СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ НОДУЛЯРНОГО СКЛЕРОЗА ЛИМФОМЫ ХОДЖКИНА ПУТЕМ МОРФОМЕТРИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ИНДЕКСА ДОЛИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК PD-L1 К BCL2 В ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения нодулярного склероза классической лимфомы Ходжкина (кЛХ) путем морфометрического подсчета в гистологических срезах лимфатических узлов относительного содержания PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания и последующего расчета индекса доли (ИД) PD-L1 и BCL2-положительных опухолевых клеток.

В настоящее время активно ведется поиск прогностических биомаркеров и терапевтических мишеней при кЛХ. В клинической практике для оценки прогноза используется международная шкала IPS, включающая в себя возраст пациента, стадию болезни и основные клинико-лабораторные параметры. Данная прогностическая модель считается простой и легко воспроизводимой (Rassidakis G.Z., Medeiros J.L, Vassilakopoulos T.P. et al. BCL-2 expression in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin disease predicts a poorer prognosis in patients treated with ABVD or equivalent regimens. Blood 2002;100(12): e3935–3941.DOI: 10.1182/blood.V100.12.3935). Однако в ней не учитываются иммунофенотипические особенности опухолевых клеток и биологические маркеры, которые могли бы повысить точность данной модели.

Одной из причин, обуславливающих клональную пролиферацию клеток Ходжкина Березовского-Рид-Штенберга, является их способность уклоняться от иммунного надзора за счет экспрессии антиапоптотического белка B-клеточной лимфомы (BCL-2). Протеин относится к семейству внутриклеточных факторов, контролирующих внутренний путь апоптоза (Gamboa-Cedeño A.M., Díaz M., Cristaldo N. et al. Apoptotic regulator BCL-2 blockade as a potential therapy in classical Hodgkin lymphoma. Life Sci 2021;268:e118979. DOI: 10.1016/j.lfs.2020.118979).

Изучение белка программируемой клеточной гибели, известного как PD-1, и соответствующего ему лиганда (PD-L1) является перспективной задачей определения новых критериев эффективности терапии с применением препаратов моноклональных антител. Способность опухолевой популяции воздействовать на рецепторы иммунных контрольных точек обеспечивает их резистентность к цитотоксическому ответу (Al Hadidi SA, Lee HJ. Pembrolizumab for the treatment of Hodgkin Lymphoma. Expert Opin Biol Ther. 2020 Nov;20(11):1275-1282. doi: 10.1080/14712598.2020.1830056. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33006479).

Близким техническим решением к предполагаемому изобретению можно считать исследование PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток при колоректальном раке (Zhang MY, Yang YY, Wang XH, Li XF. [Expression of Bcl-2, PD-L1 and its clinical significance in colorectal cancer]. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2012 Nov;43(6):827-9, 859. Chinese. PMID: 23387206). Основным отличием аналога является то, что исследования проводились в гистологических срезах кишечника, при нозологии негемопоэтической природы и без расчета индекса доли указанных маркеров.

Способа морфометрической оценки прогноза течения нодулярного склероза классической лимфомы Ходжкина по индексу доли PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов не существует.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Техническим результатом изобретения является разработка способа прогнозирования течения нодулярного склероза лимфомы Ходжкина путем морфометрической оценки индекса доли положительных опухолевых клеток PD-L1 к BCL2 в лимфатических узлах.

Технический результат достигается тем, что после лимфаденэктомии в гистологических срезах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток по формулам: S₁=D₁/n x 100%, где S₁ – доля PD-L1-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, в %, D₁ – абсолютное количество PD-L1-позитивных опухолевых клеток, n – общее абсолютное количество опухолевых клеток, S₂=D₂/n x 100%, где S₂ – доля BCL2-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, в %, D₂ – абсолютное количество BCL2-позитивных опухолевых клеток, n – общее абсолютное количество клеток, определяют индекс доли ИД по формуле: ИД = (S₁ + S₂)/2, при значении ИД менее или равном 73% констатируют благоприятное течение болезни, а при ИД более 73% устанавливают неблагоприятное течение заболевания.

Осуществление изобретения

После лимфаденэктомии у больных нодулярным склерозом кЛХ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала по общепринятому способу. На срезах толщиной 3-5 мкм, приготовленных из парафиновых блоков лимфатических узлов, проводили гистологическое исследование. Для идентификации и визуализации PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток в исследуемом материале использовали ИГХ метод окрашивания. Иммунореактивность первичных антител PD-L1 (клон ZR3, «Cell Marque», США) и BCL2 (клон 124, «Dako», Дания) выявляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку реакции осуществляли по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку относительного числа PD-L1 и BCL2- положительных опухолевых клеток осуществляли с помощью светового микроскопа «Leica DM 1000» Германия, со встроенной фото-/видеокамерой и программным обеспечением анализа изображений ImageScope Color, версии М, с окулярами х10, при объективе х100. Исследования проводили в последовательно в 100 опухолевых клетках для каждого гистологического образца и антитела. Среднее относительное содержание PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток в лимфатическом узле вычисляли по формулам

S₁ = D₁ / n × 100 %,

где S₁ – доля PD-L1-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, %,

D₁ – абсолютное количество PD-L1-позитивных опухолевых клеток,

n – общее абсолютное количество опухолевых клеток;

S₂ = D₂ / n × 100%,

где S₂ – доля BCL2-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, %,

D₂ – абсолютное количество BCL2-позитивных опухолевых клеток,

n – общее абсолютное количество клеток.

