарушено. Прибавила в весе около 20 кг. Стойкая контрактура и спастичность мышц правой руки. Обслуживает себя в пределах постели, передвигается с помощью инвалидной коляски.

Клиническое применение аллогенного БМКП

для лечения онкологических больных

Пример 4

Больная У-ва О.А. Дата рождения: 22.11.1960. Дата поступления: 30.08.2017. Дата выписки: 31.08.17. Основной диагноз: рак левой молочной железы, T4N1M0 IIIВ стадия. Состояние после комплексного лечения в 2014 г. (неоадъювантная химиотерапия + радикальная резекция левой молочной железы + лучевая терапия). Прогрессирование в феврале 2015 г., единичный метастаз в головной мозг. Состояние после стериотаксической ЛТ, СОД = 24 Гр. Прогрессирование в ноябре 2016 г., рецидив в правой височной доле головного мозга и появление 2-х новых метастазов в правой гемисфере мозжечка. Состояние после удаления рецидивной опухоли от 24.11.16 г. Состояние после лучевой терапии на ложе удалённой опухоли СОД = 30Гр, по краю ложа СОД = 40 гр., ЛТ на область 2-х метастатических очагов в правой гемисфере мозжечка СОД = 24 Гр. Прогрессирование в январе 2017г., продолженный рост опухоли в левой молочной железе, метастазы в головном мозге. Состояние после 4-х курсов химиотерапии (цисплатин + паклитаксел) с 15.02.17 г. Стабилизация в процессе иммунотерапии.

Гистологическое исследование: инвазивная протоковая карцинома. ИГХ: РЭ=0 баллов, РП=0 баллов, HER2neu-негатив, Ki 67-75%. BRCA1 положительный.

Жалобы: на общую слабость, головные боли, неустойчивость походки, головокружения.

Анамнез заболевания:

В феврале 2014 г. самостоятельно обнаружила опухоль в левой молочной железе. При обследовании при ПЭТ/КТ в наружном квадранте левой молочной железы опухоль 66×40 мм с продолжением в верхний квадранте 36×48 мм. Три увеличенных аксиллярных лимфатических узла с левой стороны. Других проявлений болезни не выявлено. В марте биопсия опухоли молочной железы. Гистологическое исследование: инвазивная протоковая карцинома. ИГХ: РЭ=0 баллов, РП= 0 баллов, HER2neu- негатив, Ki 67-75%. BRCA1 положительный. Установлен диагноз: рак левой молочной железы, T4N1M0 IIIВ стадия. В марте 2014 г. пациентка получала комплексное лечение –неоадъювантную химиотерапию (эпирубицин + циклофосфамид каждые 2 недели 4 цикла, далее паклитаксел каждые 2 недели 4 цикла). Отмечен полный ответ на лечение. В июле 2014 г. радикальная резекция левой молочной железы. С учётом наличия гена BRCA1 предлагался второй этап операции - двусторонняя подкожная мастэктомия и овариэктомия. Плановое гистологическое исследование: полный патоморфоз. В сентябре 2014 г. ДЛТ на область левой молочной железы и регионарные зоны. Пациентка наблюдалась 1 раз в 3 месяца. В феврале 2015 г. при контрольном обследовании ПЭТ/КТ и МРТ головного мозга выявлен единичный метастаз в правой височной доле размером 16 мм. Тогда же была проведена стереотаксическая лучевая терапия СОД 24 Гр на головной мозг. При последующем наблюдении полный регресс зоны облучения, по другим органам без прогрессирования и рецидива. В ноябре 2016 г. рецидив в правой височной доле головного мозга и появление 2-х новых метастазов в правой гемисфере мозжечка.

24.11.16 г. операция: удаление опухоли правой височной доли головного мозга. Гистологическое исследование: метастаз рака молочной железы трипл-негативный. С 22.12.2016 г. по 27.01.2017 г. на ложе удалённой опухоли в правой височной доле головного мозга проведена ЛТ ( СОД=30 Гр, по краю ложа СОД = 40 Гр). С 26.12.2016 г. по 30.12.2016 г. ЛТ на область 2-х метастатических очагов в правой гемисфере мозжечка СОД = 24 Гр. рекомендован приём кселоды 4000 мг/сутки. Контрольная МРТ головного мозга на 27.04.2017 г.

02.02.2017 г. ПЭТ/КТ: признаки процесса с поражением левой молочной железы с низкой метаболической активностью. В головном мозге данные могут соответствовать метастатическому поражению головного мозга на фоне ДЛТ. Для оценки состояния головного мозга – сопоставить с данными МРТ.

06.02.2017 г. пациентка госпитализирована в клинику "НейроВита" для обследования и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения: 06.02.2017 г. онкомаркеры СА 125 -10,1 Ед/мл, СА15.3 - 7.4 Ед/мл, 06.02.2017 г. рентгенография органов грудной клетки: в лёгких без очаговых и инфильтративных изменений. Эффективная доза 0,012 мЗв. 07.02.2017 г. УЗИ органов брюшной полости и малого таза: диффузные изменения печени и поджелудочной железы, жировая инфильтрация. В малом тазу без очаговой патологии. 07.02.2017 г. пересмотр в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина". CD МРТ головного мозга от 20.12.2016 г.: постоперационное кистозное образование правой височной доли с наличием не менее трёх очагов по его периферии, которые следует дифференцировать между прогрессированием заболевания (продолженный рост?) и постоперационными грануляционными образованиями (что менее вероятно). Для уточнения характера образований рекомендуется динамическое наблюдение и при наличии показаний повторная МРТ не менее, чем через 1 месяц в условиях ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина". 07.02.2017 г. маммография + УЗИ молочных желёз и регионарных лимфатических узлов в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": злокачественное образование левой молочной железы (у границы наружных квадрантов левой молочной железы опухоль 1,5×1,4 см.). Регионарные лимфатические узлы не увеличены.

