СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 4D ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ГИДРОГЕЛЯ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА Российский патент 2023 года по МПК C08J3/02 A61K47/36 B33Y70/00 A61L27/52 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к технической области производства и получения медицинских материалов, и касается способа получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана. Способ заключается в получении термочувствительного гидрогеля на основе хитозана для восстановления после щелочного ожога на основе технологии 4D-печати.

Уровень техники

Существует множество травм роговицы. В частности, трудно лечить химическое повреждение клинически. Щелочной ожог роговицы представляет собой относительно серьезную химическую травму, вызывающую некроз и дефекты эпителия роговицы, плавление и перфорацию роговицы и конъюнктивы, симблефарон и т.д.; кроме того, тяжелые пациенты могут страдать роговичной слепотой, которая сопровождается образованием избыточного количества новых капилляров. До настоящего времени болезнь в основном лечили с помощью кератопластики или трансплантации амниотической мембраны клинически. Однако, первый способ имеет две основные проблемы: отсутствие донора и иммунологическое отторжение. Что касается второго способа, роговица, как базальная мембрана, может легко развить автолиз вследствие деградации коллагеназами, накопленными в поврежденных тканях после серьезной травмы роговицы, такой как щелочной ожог, поэтому пациенты достигают слабых результатов, даже если они подвергаются многократным трансплантациям. Таким образом, как исправить дефекты эпителия роговицы, уменьшить неоваскуляризацию роговицы и образование рубцов является актуальной проблемой, подлежащей разрешению.

Нанесенные на биогель лимбальные стволовые клетки, полученные методами тканевой инженерии, оказывают некоторое влияние на заживление ран роговицы, однако нерегулярная сетчатая структура и неравномерный размер пор, наблюдаемые на поверхности геля с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), напрямую влияют на эффективность захвата лимбальных стволовых клеток. Например, раскрытый в заявке на патент Китая 201610837528.3 способ получения термочувствительного геля на основе хитозана, содержащего соединение включения тилмикозин, включает следующие стадии: (1) взвешивание хитозана, растворение хитозана в 0,1 моль/л соляной кислоты и перемешивание соляной кислоты в достаточной степени до полного растворения хитозана с получением раствора хитозана с концентрацией 10-20 мг/мл; растворение глицерофосфата натрия в деионизированной воде с получением раствора глицерофосфата натрия с концентрацией 0,2-1,0 г/мл; добавление по каплям раствора глицерофосфата натрия в раствор хитозана для смешивания; доведение значения рН (водородный потенциал) смешанного раствора до 7,1-7,4; равномерное перемешивание полученного смешанного раствора при температуре 4°С с получением термочувствительного геля на основе хитозана; (2) взвешивание HP-β-CD в ступке, взвешивание воды в массовом соотношении воды к HP-β-CD (2-5):1 для растворения HP-β-CD; взвешивание тилмикозина в ступке в массовом соотношении HP-β-CD к тилмикозину 2:1, смешивание и измельчение при 20°С в течение 30 мин с получением белых порошков, и просеивание сквозь сито 80 меш с получением соединения включения тилмикозина; (3) добавление термочувствительного геля на основе хитозана, полученного на стадии (1), в коническую колбу, взвешивание соединения включения тилмикозина, полученного на стадии (2), в конической колбе и равномерное перемешивание соединения включения тилмикозина и термочувствительного геля на основе хитозана на магнитной мешалке при нормальной температуре с получением термочувствительного геля на основе хитозана, содержащего соединение включения тилмикозин. Массовая доля тилмикозина в термочувствительном геле на основе хитозана, содержащем соединение включения тилмикозин, составляет 9,9-10%. Термочувствительный гель на основе хитозана, содержащий соединение включения тилмикозин, хранится при температуре 4°С.

