Способ морфоментрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по содержанию AIF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N33/574 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) путем проведения иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов лимфатических узлов и морфометрической оценки содержания в них AIF-позитивных опухолевых клеток.

Согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения ДВККЛ включает в себя большую группу опухолей, различающихся между собой по биологическим свойствам и клиническому течению. Частота встречаемости нозологии составляет 25-35% от всех неходжкинских лимфом. Несмотря на выраженное разнообразие форм и проявлений заболевания, лечение в большинстве случаев остается однотипным. Стандартом терапии является протокол R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон), в результате применения которого удается достичь полной ремиссии примерно в 60% случаев. У одной трети больных развивается рецидив и/или заболевание исходно является рефрактерным к терапии. Прогноз течения ДВККЛ определяется по международному прогностическому индексу (МПИ) (WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. (Revised 4th edition) / Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. [et al.] // IARC: Lyon. - 2017. P. 291-298). Отмечается, что МПИ эффективен только в части случаев, так как учитывает в основном клинические критерии оценки рисков. По этой причине в последние годы особое внимание уделяется идентификации молекулярных характеристик опухолевых клеток (биомаркеров), способных прогнозировать течение опухоли, определять степень ее агрессивности и восприимчивость к стандартной химиотерапии.

Актуальным направлением исследований на сегодняшний день является изучение молекулярных механизмов программированной гибели клеток-апоптоза. Известно, что его нарушение ассоциировано с развитием различных опухолей, в том числе гематологических. Одним из главных участников митохондриального (внутреннего) пути гибели клеток является белок AIF - апоптоз инициирующий фактор. Это один из компонентов, высвобождающихся из межмембранного митохондриального пространства в ответ на активацию апоптоза при окислительном стрессе, повреждении ДНК, гипоксии. Активируясь, AIF соединяется с несколькими регуляторными белками, перемещается в ядро клетки, где в комплексе с рядом ферментов вызывает фрагментацию ДНК (Apoptosis-Inducing Factor (AIF) in Physiology and Disease: The Tale of a Repented Natural Born Killer / Banoa D., Prehn J.H. // EBioMedicine. - 2018. - Vol. 30 - P. 29-37).

В исследованиях французских ученых на мышах (Harlequin штамм) выявлена ключевая роль экспрессии AIF в кроветворении и иммунном ответе (AIF loss deregulates hematopoiesis and reveals different adaptive metabolic responses in bone marrow cells and thymocytes / Cabon L, Bertaux A, Brunelle-Navas M.N. [et al.] // Cell Death & Differentiation. - 2018. - Vol. 25 - P. 983-1001; Mitochondrial AIF loss causes metabolic reprogramming, caspase-independent cell death blockade, embryonic lethality, and perinatal hydrocephalus / Delavallée L., Mathiah N., Cabon L. [et al.] // Molecular metabolism. - 2020. - Vol. 40 - P. 1-17). У животных с дефицитом белка в гемопоэтических клетках наблюдалась депрессия тимопоэза, нарушение дифференцировки В-клеток и эритроидного ростка кроветворения. Прогностическое значение экспрессии AIF при гематологических неоплазиях проанализировано в единичных работах. Установлено, что высокая экспрессия AIF у пациентов с ДВККЛ, лечившихся по схеме CHOP, ассоциировалась с более длительной общей выживаемостью (OB) (Prognostic significance of BAD and AIF apoptotic pathways in diffuse large B-cell lymphoma / Troutaud D., Petit В., Bellanger C. [et al.] // Clin. Lymphoma Myeloma Leuk. - 2010. - Vol. 10 - P. 118-124). Напротив, у больных хроническим миелоидным лейкозом гипреэкспрессия маркера предвещала плохой прогноз и устойчивость к проводимой терапии (Phase Protein Array Profiling Reveals Distinct Proteomic Signatures Associated With Chronic Myeloid Leukemia Progression and With Chronic Phase in the CD34-Positive Compartment / s-Cardama A.Q., Qiu Yi H., Post S.M. [et al.] // Cancer. - 2012. - P. 5283-5292). Несмотря на свою неоднозначность, результаты исследований показывают, что биомаркер AIF играет важную роль в патогенезе гематологических заболеваний, а также может рассматриваться в качестве перспективного прогностического биомаркера при ДВККЛ.

