Способ морфометрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по индексу доли р16INK4A- и р14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) путем проведения иммуногистохимического окрашивания опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов, морфометрической оценки содержания p16INK4A- и p14ARF-позитивных клеток и последующего расчета индекса доли p16INK4A- и p14ARF-положительно маркированных неоплазированных клеток.

ДВККЛ - распространенное лимфопролиферативное заболевание, на долю которого приходится 30 - 40 % всех неходжкинских лимфом. По данным классификации Всемирной организации здравоохранения (2017) данная нозология представляет собой совокупность высокогетерогенных опухолей с различными клиническими проявлениями, морфологическими характеристиками, генетическими аберрациями, неодинаковыми ответом на терапию и прогнозом. Согласно литературным источникам только у 65 % пациентов, получивших стандартную химиотерапию, достигается полный ответ (Long-term outcome of patients in the LNH-98.5 trial, the first randomized study comparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCL patients: a study by the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte / B. Coiffier, C. Thieblemont, E. Neste [at al.] // Blood. - 2010. - Vol.116. - P. 2040-2045). Неудачи первой линии терапии представляют значительную клиническую проблему, поскольку большинство пациентов, рефрактерных к лечению, умирают от заболевания. Наиболее широко применяемым инструментом для оценки индивидуального риска раннего прогрессирования ДВККЛ является международный прогностический индекс (МПИ) и его модификации. Тем не менее, данная шкала несовершенна, что указывает на необходимость исследования и внедрения дополнительных критериев, позволяющих спрогнозировать течение ДВККЛ. По мнению ряда авторов, это связано с тем, что МПИ базируется на клинических характеристиках болезни и не принимает во внимание биологические характеристики опухоли (Клинико-гематологические показатели прогноза ответа на терапию первой линии у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой / С. В. Самарина, Е. Л. Назарова, Н. В. Минаева [и др.] // Клиническая онкогематология. - 2019. - № 12. - С.68-72). В свете вышеизложенного поиск дополнительных биологических критериев, уточняющих прогноз заболевания, является актуальным.

При различных злокачественных новообразованиях одним из наиболее часто мутирующих является ген ингибитора циклинзависимой киназы 2А (CDKN2A). Он кодирует неродственные белки p16INK4A и p14ARF, являющиеся мощными супрессорами опухолевого роста. Протеин p16INK4A контролирует прохождение G1-S фазы клеточного цикла и способен ингибировать активность циклин-зависимых киназ 4 и 6 (CDK4/6), способствуя ретинобластомо (RB)-зависимой остановке клеточного цикла. Дисфункция сигнальной оси p16INK4A-CDK4/6-RB наблюдается при большинстве злокачественных заболеваний человека, при этом инактивация p16INK4A является наиболее распространенным нарушением. Белок p14ARF является участником другого биологического каскада - p14ARF-MDM2-p53. В ответ на онкогенные стимулы p14ARF ингибирует функции онкобелка MDM2, активирует опухолевый супрессор р53, который индуцирует остановку клеточного цикла или апоптоз. Интересно, что p14ARF связывает наиболее важные сигнальные пути супрессоров опухолей - р53 и Rb. Он способен запускать р53-зависимую контрольную точку, когда путь Rb угнетен.

Показано, что высокое количество p16INK4A-экспрессирующих клеток имело неблагоприятное прогностическое значение при некоторых видах злокачественных новообразований (p16 expression in colorectal adenocarcinoma: marker of aggressiveness and morphological types / Lam A.K., Ong K., Giv M.J. [et al.] // Pathology. - 2008. - №40. - P. 580 - 585.). Известно, что экспрессия p14ARF может быть повышена вследствие потери функций р53. В то же время имеется гипотеза, что протеин p14ARF помимо опухоль-супрессирующей функции обладает проонкогенными свойствами, способствуя прогрессированию опухоли благодаря способности вызывать аутофагию (The ARF tumor suppressor can promote the progression of some tumors / Humbey O., Pimkina J., Zilfou J.T. [et al.] // Cancer Res. - 2008. - №68. - Р.9608-9613).

Вышеприведенные сведения свидетельствуют о перспективности оценки содержания p16INK4A- и p14ARF-позитивных клеток в опухолевом субстрате, а также расчета индекса доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных клеток для прогнозирования течения ДВККЛ.

Целью изобретения является разработка способа морфометрического прогнозирования течения ДВККЛ по индексу доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.