09.02.2017 г. МРТ головного мозга с контрастом в ФГБУ "НМИЦ онкологии им Н.Н. Блохина". Постоперационное кистозное образование правой височной доли с наличием не менее четырёх очагов по его периферии, три из которых с вовлечением правого полушария мозжечка следует дифференцировать прежде всего с прогрессированием заболевания (продолженный рост?), а один – у переднего контура кистозного образования - между прогрессированием заболевания (продолженным ростом?) и постоперационными грануляционными образованиями. 10.02.2017 г. консультация химиотерапевта отделения химиотерапии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, к.м.н. Н.С. Бесовой: рекомендовано проведение химиотерапии по схеме: цисплатин 75 мг/м² в 1-й день+паклитаксел по 80 мг/м² в 1-й, 8-й, 15-й дни. Продолжительность цикла 28 дней. Оценка динамики после 2-х курсов. 14.02.2017 г. постановка венозной порт-системы в правую ярёмную вену. 15.02.2017 г. после стандартной премедикации и водной нагрузки начат 1-й курс химиотерапии, внутривенно капельно введено: цисплатин 150 мг, паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 22.02.2017 г. после стандартной премедикации внутривенно капельно введено (8-день 1-го курса): паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 01.03.2017 г. после стандартной премедикации внутривенно капельно введено (15-день 1-го курса): паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 15.03.2017 г. после стандартной премедикации внутривенно капельно введено (1-день 2-го курса): цисплатин 150 мг; паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 22.03.2017 г. после стандартной премедикации внутривенно капельно введено (8-день 2-го курса): паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 29.03.2017 г. после стандартной премедикации внутривенно капельно введено (15-день 2-го курса): паклитаксел 160 мг. Введение без осложнений. 10.04.2017 г. маммография + УЗИ молочных желёз и регионарных лимфатических узлов в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": по сравнению с исследованием от 07.02.2017 г. в левой молочной железе на границе наружных квадрантов объёмное образование уменьшилось в размере от 1,5×1,4 см до 0,99×1,2 см. Структура образования стала сравнимой с окружающей тканью. Правая молочная железа без особенностей. Регионарные л/у не увеличены. 11.04.2017 г. КТ органов грудной и брюшной полостей с контрастом в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": в базальных отделах левого лёгкого по междолевой плевре выявляется мелкое очаговое уплотнение не более 0,2 см в диаметре (фиброз?, интрапульмональный лимфатический узел?) - желателен контроль. Печень с признаками жировой дистрофии. В S7 подкапсульно визуализируется очаг пониженной плотности 0,8 см в диаметре - скорее всего киста. Убедительных КТ-признаков прогрессирования основного заболевания не выявлено.

11.04.2017 г. МРТ головного мозга с контрастом в ФГБУ "НМИЦ онкологии им Н.Н. Блохина". По сравнению с данными МРТ от 09.02.2017 г. киста правой височной доли дополнительно уменьшилась в объёме до 2,80×1,16×2,45 см с 2,96×1,35×2,68 см. У переднего контура кистозного образования единичное образование височной доли незначительно увеличилось до 0,54×0,45×0,28 см с 0,56×0,34×0,34 см и двух очагов у нижнего медиального контура кистозного образования с вовлечением правого полушария мозжечка, которые также несколько увеличились до 0,86×0,56×0,48 см с 0,68×0,66×0,48 см и до 0,78×0.74×0,45 см с 0,58×0,50×0,46 см соответственно. Дорсальнее сохраняется мелкий очаг оболочек образования аналогичной структуры с минимальным вовлечением вещества правого полушария мозжечка, размер которого незначительно уменьшился до 0,36×0,32×0,18 см с 0,38×0,34×0,15 см. Других очагов специфического накопления МР-контрастного средства структурами головного мозга не выявлены. Других существенных изменений с данными МРТ от 09.02.17 г. не выявлено.

Пациентка госпитализирована в клинику "НейроВита" для проведения МРТ головного мозга с контрастом. 01.06.2017 г. МРТ головного мозга с контрастом: состояние после комбинированного лечения очага вторичной специфической природы правой височной доли рака молочной железы от 24.11.2016 г. Послеоперационное кистозное образование правой височной доли с наличием не менее пяти очагов по периферии (два слились в конгломерат с вовлечением правого полушария мозжечка) - прогрессирование заболевания. 06.06.2017 г. УЗИ органов брюшной полости: диффузные изменения печени и поджелудочной железы, жировая инфильтрация. 06.06.2017 г. КТ органов грудной и брюшной полостей в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": по органам грудной и брюшной полостей данных наличие очагов, подозрительных в отношении мтс не выявлено. По сравнению с исследованием от 11.04.2017 г. без признаков прогрессирования. 07.06.2017 г. маммография + УЗИ молочных желёз в РОНЦ: по сравнению с исследованием от 10.04.2017 г. в левой молочной железе опухолевые образования не определяются. 14.06.2017 г. пациентка заочно обсуждена совместно с химиотерапевтом д.м.н. Л.Г. Жуковой и онкохирургом д.м.н. проф. Д.В. Комовым: учитывая распространённость опухолевого заболевания, метастазы в головной мозг и данные контрольного обследования, в настоящее время проведение хирургического лечения в объёме двусторонней мастэктомии и овариэктомии нецелесообразно. Рекомендовано продолжить проводимую химиотерапию по схеме: цисплатин 75 мг/м² в 1-й день + паклитаксел по 80 мг/м² в 1-й, 8-й, 15-й дни. Рекомендовано добавить к схеме лечения бевацизумаб 7,5 мг/кг внутривенно 1 раз в 21 день. Оценка динамики каждый 2-й курс. 19.06.2017 г. ЦДС вен нижних конечностей: исследованные поверхностные и глубокие вены нижних конечностей полностью проходимы. 19.06.2017 г. ЭГДС: умеренно выраженный гастрит, язвы антрального отдела, биопсия. 21.06.2017 г. гистологическое исследование в ФГБУ РОНЦ: полиповидный кусочек гиперплазированного покровно-ямочного эпителия. 26.06.2017 г. ЭГДС: поверхностный гастрит. Проведен курс иммунотерапии:

