МАКРОПОРИСТЫЕ МАТРИЦЫ ДЛЯ КЛЕТОЧНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/722 A61P17/02 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений и может найти применение в клеточной и тканевой инженерии для 3D-культивирования клеток, в том числе в биомедицине для тестирования эффективности новых фармацевтических препаратов, в том числе, противоопухолевых.

Динамика роста и морфология опухолей в значительной степени определяются эффективностью передачи сигналов между клетками, градиентами нутриентов и метаболитов, а также механическими характеристиками матрикса, окружающего опухоль in vivo, которые, как правило, сложно воспроизвести in vitro при биохимических и фармакологических испытаниях. Отсутствие взаимодействий между клетками, а также между клетками и внеклеточным матриксом в традиционных двумерных (2D) моделях в монослое приводит к значительному расхождению между доклиническими и клиническими испытаниями лекарственных препаратов. Трехмерное (3D) культивирование клеток является перспективным инструментом для имитации функций внеклеточного матрикса и разработки более адекватной модели опухолей для изучения гипоксии, агрегации, кластеризации, миграции, пролиферации клеток, а также их отклика на различные внешние стимулы, в том числе химические.

3D-культивирование клеток обычно достигается путем иммобилизации клеток в гидрогели, состав, морфологию и жесткость которых можно варьировать в зависимости от выбора полимера и способа изготовления. Известно, что жесткость субстрата значительно влияет на пролиферацию, миграцию, выживаемость опухолевых клеток, что особенно важно для адгезивных клеточных линий. Например, при высокоинвазивном колоректальном раке, или раке молочной железы, клетки характеризуются быстрой миграцией при увеличении жесткости субстрата при культивировании в 2D-культуре, однако, обеспечить такие условия в 3D значительно сложнее, так как низкая проницаемость жестких гидрогелей существенно ограничивает рост мультиклеточных агрегатов. В связи с этим, изготовление макропористых матриц с размерами пор в несколько десятков микрометров и выше является перспективным способом обеспечения жесткости каркаса при сохранении высокой эффективности транспорта питательных веществ и клеточных метаболитов, а также достаточного внутреннего пространства для трехмерного роста конкретных линий опухолевых клеток.

Несмотря на то, что разнообразие синтетических полимеров позволяет получить материалы с широким диапазоном механических свойств, их применение в качестве матриксов для культивирования часто ограничено низкой адгезивностью к субстрату и наличием нежелательных клеточных реакций. Поэтому представляет интерес создание 3D матриц на основе природных полимеров, которые лучше соответствуют механике, химии и сигнальной среде природного внеклеточного матрикса.

Известен гидрогель на основе коллагена I типа, обладающий высокой биосовместимостью и адгезией к клеткам [Bessea, L., et al. «Production of ordered collagen matrices for three-dimensional cell culture» // Biomaterials, 2002, V.23, pp.27-36]. Его получали из кислоторастворимого коллагена кожи теленка I типа (5 мг/мл) обработкой на ультразвуковом аппарате импульсами по 10 мин с паузами по 10 мин. Обработанные ультразвуком растворы коллагена выливали в чашку Петри для кристаллизации и постепенно концентрировали до 20 и 40 мг/мл путем медленного выпаривания растворителя на столе с ламинарным потоком в стерильных условиях. Около 4 мл вязких концентрированных растворов (20 или 40 мг/мл) заливали в чашки Петри диаметром 35 мм и гелировали, помещая образцы в пары концентрированного аммиака на 1 ч при комнатной температуре. Особое внимание уделяли равномерному распределению вязкого раствора по всей поверхности чашек Петри для получения постоянной толщины геля около 4 мм и отсутствию пузырьков в препарате. Затем гели отмывали в культуральной среде в течение 4 дней до рН 7,4, и засевали на их поверхность суспензию фибробластов в количестве 2⋅10⁵ клеток/гель.