Близкими техническими решениями к предполагаемому изобретению являются способы определения характера течения неходжкинских лимфом (P14ARF nuclear overexpression in aggressive B-cell lymphomas is a sensor of malfunction of the common tumor suppressor pathways / A. Sánchez-Aguilera, M. Sánchez-Beato, J. F. Garcı́a [et al.] // Blood. - 2002. - Vol. 99, I. 4. - P. 1411-1418; Correlations between p16 Protein Expression and Genomic Profile in Mantle Cell Lymphoma and Impact on Survival, a Lyma-Genomic Project Conducted on Behalf of the Lysa Group / Y. L.E. Bris, D. Canioni, B. Burroni [et al.]. / Blood. - 2018. - № 132. - Р. - 2846), которые нами выбраны в качестве прототипа. В основе первого способа лежит оценка качественной экспрессии p14ARF в опухолевых клетках с помощью иммуногистохимического анализа при всех вариантах агрессивных В-клеточных лимфом, позволяющая прогнозировать характер течения заболевания, исходя из наличия аномальной ядерной экспрессии. Второй метод основан на количественном подсчете доли р16-экспрессирующих клеток при лимфоме из клеток мантии и указывает на низкую выживаемость больных при содержании p16INK4a-позитивных клеток ≥ 10 %.

Недостатком предложенных способов является анализ только одного критерия - экспрессии p14ARF качественным методом или количественной оценки p16INK4A-позитивных клеток. При злокачественных новообразованиях претерпевают изменения несколько биологических путей, наиболее часто подвержены нарушениям пути-регуляторы клеточного цикла р53 и RB. Одновременные изменения описанных выше молекулярных каскадов могут оказывать прогностически крайне неблагоприятное влияние на течение заболевания. Кроме того, в первой работе при оценке относительного содержания (доли) позитивно окрашенных опухолевых клеток не использовалось пороговое значение экспрессии изучаемых белков, установленное с помощью ROC-анализа; подсчет экспрессирующих опухолевых клеток выполняли в опухолевой ткани, а не в лимфатических узлах и без учета конкретного варианта В-крупноклеточной лимфомы.

Способа морфометрического прогнозирования течения ДВККЛ по индексу доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах не существует.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Технический результат состоит в получении объективных критериев прогнозирования течения ДВККЛ с помощью индекса доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.

Технический результат достигается тем, что после биопсии лимфатических узлов на гистологических препаратах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество опухолевых клеток, экспрессирующих p16INK4A и p14ARF, по формулам (1) и (2)

где S₁₆ - доля p16INK4A-позитивных клеток в препарате, в %, D₁₆ - количество p16INK4A-положительных клеток в 10 полях зрения, n - общее количество клеток в 10 полях зрения,

где S₁₄ - доля p14ARF-позитивных клеток в препарате, в %, D₁₄ - количество p14ARF-положительных элементов в 10 полях зрения, n - общее количество клеток в 10 полях зрения,

определяют индекс доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток I, в %, по формуле (3)

в результате чего при значениях индекса менее 36 % прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а при не менее 36 % - неблагоприятный исход заболевания.

Способ осуществляют следующим образом.

После биопсии лимфатических узлов у больных ДВККЛ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм из приготовленных парафиновых блоков лимфатических узлов по общепринятому способу. Для идентификации неоплазированных элементов, положительных к антителам p16INK4A и p14ARF, использовали иммуногистохимический (ИГХ) метод исследования в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрический подсчет относительного содержания p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток выполняли на световом микроскопе «AxioScope.Al» фирмы «Carl Zeiss М icroscopy GmbH» при увеличении ×1000 (окуляры х10, объектив х100) со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого маркера и образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли относительное содержание p16INK4A- и p14ARF-позитивных клеток в опухолевом образце (S₁ и S₂ соответственно) по формулам (1) и (2).

Индекс доли (I, %) у каждого пациента определяли по формуле (3).

Возможность применения предложенного способа подтверждает исследование гистологических препаратов лимфатических узлов 104 пациентов с ДВККЛ. С помощью ROC-анализа установлено пороговое значение индекса доли опухолевых клеток, экспрессирующих белки p16INK4A- и p14ARF, соответствующее 36 %. Данный показатель позволил стратифицировать пациентов на группы с разным течением заболевания. У 41 (39,4 %) больного зарегистрировано благоприятное течение ДВККЛ (I < 36 %), у 63 (60,6 %) - неблагоприятное (I ≥ 36 %).