30.06.2017 г. внутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина;

05.07.2017 г. интратекально БМКП;

12.07.2017 г. интратекально БМКП;

13.07.2017 г. ввнутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина;

14.07.2017 г. внутривенно препарат персонифицированных цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ);

19.07.2017 г. интратекально БМКП;

20.07.2017 г. внутривенно БМКП;

26.07.2017 г. интратекально БМКП;

27.07.2017 г. внутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина;

28.07.2017 г. внутривенно препарат персонифицированных ЦТЛ.

03.08.2017 г. МРТ головного мозга с контрастом в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": постоперационное кистозное образование правой височной доли с наличием не менее пяти очагов по его периферии (три из которых слились в конгломерат с вовлечением правого полушария мозжечка) - прогрессирование заболевания. Мелкие очаги лобных долей как проявление микроангиопатии. МР-признаки последствий неспецифического воспаления оболочек головного мозга.

09.08.2017 г. интратекально БМКП;

10.08.2017 г. внутривенно персонифицированный препарат ЦТЛ + внутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина.

15.08.2017 г. МРТ головного мозга с контрастом в ФГБУ "НМИЦ им Н.Н. Блохина": постлучевой характер изменения правой гемисферы и намёта мозжечка (постлучевой некроз). Послеоперационная полость правой височной доли без очагового патологического накопления РФП - дальнейший контроль по МРТ.

16.08.2017 г. интратекально БМКП;

17.08.2017 г. внутривенно персонифицированный препарат ЦТЛ + внутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина;

23.08.2017 г. интратекально БМКП;

24.08.2017 г. внутривенно персонифицированный препарат ЦТЛ.

Пациентка госпитализирована в клинику "НейроВита" для очередного курса иммунотерапии.

Аллергические реакции: отрицает.

Анамнез жизни: росла и развивалась соответственно возрасту, в физическом и умственном развитии от сверстников не отставала.

Объективно: Состояние относительно удовлетворительное, ECOG-0. Пациентка в ясном сознании, контактна, адекватна, передвигается самостоятельно. Температура тела 36,6°С. Кожный покров бледно-розовый, тургор мягких тканей сохранён. Молочные железы симметричные, соски и ореолы не изменены, выделений из сосков нет. На коже левой молочной железы послеоперационный рубец без признаков воспаления и рецидива. При пальпации молочные железы без узловых и инфильтративных образований. Периферические лимфатические узлы не пальпируются. Дыхание самостоятельное, везикулярное, хрипов нет. ЧДД = 17 в мин. SpO₂ – 98% на воздухе. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС=78 уд. в мин. АД= 125/70 мм рт. ст. Живот мягкий, увеличен за счёт подкожно-жировой клетчатки, при пальпации безболезненный, перистальтический шум выслушивается, печень по краю рёберной дуги. Мочеиспускание незатруднённое, безболезненное. Стул регулярный.

Лечение:

30.08.2017 г. интратекально БМКП;

31.08.2017 г. внутрикожно противоопухолевая дендритная вакцина;

31.08.2017 г. консультация профессора д.м.н. Д.В. Комова: рекомендовано оперативное лечение в объёме двусторонней мастэктомии с подмышечной лимфодиссекцией слева. Лечение проведено согласно Московским городским стандартам оказания стационарной медицинской помощи для взрослого населения с учётом индивидуальных пожеланий пациента.

Пациентка выписывается в удовлетворительном состоянии.

Рекомендовано: фиксированная госпитализация на 04.09.2017 г. для хирургического лечения.

Катамнез на 01.12.2017 г. Больной в сентябре 2017 г. была проведена двухсторонняя мастэктомия с иссечением региональных узлов. Жалоб активно не предъявляет. Поехала в ноябре в Альпы для катания на лыжах. Звонит лечащему врачу раз в неделю, чувствует себя хорошо, жалоб не предъявляет. В течении всего времени прошла еще 16 курсов иммунотерапии. В августе 2020 г. рецидива заболевания нет. Наблюдается у онколога по месту жительства.

Пример 5

Пациентка М-ва А.В. 06.01.1967 г. рождения. Находилась в клинике с основным клиническим диагнозом: мультифокальная глиобластома левой теменно-височной доли правого полушария головного мозга. Состояние после резекции глиобластомы (13.02.2014 г.). Патологоанатомический диагноз: в препаратах фрагменты злокачественной мультиформной глиoбластомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митoзами. Заключение: мультиформная глиoбластoма WHO grade IV. Сопутствующие заболевания: язвенная болезнь , рубцово-язвенная деформация луковицы 12-типерстной кишки. Хронический гастродуоденит.