25 февраля 2013 года на конференции TED2013, проходившей в Калифорнии, США, Скайлэр Тибитс из Массачусетского технологического института продемонстрировал слушателям технологию 4D-печати посредством полного эксперимента и разработал технологию с помощью эксперимента. С точки зрения так называемой 4D печати, более конкретно, самодеформирующийся материал может автоматически складываться в соответствующую форму в соответствии с дизайном изделия лишь в определенных условиях (таких как температура, влажность и т.д.) без подключения к какому-либо сложному электромеханическому оборудованию. 4D-печать представляет собой технологию, которая использует 3D-принтер для печати деформируемых материалов. Технология 4D-печати была внедрена в техническую область получения геля. Способ 4D-печати прочного гидрогеля с программируемой деформацией, раскрытый в заявке на патент Китая 201810208715.4, включает следующие стадии: (1) добавление смешанного раствора акриламида и акриловой кислоты к температурному инициатору и про-инициатору, и выдержка в инкубаторе с получением раствора сополимера поли(акриловой кислоты-со-акриламида); добавление смешанного раствора акриловой кислоты и N-изопропилакриламида к температурному инициатору и про-инициатору, и выдержка в инкубаторе с получением раствора сополимера поли(акриламида-со-N-изопропилакриламида); (3) смешивание раствора сополимера поли(акриловой кислоты-со-акриламида) с раствором сополимера поли(акриламида-со-N-изопропилакриламида) с получением смешанных растворов сополимеров поли(акриловой кислоты-со-акриламида) и поли(акриламида-со-N-изопропилакриламида) в двух соотношениях, при этом один раствор с высоким содержанием компонента, сополимера поли(акриламида-со-N-изопропилакриламида), используют в качестве чувствительного к соли материала для управления деформацией, а другой используют в качестве связующего для связывания раствора сополимера поли(акриловой кислоты-со-акриламида) с чувствительным к соли смешанным раствором; (4) используя платформу для 3D-печати экструзия сополимера поли(акриловой кислоты-со-акриламида) и смешанного раствора сополимеров поли(акриловой кислоты-со-акриламида) и поли(акриламида-со-N-изопропилакриламида) на стеклянную подложку с получением соответствующей пространственной структуры формы в соответствии с заданными параметрами печати, соответственно; (5) помещение напечатанной структуры формы в раствор иона Fe(III) в инкубатор для сшивания и затем помещение геля, пропитанного раствором иона Fe(III), в деионизированный водный раствор инкубатора для дальнейшего сшивания с получением равновесной структуры геля; и (6) деформация равновесной структуры геля в концентрированной соленой воде с получением предварительно разработанной структуры формы. Способ получения управляемого температурой программируемого интеллектуального материала для 4D-печати, раскрытый в заявке на патент Китая 201810280579.X, включает следующие стадии: (I) Получение интеллектуального 4D материала термочувствительного гидрогеля высокой плотности: а) композиция сырьевых материалов для 4D интеллектуального материала термочувствительного гидрогеля высокой плотности: использование N-изопропилакриламида в качестве мономера, синтетического силиката лития и магния XLG в качестве сшивающего агента, персульфата калия в качестве инициатора, N,N,N',N'-тетраэтилэтилендиамина в качестве катализатора, и наноцеллюлозы из древесины в качестве упрочняющей фазы, где молярное соотношение мономер:инициатор:катализатор составляет 100:0,370:0,638, концентрация наноцеллюлозы из древесины составляет 3-5 мг/мл, и массовая доля сшивающего агента составляет 3-3,5 масс.%; b) смешивание: взвешивание сырьевого материала в соотношении смеси, описанном на стадии а), перемешивание наноцеллюлозы из древесины на ледяной/водяной бане в течение 30-40 мин и последующая обработка ультразвуком в течение 10-15 мин; затем добавление синтетического силиката магния-лития XLG и перемешивание в течение 60-65 мин; затем добавление N-изопропилакриламида и перемешивание в течение 120-130 мин; наконец, последовательное добавление персульфата калия и N,N,N',N'-тетраэтилэтилендиамина, и перемешивание в течение 5-6 мин; c) инжекция хорошо перемешанного материала, полученного на стадии b), в собранную матрицу, снятие излишков, герметичное закрытие матрицы и выдержка матрицы при 25-27°С в течение 24-26 ч для формования. (II) Синтез