Способы оценки защитной активности и иммуногенности коклюшных вакцин у человека, применение живой коклюшной рекомбинантной вакцины ГамЖВК Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 A61K39/10 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способов оценки защитной активности и иммуногенности коклюшных вакцин у человека.

Предшествующий уровень техники

Известны различные способы оценки защитной активности коклюшных вакцин.

В публикации Develop. in Biol. Stand. (1996, v. 86. p. 271-281) предлагают оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню антител к основным протективным антигенам - коклюшному токсину (КТ) и филаментозному гемагглютинину (ФГА) В. pertussis на 4-5 неделе после введения их экспериментальным животным.

Известен способ определения защитной активности коклюшных вакцин (патент РФ 2623314), основанный на определении ЛД₅₀ при интраназальном заражения мышей вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis, обеспечивающий оценку защитной активности коклюшных вакцин в процессе их разработки. Способ предусматривает интраназальную иммунизацию мышей коклюшными вакцинами с последующим заражением вирулентными бактериями В. pertussis, В. bronchiseptica, В. parapertussis и отличается тем, что осуществляют интраназальное заражение вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis в летальных дозах и определяют выживаемость вакцинированных животных. Метод позволяет определить защитную активность вакцин на этапе доклинического исследования, но не обеспечивает адекватной оценки защитной активности у человека.

В патенте РФ 2231793 предложен способ оценки защитной активности коклюшных вакцин по количественному содержанию в них коклюшного токсина. Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин количества содержащегося в них коклюшного токсина (КТ), обусловлено тем, что КТ является основным протективным антигеном, обеспечивающей активную защиту организма против коклюшной инфекции ("Коклюш" ААР 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p. 439; Wendy A. Keitell M.D. "Новые вакцины и новые вакцинные технологии" Infect. Dis. Clin of Noth America. 1999, v. 13, №1, p. 83-84). В предлагаемом способе оценки иммуногенности коклюшные вакцины, содержащие низкое количество КТ, например, 8, 40, 81 и 10, 20, 45 мкг/мл, защищали всего 20-40% животных, взятых в опыт, а коклюшные вакцины, содержащие 220 и 241 мкг/мл, защищали от 90% до 95% экспериментальных животных.

Известен способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин по очищению верхних дыхательных путей лабораторных мышей от вирулентных бактерий В. pertussis на 7-10 день после аэрозольного заражения (Mills КН. et al., Inf. and Immun. 1998. vol. 66, №2. p. 594-602).

Syukuda Y. с соавт. ("Тест аэрозольного инфицирования для оценки иммуногенности коклюшных вакцин". Tokai J. Exp. Clin. Med. 1988, vol. 13, Suppl. 2. p. 71-72) предложили оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню специфических антител и количеству бактерий в легких после аэрозольного заражения вакцинированных мышей вирулентным бактериями B. pertussis.

Модель интраназального заражения мышей была использована для оценки защитной активности цельноклеточных коклюшных вакцин Quinvaxem, Easyfive and Pentavac (Anne Marie Queenan et. al. The mouse intranasal challenge model for potency testing of whole-cell pertussis vaccines. Expert Review of Vaccines. 2014, Vol. 13, No. 10, p. 1265-1270). Эффективность вакцин определялась на основании определения КОЕ в легких через пять дней после интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентным штаммом Bordetella pertussis.

В публикации WO 2007104451 описан метод оценки эффективности живой вакцины, содержащей аттенуированные бактерии Bordetella pertussis BPZE1, и бесклеточной коклюшной вакцины aPv с последующим интраназальным заражением вакцинированных мышей вирулентным штаммом В. pertussis. После чего через неделю удаляли легкие и определяли КОЕ. Вакцинация BPZE1 в отличии от aPV обеспечивает полную защиту от интраназальной инфекции вирулентным штаммом В. pertussis (наблюдается полный бактериальный клиренс в легких спустя неделю после инфекции и статистически значимое уменьшение бактериальной загрузки через 3 часа после инфекции. При вакцинации aPV отмечено присутствие бактерий В. pertussis в легких животных спустя неделю после инфекции.

В настоящее время наиболее широко используемым для контроля качества коклюшных вакцин в производстве является метод, основанный на определении ЛД₅₀ при внутримозговом введении иммунизированным мышам тест-штамма бактерий В. pertussis.

Метод оценки защитных свойств коклюшных вакцин, описанный в "Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий" (М., 1987, стр. 18-28 заключается в следующем: белых беспородных мышей массой 10-12 г внутрибрюшинно иммунизируют испытуемой коклюшной вакциной в дозе, составляющей прививочную дозу для человека. Через 2 недели проводят внутримозговое заражение экспериментальных животных нейротропным штаммом бактерий B. pertussis 18323, в дозах, вызывающих 100%. гибель интактных животных. Доза вирулентного штамма должна составлять не менее 100 ЛД50. Для вычисления ЛД50 параллельно с основным опытом заражают интактных мышей используемой вирулентной культурой четырьмя дозами с пятикратным шагом. После заражения наблюдение за экспериментальными животными проводят в течение 14-17 суток, ежедневно учитывая гибель и паралич мышей. По окончании опыта высчитывают процент выживших животных. Эффективными считаются вакцины, защищающие не менее 70% животных, взятых в опыт. Главным недостатком метода является иммунизация и заражение животных не естественным для коклюша путем. Внутримозговое заражение не может моделировать патогенез коклюша и, следовательно, корректно характеризовать защитную активность вакцины. Этому способу также свойственны такие недостатки, как длительность срока исследования, значительное количество экспериментальных животных и зависимость результата от качества и линии животных..