Жалобы при поступлении: общая слабость, легкая дискоординация движений, пошатывание при ходьбе, отмечался единичный эпилептиформный припадок.

Анамнез заболевания. Со слов пациентки: считает себя больной с февраля 2014 г., когда потеряла сознание на работе, упала, ударилась головой, отмечались судорожные подергивания в конечностях. Больная была доставлена в ГКБ № 40 (г. Москва), где при госпитализации на МРТ головного мозга выявили опухоль головного мозга в правой теменно-височной области. По месту жительства проведено повторное МРТ головного мозга, которая подтвердила кистозно-солидное образование полушария головного мозга в правой теменной и височной областей, отек головного мозга, выраженное смешение срединных структур и ствола мозга. Была консультирована нейрохирургом. Заключение: показано оперативное лечение. С 10.02.2014 г. по 19.02.2014 г. находилась в нейрохирургическом отделении ГКБ № 15 (г. Москва), где 13.02.2014 г. проведено удаление опухоли. После операции пациентка консультирована в клинике им. Герцена для подбора лучевой и химиотерапии. Прошла курс лучевой терапии в марте-апреле 2014 г. Получила облучение в дозе 65 Грей. 20.06.2014 г. первичная консультация химиотерапевта-нейроонколога. Заключение: Ds мультифокальная глиобластома правой височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Состояние после: хирургическое удаления глиобластомы височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Предварительные результаты патогистологического исследования: мультиформная глиобластома полиморфноклеточной теменной доли левого полушария головного мозга. Патологоанатомический диагноз: в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиoмы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митoзами. Заключение: глиoбластoма WHO grade IV. Прошла почти 12 курсов химиотерапии темозаламидом по стандартной схеме. В октябре 2015 года был выявлен рецидив мультиформной глиобластомы, в правой височной области очаг размерами5×1,2 см. Больной успешно проведен курс стереотаксической лучевой терапии на аппарате "Кибернож" в Санкт-Петербурге, в дальнейшем продолжены курсы темозаламида, авастина, иринотекана с улучшением. После завершения стандартного лечения обратилась в клинику "НейроВита" и с 02.12.2015 г. была включена в протокол клинических испытаний "Протеом-основанной терапии глиобластомы человека". Больной начат курс иммунотерапии дендритными вакцинами и цитотоксическими лимфоцитами (декабрь 2015 г. - апрель 2016 г.) В этот период проведено 4 курсовых химиотерапевтических лечения: темозаламид по схеме 280 мг 5дней + карбоплатин 600мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков. С марта 2016 г. к лечению добавлен в целях профилактики рецидива аллогенный БМКП по настоящему изобретению, полученный от донора – родной дочери. Применялось интратекальное введение препарата (5 цитотрансфзий) и внутривенное введение препарата (2 цитотрансфузии) с периодическими курсами химиотерапии: два курса по 5 дней (2-ой курс с 22.07.2016 г. по 30.07.2016 г.): 1-й день раствор карбоплатин 600мг внутривенно на фоне антиэметиков. Таблетки темозоламид 260 мг /сутки – утром за 60 минут до еды. 2-4-й день таблетки темозоламид 280 мг /сутки – утром за 60 минут до еды. 5-й день таблетки темозоламид 300 мг /сутки – утром за 60 минут до еды, на фоне антиэметиков. Курс перенесла удовлетворительно. Согласно МРТ головного мозга с контрастным усилением (22 августа 2016 г.) без отрицательной динамики. Даны рекомендации продолжить курсовое лечение: темозаламид по схеме 280 мг – 5дней + карбоплатин 600мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков. Однако химиотерапевтическое лечение темазоломидом эффекта не дало. Получила 4 дозы БМКП для внутривенного введения и 10 интератекальных трансфузий БМКП. К лечению добавлены персонифицированные противоопухолевые вакцины и препарат цитотоксических лимфоцитов по 350 млн. клеток раз в 2 недели № 8. Согласно МРТ головного мозга с контрастным усилением (23.05.2017 г.) без отрицательной динамики.

Соматический статус: Состояние удовлетворительное, ECOG-1. Температура тела 36,2°С. Кожные покровы чистые, бледные, тургор мягких тканей сохранен. Молочные железы симметричные. Периферические лимфатические узлы не пальпируются. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС= 66 уд. в мин. АД= 125/70 мм рт.ст. В легких дыхание самостоятельное, везикулярное, хрипов нет, ЧДД= 18 в мин., проводится над всей поверхностью обоих лёгких. SpO₂ – 98% на воздухе. Живот мягкий, не увеличен, при пальпации безболезненный, перистальтический шум выслушивается, печень по краю рёберной дуги. Мочеиспускание контролирует.

Неврологический статус: сознание ясное, в пространстве времени и личности ориентирована. Передвигается самостоятельно. На вопросы отвечает правильно. Лицо симметрично. Глазные щели S=D. Фотореакции сохранены. Фонация и глотание не нарушено. Язык по центру. Слух сохранен. Вызываются рефлексы орального автоматизма. Чувствительность сохранена. Мышечный тонус незначительно ослаблен в верхних и нижних правых конечностях, сухожильные рефлексы с конечностей сохранены оживлены S>D. При выполнении пальце-носовой пробы определяется интенционный тремор с двух сторон. При выполнении пяточно-коленной пробы акционный тремор. Пошатывание при проведении пробы Ромберга.