управляемого температурой программируемого интеллектуального материала для 4D-печати: a) композиция сырьевого материала для 4D интеллектуального термочувствительного гидрогеля низкой плотности: использование N-изопропилакриламида в качестве мономера, синтетического силиката магния-лития XLG в качестве сшивающего агента, персульфата калия в качестве инициатора, N,N,N',N'-тетраэтилэтилендиамина в качестве катализатора, и наноцеллюлозы из древесины в качестве упрочняющей фазы, где молярное соотношение мономер:инициатор:катализатор составляет 100:0,370:0,638, и концентрация наноцеллюлозы из древесины составляет 0-2 мг/мл, и массовая доля сшивающего агента составляет 3-3,5 масс.%; b) смешивание: взвешивание сырьевого материала в соотношении смеси, описанном на стадии (а), перемешивание наноцеллюлозы из древесины на ледяной/водяной бане в течение 30-40 мин и последующая обработка ультразвуком в течение 10-15 мин; затем добавление синтетического силиката магния-лития XLG и перемешивание в течение 60-65 мин; затем добавление N-изопропилакриламида и перемешивание в течение 120-130 мин; наконец, последовательное добавление персульфат калия и N,N,N',N'-тетраэтилэтилендиамина, и перемешивание в течение 5-6 мин; c) инжекция хорошо смешанного 4D интеллектуального термочувствительного гидрогеля низкой плотности, полученного на стадии b), в собранную матрицу, помещение поверх 4D интеллектуального термочувствительного гидрогеля высокой плотности, снятие излишков, герметизация матрицы и выдержка матрицы при 25-27°С в течение 24-26 ч для формования. Ранее успешно изготавливали управляемый температурой программируемый интеллектуальный материал для 4D-печати. Способ получения само-объединяющегося материала гидрогеля для 4D печати, раскрытый в заявке на патент Китая 201910141257.1, включает следующие стадии: I, синтез CD-акриламида: растворение циклодекстринов (CD) с боковыми группами, замещенными аминогруппами, в слабом основном растворе, доведение pH раствора до 8-10 с помощью основного неорганического вещества, добавление ангидридов, перемешивание при 40-80°С в течение 4-8 ч, выпаривание 90-95% воды из раствора, затем промывание органическим растворителем I, центрифугирование, сбор осадков и вакуумная сушка с получением CD-акриламида, где циклодекстрины с боковыми группами, замещенными аминогруппами на стадии I, могут представлять собой 6-амино-α-CD, 3-амино-α-CD или 6-амино-β-CD; II, синтез азоакриламида: растворение азобензолов и аминов в органическом растворителе II, последующее нагревание до 20-50°С и добавление ангидридов с получением смешанного раствора; затем перемешивание смешанного раствора при температуре 60-65°С в течение 3-5 ч, фильтрование, удаление осадков, концентрирование фильтратов под вакуумом и перекристаллизация из органического растворителя III с получением азоакриламида, где азобензолы могут представлять собой p-аминоазобензол или полиакриламид на основе азобензола, и амины могут представлять собой триэтаноламин или триметиламин; III, полимеризация свободных радикалов в гель: помещение мономера, подвергнутого свободнорадикальной полимеризации, CD-акриламида, полученного на стадии I, азоакриламида, полученного на стадии II, и мономера для усиления жесткости цепи в органический растворитель IV, перемешивание, нагрев до 60-80°С, добавление инициатора, протекание реакции при перемешивании при 60-80°С в течение 15-20 ч, прекращение перемешивания и затем выдержка при 60-65°С в течение от 1-5 ч с получением само-объединяющегося материала гидрогеля для 4D печати, где свободнорадикально полимеризованный мономер может представлять собой акриловую кислоту, акриламид или метакрилат, и мономер для усиления жесткости цепи может представлять собой N-винилкарбазол или стирол. Таким образом, разработка способа получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана для повышения эффективности захвата лимбальных стволовых клеток имеет высокую социальную значимость и практическую ценность.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является преодоление недостатков предшествующего уровня техники и разработка способа получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, чтобы таким образом получить 4D термочувствительный гидрогель на основе хитозана, повышающий эффективность захвата лимбальных стволовых клеток и способствующий восстановлению эпителия роговицы с щелочным ожогом.