Целью изобретения является разработка способа морфометрического прогнозирования течения ДВККЛ по относительному содержанию AIF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.

Близким техническим решением к предлагаемому изобретению является исследование значения экспрессии проапоптотических белков BAD и AIF при ДВККЛ, проведенное французскими учеными (Prognostic significance of BAD and AIF apoptotic pathways in diffuse large B-cell lymphoma / Troutaud D., Petit В., Bellanger C. [et al.] // Clin. Lymphoma Myeloma Leuk. - 2010. - Vol. 10 - P. 118-124). В работе ретроспективно проанализирован биологический материал (лимфоузлы) от 46 пациентов с ДВККЛ de novo, проходивших лечение по протоколу CHOP. Детекция AIF-позитивных опухолевых клеток в исследуемом материале проведена с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ). Экспрессия AIF оценена полуколичественным методом по проценту позитивных опухолевых клеток, используя бальную шкалу (0-10%; 1+, 10%-30%; 2+, 30%-50%; 3+, >50%). По степени интенсивности окраски (0, 1 - слабый, 2 - умеренный, 3 - сильный, 4 - очень сильный) выборка разделена на группы пациентов с высокой и низкой экспрессией AIF. Указанным методом оценена ОВ больных, опухолевые клетки которых экспрессируют на своей поверхности моноклональное антитело AIF.

Недостатком описанного способа является то, что в нем экспрессия белка учитывается только полуколичественным методом без вычисления относительного содержания AIF-позитивных опухолевых клеток и определения порогового значения, за счет чего пациенты не могут быть точно стратифицированы на группы высокого/низкого риска. Также исследование проводили у больных, лечившихся с применением иммунотерапии по протоколу CHOP, тогда как стандартом лечения признан протокол R-CHOP.

Следовательно, рассмотренный аналог не позволяет количественно оценить состояние опухоли и более точно стратифицировать пациентов на группы риска.

Способа морфометрической оценки прогноза течения ДВККЛ по относительному содержанию AIF-положительных опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов не существует.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Технический результат - получение объективных критериев прогнозирования течения ДВККЛ с помощью морфометрической оценки относительного содержания AIF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.

Способ осуществляют следующим образом.

После биопсии лимфоузла у больных ДВККЛ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм из приготовленных парафиновых блоков лимфатических узлов по общепринятому способу. Для идентификации опухолевых клеток, положительных к антителу AIF, использовали ИГХ метод исследования в соответствии с адаптированным к требованиям лаборатории патоморфологии протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрический подсчет относительного содержания AIF-позитивных опухолевых клеток выполняли на световом микроскопе «AxioScope.Al» фирмы «Carl Zeiss М icroscopy GmbH» при увеличении ×1000 (окуляры ×10, объектив ×100) со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли среднее относительное содержание AIF-положительных опухолевых клеток по формуле:

S=D/n×100%, где:

S - доля AIF положительных клеток в лимфатическом узле, %;

D - среднее количество AIF-позитивных клеток в 10 полях зрения;

n - общее количество клеток в 10 полях зрения.

Возможность применения предложенного способа подтверждает исследование гистологических препаратов лимфоузлов от 100 пациентов с ДВККЛ с морфологически и иммуногистохимически верифицированным диагнозом ДВККЛ, установленным в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008-2017 гг. Больные наблюдались в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России с 2012 по 2019 гг. (клинико-диагностическое отделение гематологии и химиотерапии с дневным стационаром) и получали терапию 1 линии по схеме R-CHOP. Медиана возраста составила 59 лет (диапазон 23-80 лет). Прогностически значимый порог экспрессии AIF вычисляли с помощью ROC-анализа, показатель соответствовал 57% позитивных опухолевых клеток, экспрессирующих белок (специфичность - 68%; чувствительность - 76%). Согласно установленному пороговому значению, всех обследуемых разделили на группы с высокой [≥57%, n=57] и низкой [<57%, n=43] экспрессией маркера. Данный показатель позволил стратифицировать пациентов в группы с разным течением заболевания. У 57 обследованных зарегистрировано благоприятное течение ДВККЛ (≥57%), у 43 больных - неблагоприятное (<57%).