Результаты лабораторных, инструментальных методов обследования в пределах нормы. Группа крови: B(III) Rh+ полож. Анализы крови на ВИЧ, РВ, гепатиты В – отрицательные. ЭКГ Синусовая аритмия, горизонтальное положение ЭОС. ЧСС – 68 в мин. Частичное нарушение внутрижелудочковой проводимости.

Иммунотерапия проводилась под контролем уровня Т3, Т4, ТТГ на фоне медикаментозного расширения препаратами, блокирующими гормональную функцию щитовидной железы - метимазол (мерказолил) 0,005 г по 1 табл. в день, Тиромель (лиотиронин натрия, Т3-тиронин) 25мкг по 1 табл. в день) месячными курсами. Проведено интратекальное введение БМКП. Пациентка в стабильном состоянии выписывается под наблюдение онколога для продолжения химиотерапевтического лечения по месту жительства. Повторная госпитализация в клинику через неделю для контрольного обследования и проведении иммунотерапии в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы: "Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия глиобластом головного мозга" при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России".

Катамнез на 01.12.2020 г. Больная жива, состояние удовлетворительное. Была повторно оперирована в 2019 г. Прошла повторный курс химиотерапии темодалом. Прошла еще 6 курсов введения БМКП и 16 введений препарата ЦТЛ и 8 ДВ. Качество жизни удовлетворительное. Медиана выживаемости с данным заболеванием составляет 70 месяцев.

Клиническое применения аутологичного БМКП

для лечения аутоиммунного заболевания

Пример 6

Пациентка Б-на Е. Ю. 13.02.1962 г. рождения, находилась в клинике "НейроВита" с 26.08.2019 г. по 13.09.2019 г.

Основной Диагноз: Рассеянный склероз, цереброспинальная форма, ремиссия. Состояние после высокодозной иммуносупрессивной терапии циклофосфамидом, интратекальной цитотрансфузии моноклональной фракции клеток ПК (МФкПК). Вальгусная деформация правой стопы. Сопутствующие заболевания: хронический цистит ремиссия, миома матки малых размеров.

Жалобы при поступлении на боли в поясничном отделе позвоночника тянущего ноющего характера в положении стоя, облегчение приносит "растяжение". Слабость в руках, аксиальных мышцах грудного, поясничного отделов позвоночника. Повышение тонуса мышц нижних конечностей, отсутствие полного произвольного контроля движений в нижних конечностях.

Анамнез заболевания: дебют заболевания с 1982 году с ретробульбарного неврита справа с неполным восстановлением зрения (осталась центральная скотома). Обострение заболевания в 1991 г. Во время одной из предыдущих госпитализации больной были проведены курсы высокодозной иммуносупрессивной терапии циклофосфамидом, чередующиеся со стимуляцией гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, после которой были проведены сепарация и сбор аутологичных ГСК. В январе 2005 г. была проведена операция трансплантации КМ. В дальнейшем из собранного материала был получен БМКП по настоящему изобретению, который применялся больной в виде интратекальных введений.

30.08.2016 г. пациентке проведена повторная стимуляции гемопоэза и сеперация МНК ПК с ГСК, из которых был приготовлен новый БМКП, так как предыдущий закончился. Проведены курсовые трансфузии БМКП.

Пациентка поступила в клинику "НейроВита" для дообследования и лечения с использованием моноклональных фракции клеток периферической крови. На фоне проводимого комплексного лечения с 2003 года клинических проявлений обострений рассеянного склероза не отмечалось. За последние годы пациентка отмечает улучшения в двигательной сфере, снижения спастичности в нижних конечностях, после регулярных реабилитационных мероприятиях в условиях стационара ощущает укрепление аксиальной мускулатуры, снижение тугоподвижности в суставах конечностей.

МРТ головного мозга (14.09.2017 г.) с контрастным усилением. Заключение: множественные очаги поражения белого вещества полушарий головного мозга, Варолиева моста и стволовых структур, как проявление системного нейродегенеративного заболевания (рассеянный склероз) в стадии ремиссии. МР-признаки неспецифического воспаления оболочек головного мозга. Очаговых изменений специфического неопластического происхождения в верхних шейных сегментах спинного мозга достоверно не выявлено.

Объективный статус: Общее состояние средней степени тяжести, стабильное. Астенического телосложения. Кожные покровы и видимые слизистые чистые, обычной окраски, тургор сохранен. Гемодинамические показатели: пульс 69 ударов в минуту, ритмичный; АД 108/66 мм рт. ст. Тоны сердца ритмичные. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧДД 16 в 1 мин. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. Печень и селезёнка не увеличены. Симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Нарушены функции тазовых органов.

Неврологический статус: Сознание ясное. В месте и времени ориентирована правильно. Глазные щели D=S, движения глазных яблок в полном объеме. Зрачки D=S, фотореакция удовлетворительная. Носогубные складки симметричные. Чувствительных нарушений на лице нет. Места выхода ветвей тройничного нерва интактны. Язык по средней линии. Глотание не нарушено, глоточный рефлекс сохранен. Мышечная сила – спастический нижний парапарез 1,5-3,5 баллов в нижних конечностях, верхний преимущественно дистальный парапарез до 3,5-4,5 баллов. Легкие гипотрофий мышц верхних конечностей. Фасцикуляций нет. Рефлексы с верхних конечностей оживлены, симметричные, с расширением рефлексогенных зон. Выраженное изменение тонуса мышц по центральному типу в мышцах нижних конечностей по пирамидному типу. Вызываются патологические кистевые, стопные рефлексы. Императивные позывы на мочеиспускание. Чувствительность сохранена. Координаторные пробы в руках выполняет с интенцией, в ногах проверить затруднительно по причине выраженной спастичности.