Для достижения вышеуказанной цели способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, обеспеченный настоящим изобретением, включает следующие стадии:

(1) при комнатной температуре взвешивание хитозана, растворение хитозана в растворе уксусной кислоты, перемешивание до полного растворения хитозана с получением раствора хитозана; использование 4D-биопринтера для печати раствора хитозана в термочувствительный гидрогель на основе хитозана с размером пор 50-100 мкм в соответствии с заданными параметрами печати, и при желании формование термочувствительного гидрогеля на основе хитозана; лиофилизацию после экстракции растворителем с получением лиофилизированного хитозана;

(2) загрузку сверхчистой воды и β-глицерофосфата натрия в чайник с водяной баней при температуре 60-70°С; после растворения β-глицерофосфата натрия естественное охлаждение до комнатной температуры с получением водного раствора β- глицерофосфата натрия;

(3) приготовление водного раствора карбоксиметилхитозана со сверхчистой водой при комнатной температуре, добавление по каплям водного раствора β-глицерофосфата натрия, полученного на стадии (2), в водный раствор карбоксиметилхитозана и тщательное перемешивание с получением смеси; и

(4) сшивание лиофилизированного хитозана, полученного на стадии (1), со смесью, полученной на стадии (3), в течение 1-2 мин с получением 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор.

В настоящем изобретении молярная концентрация раствора уксусной кислоты, описанного на стадии (1), составляет 0,2 моль/л, и концентрация раствора хитозана составляет от 2,2 масс.% до 6,7 масс.%; концентрация водного раствора β-глицерофосфата натрия составляет от 6 масс.% до 8 масс.%; концентрация водного раствора карбоксиметилхитозана, полученного на стадии (3), составляет от 2,2 масс.% до 6,7 масс.%; концентрации хитозана, карбоксиметилхитозана и β-глицерофосфата натрия в 4D термочувствительном гидрогеле на основе хитозана, полученном на стадии (4), составляют 10-30 масс.%, 10-30 масс.% и 60-80 масс.%, соответственно.

В настоящем изобретении 4D термочувствительный гидрогель на основе хитозана может храниться в стерильной среде при 4-15°С в течение 6-12 месяцев.

После захвата лимбальных стволовых клеток 4D термочувствительный гидрогель на основе хитозана, полученный в соответствии с настоящим изобретением, наносят на поверхность обожженной щелочью роговицы и высвобождает лимбальные стволовые клетки для восстановления и лечения раны.

По сравнению с предшествующим уровнем техники в настоящем изобретении применяется технология 4D-биопечати для получения термочувствительного гидрогеля на основе хитозана; использование термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор в качестве скаффолда для трансплантации лимбальных стволовых клеток может эффективно повысить эффективность захвата лимбальных стволовых клеток и способствовать восстановлению обожженной щелочью эпителиальной оболочки роговицы. С помощью своих научных и надежных принципов настоящее изобретение решает проблему, заключающуюся в том, что общепринятые термочувствительные гидрогели имеют неравномерный размер пор, и повышает эффективность захвата и способность лимбальных стволовых клеток; настоящее изобретение имеет важное теоретическое значение и широкие перспективы применения в области заживления ран роговицы, обеспечивая помощь пациентам, которым требуется восстановление щелочных ожогов роговицы в клинической медицине.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана структуру хитозана, описанного на стадии (1) примера 1 настоящего изобретения.

На фигуре 2 показана структура 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, описанного на стадии (4) примера 1 настоящего изобретения.

На фигуре 3 показано состояние 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, захватывающего лимбальные стволовые клетки при 40-кратном увеличении, описанного в примере 2 настоящего изобретения.

На фигуре 4 показано состояние 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, захватывающего лимбальные стволовые клетки при 10-кратном увеличении, описанного в примере 2 настоящего изобретения.

На фигуре 5 показано сравнение эффективности лимбальных стволовых клеток, захваченных общепринятым термочувствительным гидрогелем, по сравнению с лимбальными стволовыми клетками, захваченными 4D термочувствительным гидрогелем на основе хизозана, при лечении кроликов, имеющих щелочные ожоги роговицы.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение подробно описано ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи и конкретные примеры.