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение ДВККЛ после биопсии лимфатических узлов по индексу доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток в гистологических срезах.

Пример 1

Пациентка Ж., 1974 года рождения. В 2018 году установлен диагноз ДВККЛ, 4 стадия, GCB подтип на основании гистологического и ИГХ исследований биоптата шейного лимфатического узла в КНИИГиПК ФМБА России. При обследовании обнаружено поражение периферических лимфатических узлов, средостения. Согласно МПИ установлен высокий риск. Выполнена биопсия шейного лимфатического узла, проведено ИГХ-окрашивание неопластических клеток в гистологических срезах опухоли по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определен индекс доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток, равный 70 %. Полученное значение указывало на неблагоприятный прогноз ДВККЛ. После 6 курсов химиотерапии по стандартному протоколу R-CHOP получен полный ответ. Спустя 8 месяцев после начала лечения обнаружено прогрессирование заболевания. После высокодозной блоковой терапии проведена аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток периферической крови. Спустя 26 месяцев после постановки диагноза пациентка умерла. Проведенное обследование больной с применением предложенного способа подтвердило высокую точность прогноза.

Пример 2

Пациентка Ш., 1947 года рождения. В 2017 году установлен диагноз ДВККЛ, 4 стадия, с поражением периферических лимфоузлов, средостения, обоих легких, позвонков (non-GCB подтип). Согласно МПИ установлен высокий риск. После биопсии шейного лимфоузла проведено ИГХ-исследование опухолевых клеток в гистологических срезах по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определен индекс доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток на уровне 20 %, по результатам которого предположен благоприятный прогноз течения ДВККЛ. При динамическом наблюдении прогноз подтвержден. После 6 курсов терапии по стандартному протоколу R-CHOP у пациентки достигнут полный ответ, который сохраняется по настоящее время, ремиссия длится более чем 60 месяцев.

Пример 3

Пациент Б., 1962 года рождения. В 2017 году установлен диагноз ДВККЛ с поражением периферических лимфоузлов, 4 стадия, GCB подтип. Согласно МПИ установлен высокий-промежуточный риск. После биопсии шейного лимфоузла проведено ИГХ-исследование опухолевых клеток в гистологических срезах по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определен индекс доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток на уровне 15 %, по результатам которого предположен благоприятный прогноз течения ДВККЛ. При динамическом наблюдении прогноз подтвержден. После 6 курсов терапии по стандартному протоколу R-CHOP у пациента достигнут полный ответ, который сохраняется по настоящее время по данным ПЭТ/КТ, ремиссия длится более чем 60 месяцев.

Заявляемое изобретение позволяет прогнозировать характер течения ДВККЛ по индексу доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах. При индексе доли p16INK4A- и p14ARF-позитивных опухолевых клеток < 36 % прогнозируют благоприятное течение ДВККЛ, а при индексе ≥36 % - неблагоприятное течение неоплазии.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВККЛ после лимфаденэктомии в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях.

Изобретение относится к медицине. Раскрыт способ морфометрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по индексу доли р16INK4A- и р14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах, характеризующийся тем, что после биопсии лимфатических узлов на гистологических препаратах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество опухолевых клеток, экспрессирующих р16INK4A и р14ARF, и определяют индекс доли р16INK4A- и р14ARF-позитивных опухолевых клеток. При значениях индекса менее 36 % прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а при не менее 36 % – неблагоприятный исход заболевания. Изобретение обеспечивает получение объективных критериев прогнозирования диффузной В-крупноклеточной лимфомы. 3 пр.

Способ морфометрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по индексу доли р16INK4A- и р14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах, характеризующийся тем, что после биопсии лимфатических узлов на гистологических препаратах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество опухолевых клеток, экспрессирующих р16INK4A и р14ARF, по формулам

S₁₆ = D₁₆/n x 100 %,

где S₁₆ – доля р16INK4A-позитивных клеток в препарате, в %, D₁₆ – количество р16INK4A-положительных клеток в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

S₁₄ = D₁₄/n x 100 %,

где S₁₄ – доля р14ARF-позитивных клеток в препарате, в %, D₁₄ – количество р14ARF-положительных элементов в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

определяют индекс доли р16INK4A- и р14ARF-позитивных опухолевых клеток I, в %, по формуле

I = (S₁₆ + S₁₄) / 2,

в результате чего при значениях индекса менее 36 % прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а при не менее 36 % – неблагоприятный исход заболевания.