Проведенное лечение: Пациентке в клинике, с предварительного информированного согласия, проведено 3 интратекальные цитототрансфузии БМКП. Процедуры перенесла удовлетворительно. За время пребывания в клинике проведено комплексное лечение: симптоматическая терапия, ЛФК–вертикализация, мотомед, тредмил, активная гимнастика, мелкая моторика кистей, пальцев рук, общий массаж – все манипуляции перенесла удовлетворительно.

Рекомендовано:

1) Систематически и регулярно выполнять физические упражнения в домашних условиях на специальных тренажерах: Мотомед Вива 2 с тренажером для рук и верхней части тела в пассивном и активном режиме; активные регулярные занятия с использованием Кроссовера, Параподиума, Вертикализатора с коленным упором и в сочетании с лифтом-вертикализатором под руководством инструктора ЛФК. Дыхательная гимнастика.

2) Необходимо продолжать лечебную физкультуру, основной акцент при выполнении реабилитационной программы нужно придать: мышцам конечностей, аксиальной мускулатуры, мелкой моторики кистей. Занятия проводить частыми, непродолжительными подходами без переутомлений, что оптимально для работы мышц. Упражнения на отягощение выполнять на выдохе. После занятия проводить массаж спины, нижних и верхних конечностей (расслабляющий). При вертикализации, высаживании, реабилитации использовать компрессионный трикотаж (бинтование эластичным бинтом).

3) Продолжить прием: Таблетки АСКОРУТИН 1 таблетка после еды 3 раз в день. – 3 месяца; таблетки ТИОКТАЦИД 600мг 1таблетка утром за 30 минут до еды на протяжении – 2 месяца; таблетки Веноплант 1 таблетка 2 раза в день до еды – 6 недель.

4) Повторная госпитализация в клинику "НейроВита" через 3-4 месяца для интратекальных транфузий БМКП, при условии отсутствия очагов хронической инфекции.

Катамнез: в течение 15,5 лет после проведения трансплантации костного мозга с применением БМКП по настоящему изобретению у больной не отмечено ни одного эпизода рецидива заболевания. Уменьшились клинические проявления неврологического морфологического дефекта. Больная очень довольна своим состоянием.

Клиническое применение БМКП для лечения нейродегенеративного заболевания

Пример 7

Пациентка Род-ва Н.И. 24.02.1956 г.р. поступила в клинику «НейроВита» повторно 12.12.2019 г. с жалобами на постепенно прогрессирующее замедление речи, трудность при выговаривании слов, невозможность самостоятельной ходьбы из-за выраженной неустойчивости. Трудности при письме, нарушение плавности движений, изменение голоса. Периодически поперхивается. Ночное апноэ.

Анамнез жизни. Больная много лет считала себя здоровой и активной женщиной, работала главным бухгалтером крупного промышленного предприятия, замужем, имеет взрослую дочь и взрослого сына, а также двух внуков. В анамнезе дважды были сотрясения головного мозга (2000 и 2005 г.г.), за медицинской помощью не обращалась. Отмечает аллергию на пыльцу цветущих растений, наблюдается у иммунолога-аллерголога по месту жительства. Hacледственность не отягощена.

История заболевания. Со слов больной более трех лет назад появилась неуверенность при ходьбе, скованность в мышцах конечностей, изменение почерка. Чуть позже, после сильной психотравмирующей ситуации прогрессирование стало нарастать с большей силой. Была вынуждена оставить работу. Пациентка проходила курсовое лечение по месту жительства в Казахстане, где диагностировали и лечили нейродегенеративное заболевание в виде болезни Паркинсона. Однако патогенетическое лечение с применением циклодола и антипаркинсонических препаратов из группы Л-ДОПА (наком, мадопар) были недостаточно эффективны, в связи с чем больной предоставлена 2 группа инвалидности. Для дальнейшего обследования и лечения больная была направлена родственниками в Германию, где проводился диффренециальный диагноз между болезнью Паркинсона, акинетико-ригидной формой и мультисистемной атрофией коры головного мозга. Консилиум врачей Дрезденского университетского госпиталя пришел к заключению, что у больной имеет место нейродегенеративное заболевание в виде мультисистемной корковой атрофиии головного мозга с явлениями деменции, координаторными нарушениями и синдромом паркинсонизма. Проводимое стандартное лечение антипаркинсоническими препаратами, сосудистыми препаратами, церебропротекторами, ноотропами, витаминотеррапия, фолиевая кислота, симптоматическая терапия эффекта практически не принесло. Прием антипаркинсонических препаратов по вине больной после выписки стал не всегда регулярный (принимала в зависимости от самочувствия), а затем вообще отказалась от приема антипаркинсонических препаратов. Заболевание быстро прогрессировало, врачи-неврологи в Казахстане практически не могли предложить другой терапии, кроме той которую проводили в Германии, и родственники больной продолжили искать клинику, в которой бы врачи смогли помочь пациентке. Больная была госпитализирована в клинику «НейроВита» медицинской транспортной авиацией в лежачем положении, в состоянии полной скованности и ступора, амимична, на вопросы не отвечала, была отмечена выраженная децеребрационная ригидность затылочных мышц, что приводило к вынужденному запрокинутому положению головы.