Установлено, что 5-летняя ОВ в группе с низкой экспрессией AIF соответствовала 34,9% (медиана выживаемости 25 мес.) против 82,5% (медиана не достигнута) у пациентов с высоким уровнем экспрессии белка (р<0,001; HR=4,7; 95% CI=2,3-9,8).

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение ДВККЛ после биопсии лимфатических узлов по относительному содержанию AIF-положительных опухолевых клеток в гистологических срезах.

Пример 1

Пациент Ш., 69 лет. Диагноз диффузная В-крупноклеточная лимфома установлен в феврале 2017 г. На основании клинических данных выявлено увеличение надключичного лимфатического узла, диагноз подтвержден гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями. Согласно классификации Ann Arbor установлена IVA стадия заболевания, группа риска по международному прогностическому индексу - высокая, подтип заболевания non-GCB (негерминальный). После биопсии надключичного лимфоузла проведено ИГХ-исследование опухолевых клеток в гистологических срезах по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное количество AIF-позитивных клеток на уровне 60%, по результатам которого определен благоприятный прогноз течения ДВККЛ. При динамическом наблюдении прогноз подтвержден. Стационарно, в ФГБУН КНИИГиПК в марте 2017 г. проведено 6 курсов химиотерапии по протоколу R-CHOP. Получена полная ремиссия, которая сохраняется по настоящее время. Таким образом, у больного отмечалось благоприятное течение ДВККЛ при экспрессии AIF≥57% опухолевых клеток.

Пример 2

Пациентка Б., 62 лет. Диагноз диффузная В-крупноклеточная лимфома установлен в феврале 2014 г. На основании клинических данных выявлено увеличение подмышечного лимфатического узла, диагноз подтвержден гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями. Согласно классификации Ann Arbor установлена IVA стадия заболевания, группа риска по международному прогностическому индексу - промежуточная высокая, подтип заболевания non-GCB (нетерминальный). После биопсии подмышечного лимфоузла проведено ИГХ-исследование опухолевых клеток в гистологических срезах по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное количество AIF-позитивных клеток на уровне 6%, по результатам которого установлен неблагоприятный прогноз течения ДВККЛ. При динамическом наблюдении прогноз подтвержден. Стационарно, в ФГБУН КНИИГ и ПК с февраля по июнь 2014 г. проведено 6 курсов химиотерапии по протоколу R-CHOP, получена частичная ремиссия. В августе 2015 г. развился рецидив заболевания. При дальнейшем лечении положительные результаты не достигнуты. В феврале 2018 г. пациентка скончалась. Таким образом, у больной отмечалось неблагоприятное течение ДВККЛ при экспрессии AIF <57% опухолевых клеток.

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по относительному содержанию AIF-позитивных опухолевых клеток в гистологическом образце прогнозировать течение ДВККЛ после биопсии лимфатического узла. При количестве AIF-положительных клеток ≥57% констатируют благоприятное течение ДВККЛ, а при <57% - неблагоприятное.

Предлагаемый способ информативен, экспрессия маркера может быть использована в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВККЛ после лимфаденэктомии в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается способа морфоментрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) по содержанию AIF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах. Способ включает проведение после биопсии лимфатических узлов в гистологических срезах иммуногистохимического окрашивания и морфометрический подсчет относительного количества AIF-позитивных опухолевых клеток по формуле. В результате чего при значениях AIF-положительных опухолевых клеток ≥57% прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы. При содержании AIF-позитивных клеток <57% - неблагоприятное течение заболевания. Способ информативен, может быть использован в практической гематологии для прогнозирования течения ДВККЛ и выбора оптимального терапевтического подхода. 2 пр.

Способ морфометрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по содержанию AIF-позитивных опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов, заключающийся в том, что после биопсии лимфатических узлов в гистологических срезах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество AIF-позитивных опухолевых клеток по формуле: S=D/n×100%, где S - среднее относительное содержание AIF-позитивных клеток в одном опухолевом образце (%), D - количество AIF-позитивных опухолевых клеток в 10 полях зрения, n - общее количество клеток в 10 полях зрения, в результате чего при значениях AIF-положительных опухолевых клеток ≥57% прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а при содержании AIF-позитивных клеток <57% - неблагоприятное течение заболевания.