Известный гидрогель показал высокую адгезию, хорошую биосовместимость и проницаемость для клеток в течение 21 дня эксперимента. Однако, присутствие в матрице чужеродного белка животного происхождения может оказать токсическое влияние на клетки, и, как следствие, поведение и рост культуры. Помимо этого, губчатые матрицы на основе белка недостаточно жесткие и обеспечивают лишь ограниченный диапазон модулей упругости (в среднем 0,1-4 кПа), в то время как жесткость тканей с плотной опухолью рака прямой кишки человека может достигать 60 кПа.

В связи с этим, гидрогели на основе полисахаридов являются более привлекательной альтернативой для выращивания сфероидов раковых клеток благодаря низкой токсичности, биосовместимости и широкому диапазону жесткости, который может быть достигнут различными химическими и физическими способами сшивки.

Так, в работе [Crompton K.E., et al. «Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering» // Biomaterials, 2007, V.28, pp. 441-449] клетки коры мозга мыши культивировали в 3D-термочувствительных гидрогелях хитозана с бета-глицерофосфатом. Гидрогели готовили путем растворения 0,8 или 0,5 масс.% хитозана в HCl до молярного соотношения 0,9:1 с аминогруппой хитозана. Раствор помещали на ледяную баню и по каплям добавляли 3,7 М глицерофосфата в молярном соотношении 12:1 к хитозану при ионной силе, близкой внеклеточной жидкости. Полученный раствор стерилизовали ультрафильтрацией и для формирования 3D-культуры вносили по 150 мл на дно 48-луночного планшета. До добавления суспензии клеток гидрогель хранили в прохладе.

Полученные гидрогели показали хорошие результаты 3D культивирования по количеству прикрепленных клеток, морфологии и скорости роста нейронов. Также нейроны демонстрировали более крупные клеточные тела и выпускали одиночные нейриты внутри макропористого геля. Использование гидрогеля улучшило выживаемость клеток при концентрации полимера до 0,1%, однако дальнейшее увеличение приводило к уменьшению количества клеток и подавлению росту нейритов.

К недостатку указанного гидрогеля можно отнести, что, как указано авторами работы, осмолярность гидрогеля при разных концентрациях глицерофосфата в составе была критическим фактором, имеющим значение для выживания клеток.

Описано использование гидрогеля из карбоксиметилгексаноилхитозана и Pluronic F127 с глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента для инкапсуляции фибробластов [Yap L.-S., Yang M.-C. «Evaluation of hydrogel composing of Pluronic F127 and carboxymethyl hexanoyl chitosan as injectable scaffold for tissue engineering applications» // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2016, V.146, pp.204-211]. Раствор гидрогеля готовили холодным методом (4°С). В начале карбоксиметилгексаноилхитозан (0,5-1,5 масс.%) растворяли в дистиллированной воде и добавляли синтетический полимер Pluronic F127 (20 масс.%). Раствор перемешивали при 4°C в течение 30 мин до достижения гомогенности, а затем оставляли на ночь в холодильнике для полного растворения F127. После этого добавляли глутаровый альдегид (0,1 об.%) и перемешивали в течение 10 мин магнитной мешалкой при 4°С. Конечный продукт хранили при 4°C. Клетки фибробластов инкапсулировали путем простого смешивания. Гелеобразование проводили, поднимая температуру до 30°C, золь-гель переход происходил в течение 90 сек. Полученная матрица оставалась в гелеобразном состоянии более 1 месяца. Исследование культуры клеток in vitro показало, что гидрогели не были цитотоксичными. При этом жизнеспособность инкапсулированных фибробластов составила 106% после инкубации в течение 5 дней.

Существенным недостатком описанной матрицы для культивирования является использование для гелеобразования дорогостоящего полимера Pluronic F127 в высокой концентрации, что значительно увеличивает себестоимость матрицы.