Статус на момент поступления в клинику "НейроВита": Состояние средней степени тяжести. Кожные покровы обычной окраски. Кости не деформированы, безболезненны при ощупывании и поколачивании. Мышцы развиты удовлетворительно, повышен тонус мышц задней поверхности шеи и затылочной области головы. Система органов дыхания: ЧДД 16-17 в мин. Аускультативно везикулярное. Перкутopно ясный легочный звук. Сердечно-сосудистая ситсема: ЧСС 79 в мин. Пульс удовлетворительного наполнения, ритмичный. АД справа: 130/80 мм рт. ст. АД слева: 135/80 мм рт. cт. Пульсация сонных артерий обычная. Тоны сердца ритмичны. Система органов пищеварения: Язык чистый. Живот участвует в дыхании, в объеме не увеличен. Пальпация безболезненна. Стул регулярный. Мочеполовая система: Область поясницы не изменена, но имеет место дефанс (напряжение)широких мышц спины. Мочевой пузырь не пальпируется.

Нервная система: Больная продуктивному контакту доступна с трудом, понимает обращенную речь, следит глазами за врачом и реагирует глазами, на вопросы и по существу отвечает морганием глаз, при физикальном осмотре в целом взгляд фиксирован в одну точку, голова запрокинута назад из-за выраженного децеребрационного синдрома, проявляющегося ригидностью и напряжением затылочных мышц и мышц задней поверхности шеи. При повторной просьбе не сопротивляется осмотру, выполняет простые инструкции после затяжного латентного периода. Менингеальных знаков нет. Со стороны черепно-мозговых нервов: поля зрения ориентировочно не сужены. Глазные щели равны. Зрачки D=S. Фотореакция живая, конвергенция сохранена. Движения глазных яблок ограничены при взгляде вверх, вниз. Нистагм мелкоамплитудный, возникающий в крайних отведениях. Гипомимия. Лицо асимметрично, глоточные рефлексы средней живости. Язык по средней линии. Парезов нет. Вызываются рефлексы орального автоматизма (дистанс-оральный рефлекс + хоботковый рефлекс). Мышечный тонус конечностей незначительно изменен по «пластическому» типу, S=D. Симптом «зубчатого колеса» с обеих рук. Сухожильные рефлексы живые, S=D. Вызываются кистевые патологические рефлексы с двух сторон. Чувствительность не нарушена. Координаторные пробы: пальценосовую пробу не выполняет, пяточно-коленную пробу пытается выполнить, но достаточно безуспешно. В позе Ромберга не устойчива. Постуральная неустойчивость. На МРТ головного мозга с контрастированием была выявлена картина дегенеративно-дистрофических нарушений коркового вещества, базальных ганглиев и мозжечка. При церебральном картировании ЭЭГ выявлены грубые очаговые изменения биоэлектрической активности головного мозга с явлениями дизритмии в лобно-височной области больше справа. У пациентки был подтверждено нейродегенеративное заболевание в форме мультисистемной атрофия головного мозга.

Окончательный диагноз: Нейродегенеративное заболевание – мультисистемная атрофия головного мозга и подкорковых структур с экстрапирамидным (акинетико-регидным) синдромом, прогрессирующим надъядерным параличом взора, с псевдобульбарным синдромом и постуральной неустойчивостью и синдромом ночного апноэ. Дисциркуляторная смешанная (гипертоническая и атеросклеротическая) энцефалопатия II-III ст. преимущественно в вертебро-базилярном бассейне, лейкоареоз головного мозга на фоне артериальной гипертензии. Распространенный атеросклероз магистральных артерий. С-образная извитость внутренней сонной артерии с двух сторон.

Сопутствующие заболевания: Гипертоническая болезнь 2-3 ст., высокой степени риска. Желчекаменная болезнь, ремиссия. Киста правой почки. Миома матки. Кисты эндоцервикса. Вагинальный кандидоз.

С информированого согласия больной и ее родственников она включена в протокол экспериментального клинического лечения с применением БМКП по настоящему изобретению. Донором для биоматериала стал близкий родственник пациентки (сын 35 лет). Экспериментальный БМКП вводился интратекально в стандарных дозах каждые 7 дней в течение месяца на фоне массивной сосудистой внутривенной терапии актовегином, кавинтоном, тренталом. Поскольку больная уже более трех лет принимала антипаркинсонические лекарственные средства, то было решено вернуться к антипаркинсонической медикаментозной терапии (Мадопар, ПК-Мерц). Начато массированное применении ноотропов (пирацетам) и церебропротекторов (церебролизин и кортексин), физиотерапии (магнитотерапия, структурно-резонансная терапия, ЛФК, массаж).

В результате проведенного лечения состояние больной значительно улучшилось, восстановился продуктивный контакт с больной, стала отвечать на вопросы, речь и голос дисфоничны, но абсолютно понятны, ушла ригидность затылочных мышц и вынужденное положение головы, практически ушла скованность и пластичность. Практически нивелировался синдром «зубчатого колеса» в руках. Удалось восстановить ходьбу с ходунками и инструктором, стала самостоятельно себя обслуживать (кушает самостоятельно, ходит в туалет, стала пользоваться туалетной бумагой, но забывает смывать за собой унитаз). Стала посещать реабилитационный зал. Отмечено, что мышление структурно не изменено. Память на текущие события не изменена, но частично амнезирует перед перелетом в Москву. Не помнит, как попала в больницу. В удовлетворительном состоянии была выписана из стационара.