Индекс доли (ИД) у каждого пациента определяли по формуле

ИД = (S₁ + S₂) / 2

Исследования выполнены на гистологических срезах лимфатических узлов от 33 пациентов с нодулярным склерозом кЛХ в возрасте от 20 до 73 лет (12– мужского пола и 21 – женского). С помощью ROC-анализа установлено пороговое значение индекса доли опухолевых клеток, экспрессирующих белки PD-L1 и BCL2, соответствующее 73%. Данный показатель позволил стратифицировать пациентов в группы с разным характером течения заболевания. У 15 обследованных зарегистрировано благоприятное течение кЛХ (ИД менее 73%), у 18 больных - неблагоприятное (ИД равно и более 73%).

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение нодулярного склероза кЛХ после лимфаденэктомии по индексу доли PD-L1 и BCL2-положительных опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов.

Пример 1

Больной Н., 35 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 02.08.2017 года. Диагноз при поступлении: кЛХ, нодулярный склероз. Клиническая характеристика: поражение шейных, паракавальных и парааортальных лимфатических узлов. Выполнена лимфаденэктомия шейного лимфоузла (02.06.2017 года), без осложнений. Проведено ИГХ исследование гистологических срезов шейного лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля PD-L1 и BCL2-позитивных опухолевых клеток (S₁ и S₂ соответственно) и рассчитан индекс доли (ИД) PD-L1 и BCL2-положительных опухолевых клеток. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁=38/100×100 %. S₁ равно 38%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂ = 21/100×100%. S₂ равно 21%. Индекс доли (ИД) составил: (38% + 21%)/2 = 29,5%.

Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа определено, что у больного нодулярным склерозом кЛХ благоприятный прогноз заболевания. В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Так, после лимфаденэктомии проведено 6 циклов химиотерапии по схеме ВЕАСОРР-14 (Блеомицин, Этопозид, Доксорубицин, Циклофосфамид, Винкристин, Прокарбозин, Преднизолон). Лечение окончено 18.04.2018 года. Достигнута ПЭТ-негативная ремиссия, которая сохраняется по настоящее время.

Пример 2

Больная К., 34 года, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в 09.11.2016 года. Диагноз при поступлении: ЛХ, нодулярный склероз. Клиническая характеристика: поражение шейных лимфоузлов, средостения, скелета, слабость, частые вирусные инфекции. Через 2 дня (11.11.2016г.) была выполнена лимфаденэктомия шейного лимфоузла, без осложнений. Проведено ИГХ исследование гистологических срезов шейного лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля PD-L1и BCL2-позитивных опухолевых клеток (S₁ и S₂ соответственно) и рассчитан индекс доли (ИД) PD-L1 и BCL2-положительных опухолевых клеток. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁=90/100×100%. S₁ равно 90%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂=94/100×100%. S₂ равно 94%. Индекс доли (ИД) составил: (90%+94%)/2=92%.

Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа определено, что у больной нодулярным склерозом ЛХ неблагоприятный прогноз заболевания. В ходе динамического наблюдения за пациенткой выявленные данные были подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Так, после лимфаденэктомии было проведено 4 цикла химиотерапии по схеме ВЕАСОРР-14 (Блеомицин, Этопозид, Доксирубицин, Циклофосфамид, Винкристин, Прокарбозин, Преднизолон). В связи с небольшой редукцией опухолевой массы назначено 2 курса второй линии терапии по схеме GDP (Гемцитабин, Дексаметазон, Карбоплатин). В связи с отсутствием ремиссии 22.05.2017 года была проведена аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. В настоящее время больная находится под динамическим наблюдением гематологов.

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по индексу доли PD-L1 и BCL2-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле прогнозировать течение нодулярного склероза кЛХ после лимфаденэктомии. При значении ИД менее или равном 73% констатируют благоприятное течение болезни, а при более 73% устанавливают неблагоприятное течение заболевания.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения нодулярного склероза кЛХ после лимфаденэктомии.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и патологической анатомии, и может быть использовано для прогнозирования течения нодулярного склероза лимфомы Ходжкина. Для этого после выполнения лимфаденэктомии в гистологических срезах проводят иммуногистохимическое окрашивание. Морфометрически подсчитывают относительное количество PD-L1- и BCL2-позитивных опухолевых клеток по разработанным математическим формулам. Далее определяют индекс доли ИД по математической формуле. При значении ИД менее или равном 73% прогнозируют благоприятное течение болезни. При значении ИД более 73% прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. Изобретение позволяет прогнозировать течение нодулярного склероза лимфомы Ходжкина у пациентов после выполнения лимфаденэктомии. 2 пр.

Способ прогнозирования течения нодулярного склероза лимфомы Ходжкина путем морфометрической оценки индекса доли положительных опухолевых клеток PD-L1 к BCL2 в лимфатических узлах, заключающийся в том, что после лимфаденэктомии в гистологических срезах проводят иммуногистохимическое окрашивание и морфометрически подсчитывают относительное количество PD-L1- и BCL2-позитивных опухолевых клеток по формулам: S₁=D₁/n×100%, где S₁ – доля PD-L1-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, %, D₁ – абсолютное количество PD-L1-позитивных опухолевых клеток, n – общее абсолютное количество опухолевых клеток, S₂=D₂/n×100%, где S₂ – доля BCL2-положительных опухолевых клеток в лимфатическом узле, %, D₂ – абсолютное количество BCL2-позитивных опухолевых клеток, n – общее абсолютное количество клеток, определяют индекс доли ИД по формуле: ИД=(S₁+S₂)/2, при значении ИД менее или равном 73% прогнозируют благоприятное течение болезни, а при ИД более 73% прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.