Среди различных типов макропористых материалов для клеточного культивирования перспективными являются макропористые криогели. Они формируются в результате полимеризации мономеров или сшивки полимеров при отрицательной температуре с последующим удалением кристаллов льда путем оттаивания.

Наиболее близким по химической сущности к заявляемому изобретению, но отличающийся по назначению, является макропористый материал на основе хитозана, полученный методом криогелирования, когда кристаллы льда в замороженном растворе полимера выступают в роли порообразователей, а ионная или ковалентная сшивка происходит при отрицательной температуре [пат. РФ №2699562, опубл. 06.09.2019]. Способ получения ковалентно-сшитых криогелей хитозана осуществляли следующим образом. Раствор хитозана с концентрацией 3% готовили растворением порошка полимера в соляной кислоте с концентрацией 0,45-0,5%. Затем рН раствора доводили до 3,5-5,5, предпочтительно до 4,5-5,0, используя растворы соляной кислоты или щелочи. В качестве сшивающих агентов выбрали диглицидиловые эфиры гликолей, которые в макропористых материалах используются для контроля жесткости, в том числе обуславливая скорость ферментативной деградации в организме. Расчетные количества диглицидилового эфира этиленгликоля или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля (соответствующие молярным отношениям к аминогруппам хитозана не менее 1:4) добавляли при тщательном перемешивании в раствор хитозана. Для получения пористого материала емкость произвольного размера и формы наполняли раствором хитозана со сшивающим агентом и помещали в морозильную камеру при температуре -10°С на 5-12 дней для ковалентной сшивки, с последующим оттаиванием.

Недостатками известного макропористого криогеля являются необходимость жесткого контроля рН в процессе синтеза, высокие мольные отношения сшивающий агент : полимер, высокая жесткость и низкая проницаемость криогелей, полученных с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, что может оказывать влияние на динамику роста опухолевых клеток, так как в описании изобретения отсутствует информация о возможности применения заявленных криогелей для 3D культивирования клеток.

В связи с этим была поставлена задача синтезировать супермакропористый криогель с использованием производного хитозана, перспективного для 3D культивирования клеток.

Технический результат предлагаемого изобретения - биосовместимые, нетоксичные макропористые матрицы на основе криогелей водорастворимого карбоксиметилхитозана. Изобретение позволяет получить макропористые матрицы для 3D культивирования клеточных сфероидов, в том числе опухолевых. Заявляемые матрицы имеют хорошую проницаемость для клеток и питательных веществ за счет оптимальной жесткости.

Указанный технический результат достигают макропористым криогелем, полученным сшивкой карбоксиметилхитозана посредством диглицидиловых эфиров гликолей (1,4-бутандиола, этиленгликоля и полиэтиленгликоля) при температуре -10°С в течение 7-12 дней из раствора с рН 10-11 и концентрацией полимера 1-3 масс.%, пригодным для 3D-культивирования клеток.

Синтез макропористого геля на основе карбоксиметилхитозана заключается в следующем: 1-3%-ный раствор натриевой соли N,O-карбоксиметилхитозана (КМХ) готовили в дистиллированной воде, рН раствора составлял 10-11 ед. Рассчитанные количества сшивающих реагентов - диглицидиловых эфиров гликолей (ДГЭ), соответствующих молярным соотношениям КМХ:ДГЭ=2:1 - 1:20, добавляли по каплям при постоянном перемешивании к раствору полимера, затем растворы немедленно помещали в пластиковые шприцы и выдерживали в морозильной камере при температуре -10°C в течение 7-12 дней. После оттаивания криогели промывали дистиллированной водой для удаления непрореагировавших химических веществ.