Катамнез. В последующем приезжала на повторные введения БМКП в феврале 2020 г. Проводилась стандартная сосудистая, церебропротекторная и ноотропная терапия, а также по 2 интратекальных введения БМКП каждую неделю. Больная достаточно активна, контакт продуктивный по существу, режим приема препаратов не нарушает. Явления скованности и ригидности практически не мешают самообслуживанию. Однако объективно явления интеллектуально-мнестического дефекта достаточно выраженные, имеет место аффективная неустойчивость, что связано с нарастанием явления психорганического синдрома. В дальнейшем контакт с больной потерян из-за ограничений въезда в страну из-за COVID-19 в 2020-2021 г.г., и больная на дальнейшее лечение попасть не смогла. Лечится в Казахстане, существенного ухудшения состояния пока нет, но явления ригидности и скованности снова стали нарастать.

____________________________________________________

Использованные сокращения

FLT3L – лиганд fms-подобной тирозинкиназы 3

TPO – тромбопоэтин

SCF – фактор роста стволовых клеток

АИЗ – аутоимунные заболевания

БА – болезнь Альцгеймера

БАС – боковой амиотрофический склероз

БЦ – болезни цивилизации

ГПК – гемопоэтические прогениторные клетки

ГР – гомологическая рекомбинация

ГСК – гемопоэтические стволовые клетки

дцДНК – двухцепочечная ДНК

ЗНО – злокачественные новообразования

КМ – костный мозг

ЛК – лейкоконцентрат

МНК – мононуклеары

НДБ – нейродегенеративные болезни

НИС- недостаточность иммунной системы

ПК – периферическвя кровь

СК – стволовые клетки

СКВ – системная красная волчанка

ССБ – сердечно-сосудистые болезни

ТКМ – трансплантация костного мозга

ЦТЛ – цитотоксические лимфоциты

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биомедицинскому клеточному продукту (БМКП), а также к способу его получения. При этом способ предусматривает выделение лейкоконцентрата аутологичных или аллогенных мобилизованных мононуклеаров путем лейкоцитофереза периферической крови или эксфузии нативного костного мозга, очистку выделенного лейкоконцентрата от эритроцитов и гранулоцитов, культивирование содержащихся в очищенном лейкоконцентрате гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК), а также инкубацию клеточной массы ГСК и ГПК с лекарственным препаратом двухцепочечной ДНК человека для активации гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств этих клеток. Изобретение эффективно для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 пр.

1. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга, состоящий из линии аутологичных или аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК), выделенных из нативного костного мозга путем эксфузии или из периферической крови путем лейкоцитофереза, размноженных путем культивирования в лейкоконцентрате мононуклеаров в среде, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, для увеличения общего количества ГСК и ГПК не менее 1,5% от общего количества мононуклеаров в БМКП и приобретения первичных гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств ГСК и ГПК, и инкубированных с лекарственным препаратом двухцепочечной ДНК человека для активации гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств этих клеток, причем среда, препятствующая гемопоэтической дифференцировке, содержит смесь цитокинов, состоящую из фактора роста стволовых клеток, лиганда fms-подобной тирозинкиназы 3, интерлейкина 6, тромбопоэтина, инсулина и трансферрина, с добавлением антибиотика иономицина (Са²⁺ ionophore), а в качестве препарата двухцепочечной ДНК человека использована стерильная форма лекарственной субстанции Панаген®.

2. Способ получения биомедицинского клеточного продукта (БМКП) по п. 1, включающий выделение лейкоконцентрата аутологичных или аллогенных мобилизованных мононуклеаров путем лейкоцитофереза периферической крови или эксфузии нативного костного мозга, очистку выделенного лейкоконцентрата от эритроцитов и гранулоцитов, культивирование содержащихся в очищенном лейкоконцентрате гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК) в среде, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, для увеличения их количества не менее 1,5% от общего количества мононуклеаров в БМКП и приобретения ими первичных гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств, а также инкубацию клеточной массы ГСК и ГПК с лекарственным препаратом двухцепочечной ДНК человека для активации гемопоэтических, регуляторных и регенеративных свойств этих клеток, причем в качестве среды, препятствующей гемопоэтической дифференцировке, используют среду, содержащую смесь цитокинов, состоящую из фактора роста стволовых клеток, лиганда fms-подобной тирозинкиназы 3, интерлейкина 6, тромбопоэтина, инсулина и трансферина, с добавлением антибиотика иономицина (Са²⁺ ionophore), а в качестве препарата двухцепочечной ДНК человека используют стерильную форму лекарственной субстанции Панаген®.

3. Способ получения БМКП по п. 2, отличающийся тем, что для его интратекального или интравентрикулярного введения пациенту клеточную массу после инкубации отмывают от двухцепочечной ДНК.

4. Способ получения БМКП по п. 3, отличающийся тем, что клеточную массу отмывают путем двухкратного центрифугирования с 0,9% физиологическим раствором NaCl.

5. Способ получения БМКП по п. 2, отличающийся тем, что инкубацию проводят в течение не более 1 часа при концентрации субстанции Панаген® не более 30 нмг на 1 мл клеточной массы.

6. Способ получения БМКП по п. 2, отличающийся тем, что инкубацию проводят после культивирования или в процессе культивирования.