Пример 1:

Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, описанного в примере, включает следующие стадии:

(1) при комнатной температуре, взвешивание хитозана, растворение хитозана в 0,2 моль/л растворе уксусной кислоты, перемешивание в течение 12 ч до полного растворения хитозана с получением 4,4 масс.% раствора хитозана; печать раствора хитозана в круглый термочувствительный гидрогель на основе хитозана с размером пор 50-100 мкм в соответствии с заданными параметрами печати (интервал между отверстиями 600 мкм, высота слоя 100 мкм, температура слоя -25°С, скорость печати 15 мм/с, диаметр сопла 0,3 мм и производительность 0,1 г/мин) с помощью биопринтера UN-4DBI-C01 4D; лиофилизация после экстракции растворителем с получением лиофилизированного хитозана, как показано на фигуре 1;

(2) загрузку сверхчистой воды и β-глицерофосфата натрия в чайник с водяной баней при температуре 65°С; после растворения β-глицерофосфата натрия естественное охлаждение до комнатной температуры с получением 7 масс.% водного раствора β-глицерофосфата натрия;

(3) приготовление 4,4 масс.% водного раствора карбоксиметилхитозана со сверхчистой водой при комнатной температуре, добавление по каплям водного раствора β-глицерофосфата натрия, полученного на стадии (2), в водный раствор карбоксиметилхитозана и тщательное перемешивание с получением смеси; и

(4) сшивание лиофилизированного хитозана, полученного на стадии (1), со смесью, полученной на стадии (3), в течение 1-2 минут с получением 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор, как показано на фигуре 2, при этом концентрации хитозана, карбоксиметилхитозана и β-глицерофосфата натрия в 4D термочувствительном гидрогеле на основе хитозана составляют 18 масс.%, 18 масс.% и 64 масс.%, соответственно.

Пример 2:

Этот пример относится к процессу захвата лимбальных стволовых клеток 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, полученным в примере 1:

(1) 4D термочувствительный гидрогель на основе хитозана помещали и полностью пропитывали в чашке Петри с получением 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана для захвата;

(2) лимбальные стволовые клетки отделяли, культивировали и загружали в 4D термочувствительный гидрогель на основе хитозана для захвата, полученный на стадии (1), для дальнейшего культивирования;

(3) после культивирования в течение 24 ч состояние лимбальных стволовых клеток, захваченных 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, наблюдали под микроскопом при 40- и 10-кратном увеличении, соответственно.

Пример 3:

Этот пример относится к сравнительному тестированию эффективности лимбальных стволовых клеток, захваченных 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, по сравнению с лимбальными стволовыми клетками, захваченными общепринятым термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, в лечении кроликов с щелочными ожогами роговицы.

(1) Роговицы живых кроликов подвергали щелочным ожогам для получения животных моделей щелочных ожогов.

(2) Животные модели щелочных ожогов, полученные на стадии (1), обрабатывали лимбальными стволовыми клетками, захваченными общепринятым термочувствительным гидрогелем, с получением моделей лечения общепринятым термочувствительным гидрогелем.

(3) Животные модели щелочных ожогов, полученные на стадии (1), обрабатывали лимбальными стволовыми клетками, захваченными 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, полученными в примере 1, с получением моделей лечения 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана.

(4) Эффективность обеих моделей наблюдали через 28 дней после лечения, соответственно. Как показано на фигуре 5, после процедуры щелочных ожогов области раны роговицы (белые области на фигуре) в каждой группе постепенно уменьшались с течением времени; более того, группа, подвергнутая лечению 4D термочувствительным гидрогелем на основе хитозана, обладала значительно лучшим восстанавливающим эффектом, чем группа, подвергнутая лечению общепринятым термочувствительным гидрогелем, и группа, не подвергнутая лечению восстанавливающими средствами.