Жизнеспособность и функциональную активность клеток в криогелях анализировали методом проточной цитометрии. Для открепления клеток в лунку добавляли смесь 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА на 30 минут. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл DPBS, содержащего 10 мкМ 2',7'-дихлородигидрофлуорисцеина диацетата (H₂DCFDA) для оценки митохондриальной активности, 1 мкМ TO-PRO-3™ (Invitrogen, США) для детекции апоптозных клеток и 1 мкг/мл DAPI (GERBU Biotechnik GmbH, Германия) для окрашивания мертвых клеток. Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте, после чего разбавляли 150 мкл DPBS и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX, подключенного к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (версия 2.3, Beckman-Coulter). Единичные события (более 95% всех событий) выбирали треугольным гейтированием на двумерном графике FSC-A против FSC-H для исключения агрегатов из дальнейшего анализа. DAPI детектировали при экстинкции 405 нм и эмиссии 450/45 BP. H₂DCFDA детектировали при экстинкции 488 нм и эмиссии 525/40 BP. TO-PRO-3™ детектировали при экстинкции 638 нм и эмиссии 660/10 BP. В пробе анализировали не менее 20000 событий при скорости взятия образца 60 мкл/мин, 100-300 событий/секунду.

Изобретение реализовано в следующих примерах.

Пример 1.

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (ДГЭБД) в мольном отношении КМХ: ДГЭБД=1: 4, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель, имеющий значение модуля Юнга равное 3 кПа. Средний размер пор составил 167±45 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 6000%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 104±30 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 60±5%.

Пример 2.

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (ДГЭБД) в мольном отношении КМХ: ДГЭБД=1:2, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель, имеющий значение модуля Юнга 6 кПа. Средний размер пор составил 156±40 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 5700%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 75±10 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 60±5%.

Пример 3.

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 2% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля с молекулярной массой 500 Да (ДГЭПЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭПЭГ=1:8, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель со средним размером пор 240±45 мкм, степень набухания в дистиллированной воде - 6600%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ116 нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные сфероиды HCT 116 с ровными границами и средним размером 105±15 мкм. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 70±5%.

Пример 4.

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира полиэтиленгликоля с молекулярной массой 500 Да (ДГЭПЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭПЭГ=1:8, время сшивки составило 7 суток. В результате был получен макропористый криогель со средним размером пор 232±50 мкм, имеющий значение модуля Юнга равный 13 кПа. Степень набухания в дистиллированной воде - 5800%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116 и HEK 293, нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды с ровными границами и средним размером 130±15 мкм при культивировании клеток HEK 293 и 140±25 мкм при культивировании клеток HCT 116. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 80±5%.

Пример 5.

Макропористый криогель готовили описанным выше способом из 3% раствора КМХ с использованием в качестве сшивающего агента диглицидилового эфира этиленгликоля (ДГЭЭГ) в мольном отношении КМХ: ДГЭЭГ=1:5, время сшивки составило 12 суток. В результате был получен макропористый криогель со степенью набухания в дистиллированной воде - 7000%. Криогель пригоден для 3D-культивирования клеток, так как более 80% клеток НСТ 116, нанесенных на верхнюю часть монолитного криогеля, полученного в шприце объемом 2 мл, были обнаружены в элюате после пропускания 17 мл среды через шприц. Через семь дней культивирования клеток HCT 116 в криогеле наблюдали многочисленные плотные сфероиды с ровными границами и средним размером 105±15. Жизнеспособность клеток на седьмой день культивирования составила 80±5%.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен макропористый криогель на основе карбоксиметилхитозана, получаемый сшивкой полимера из растворов с концентрацией 1-3 мас.% посредством диглицидиловых эфиров гликолей при температуре -10°С в течение 7-12 дней при рН 10-11. Изобретение может найти применение в клеточной и тканевой инженерии для 3D-культивирования клеток, в том числе в биомедицине для тестирования эффективности новых фармацевтических препаратов, в том числе противоопухолевых. 5 пр.

Макропористый криогель для клеточной и тканевой инженерии на основе карбоксиметилхитозана, сшитого посредством диглицидиловых эфиров гликолей в растворе с рН=10-11 при температуре -10°С в течение 5-12 дней.