Настоящее изобретение относится к способу получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, включающему следующие стадии: (1) при комнатной температуре взвешивание хитозана, растворение хитозана в растворе уксусной кислоты, перемешивание до полного растворения хитозана с получением раствора хитозана; использование 4D-биопринтера для печати раствора хитозана в термочувствительный гидрогель на основе хитозана с размером пор 50-100 мкм в соответствии с заданными параметрами печати: интервал между отверстиями 600 мкм, высота слоя 100 мкм, температура слоя -25°С, скорость печати 15 мм/с, диаметр сопла 0,3 мм и производительность 0,1 г/мин; и лиофилизация после экстракции растворителем с получением лиофилизированного хитозана; (2) загрузка сверхчистой воды и β-глицерофосфата натрия в емкость с водяной баней при температуре 60-70°С; после растворения β-глицерофосфата натрия естественное охлаждение до комнатной температуры с получением водного раствора β-глицерофосфата натрия; (3) приготовление водного раствора карбоксиметилхитозана со сверхчистой водой при комнатной температуре, добавление по каплям водного раствора β- глицерофосфата натрия, полученного на стадии (2), в водный раствор карбоксиметилхитозана и тщательное перемешивание с получением смеси; и (4) сшивание лиофилизированного хитозана, полученного на стадии (1), со смесью, полученной на стадии (3), в течение 1-2 мин с получением 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор; причем концентрации хитозана, карбоксиметилхитозана и β-глицерофосфата натрия в 4D термочувствительном гидрогеле на основе хитозана, полученном на стадии (4), составляют 10-30 масс.%, 10-30 масс.% и 60-80 масс.% соответственно. Настоящее изобретение обеспечивает получение термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор, который может быть использован в качестве скаффолда для трансплантации лимбальных стволовых клеток, что способствует повышению эффективности захвата лимбальных стволовых клеток и способствует восстановлению обожженной щелочью эпителиальной оболочки роговицы. 5 з.п. ф-лы, 3 пр., 5 ил.

1. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, включающий следующие стадии:

(1) при комнатной температуре взвешивание хитозана, растворение хитозана в растворе уксусной кислоты, перемешивание до полного растворения хитозана с получением раствора хитозана; использование 4D-биопринтера для печати раствора хитозана в термочувствительный гидрогель на основе хитозана с размером пор 50-100 мкм в соответствии с заданными параметрами печати: интервал между отверстиями 600 мкм, высота слоя 100 мкм, температура слоя -25°С, скорость печати 15 мм/с, диаметр сопла 0,3 мм и производительность 0,1 г/мин; и лиофилизация после экстракции растворителем с получением лиофилизированного хитозана;

(2) загрузка сверхчистой воды и β-глицерофосфата натрия в емкость с водяной баней при температуре 60-70°С; после растворения β-глицерофосфата натрия естественное охлаждение до комнатной температуры с получением водного раствора β-глицерофосфата натрия;

(3) приготовление водного раствора карбоксиметилхитозана со сверхчистой водой при комнатной температуре, добавление по каплям водного раствора β- глицерофосфата натрия, полученного на стадии (2), в водный раствор карбоксиметилхитозана и тщательное перемешивание с получением смеси; и

(4) сшивание лиофилизированного хитозана, полученного на стадии (1), со смесью, полученной на стадии (3), в течение 1-2 мин с получением 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана с однородным размером пор; причем концентрации хитозана, карбоксиметилхитозана и β-глицерофосфата натрия в 4D термочувствительном гидрогеле на основе хитозана, полученном на стадии (4), составляют 10-30 масс.%, 10-30 масс.% и 60-80 масс.% соответственно.

2. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана по п.1, в котором молярная концентрация раствора уксусной кислоты, полученного на стадии (1), составляет 0,2 моль/л, и концентрация раствора хитозана составляет от 2,2 до 6,7 масс.%.

3. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана по п.1, в котором концентрация водного раствора β-глицерофосфата натрия составляет от 6 до 8 масс.%.

4. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана по п.1, в котором концентрация водного раствора карбоксиметилхитозана, полученного на стадии (3), составляет от 2,2 до 6,7 масс.%.

5. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана по п.1, в котором осуществляют формование термочувствительного гидрогеля на основе хитозана, полученного на стадии (1).

6. Способ получения 4D термочувствительного гидрогеля на основе хитозана по любому из пп.1-5, в котором термочувствительный гидрогель на основе хитозана 4D способен сохраняться в стерильной среде при 4-15°С в течение 6-12 месяцев.