Мышиная модель является наиболее широко используемой методикой лабораторной оценки защитной активности коклюшных вакцин, но адекватность ее применения для оценки защитной активности у человека, в некоторой степени, продемонстрирована только для летальной модели с использованием штамм 18323. Перечисленные тесты используются только для первичной характеристики вакцин на этапе разработки и доклинической проверки и на этапе контроля качества препарата при его производстве.

Наряду с мышиной в качестве экспериментальной модели для проведения исследований индуцированого вакцинами имунитета используются приматы.

Сравнительные исследования цельноклеточных и бесклеточных вакцин (Comparison of Three Whole-Cell Pertussis Vaccines in the Baboon. Clinical AND VACCINE IMMUNOLOGY. 2016, v. 23, 1) проводили на модели бабуинов при последующем инфицировании вирулентными Bordetella pertussis. Не было обнаружено статистических различий в количестве бактерий, выделенных из носоглотки, между вакцинированными бесклеточными вакцинами и невакцинириванными животными. Цельноклеточные вакцины приводили к уменьшению количества бактерий в носоглотке при последующем инфицировании вирулентными Bordetella pertussis

В результате изучения динамики накопления и механизмов образования персистирующих форм бактерий В. pertussis у низших обезьян с помощью метода ПЦР в реальном времени установлено, что после однократного интраназального инфицирования обезьян бактерии В. pertussis переживали в верхних дыхательных путях более трех месяцев, при повторном инфицировании сроки сократились до 14-28 дней (Каратаев Г.И., Синяшина Л.Н, Медкова А.Ю., и др. Инсерционная инактивация оперона вирулентности в популяции персистирующих бактерий Bordetella pertussis. Генетика. 2016. Т. 52, №4, ст. 422-430)

Доклинические исследования безопасности, иммуногенности и защитной активности аттенуированных бактерий Bordetella pertussis на экспериментальной модели макаки резус показали, что интраназальная иммунизация обезьян макака резус аттенуированными и вирулентными бактериями В. pertussis приводит при повторной инфекции к подавлениию размножения бактерий, ускорению их элиминации из носоглотки животных и развитию гуморального иммунного ответа (Синяшина, Л.Н. Е.Г. Сёмин, А.Ю. Медкова, и др. Доклинические исследования защитной активности препарата кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения. ЖМЭИ 2019; (3):60-69. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-3-60-69).

Однако, несмотря на то, что согласно общим представлениям, обезьяны являются более адекватной для человека экспериментальной моделью, полученные результаты не могут быть экстраполированы на человека без проведения специальных исследований. В любом случаи, тестирование защитной активности вакцин на экспериментальной модели обезьян, является лишь дополнительным тестом доклинического исследования вакцины, требующим обязательного клинического изучения защитной активности вакцины на добровольцах.

Таким образом, простых и надежных способов оценки защитной активности коклюшных вакцин, выпускаемых в массовую вакцинопрофилактику, не существует даже на этапе лабораторного исследования вакцины.

Методы, позволяющие определить защитную активность коклюшных вакцин у человека в ходе клинических испытаний в настоящее время не разработаны. На этапе клинических исследований оценивают, как правило только параметры иммуногенности вакцины, основанные на определении количества специфических противококлюшных антител в сыворотке крови добровольцев и реакции клеточного иммунитета. Окончательное решение о регистрации вакцины принимают на основании многоцентровых исследований, включающих большое число участников. Целью таких исследований является оценка иммуногенности и безопасности препарата. Оценку эффективности вакцины проводят на основании результатов широких эпидемиологических пострегистрационных исследований. Учитывая, что многоцентровое исследование, несмотря на большой объем включенных в него добровольцев и высокую стоимость, как правило, призвано подтвердить безопасность и иммуногенность препарата и не дает представления о реальной эффективности вакцины, возникает необходимость в разработке метода, способного, наряду с иммуногенностью, охарактеризовать и защитную активность вакцины для добровольцев. Оценка эффективности препарата на этапах клинического исследования, является актуальной задачей современной вакцинопрофилактики, позволяющей удешевить клинические исследования и получить объективную информацию о реальной защитной активности кандидатной коклюшной вакцины уже на этапе многоцентрового исследования.

Краткое описание изобретения.

Впервые разработан способ оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение скорости выведения бактерий у субъекта, вакцинированного кандидатной вакциной, после интраназального ведения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша.

В качестве аттенуированных коклюшных бактерий, используемых для интраназального введения после вакцинации добровольцев кандидатной вакциной, использовали живую коклюшную рекомбинантную вакцину интраназального применения ГамЖВК, разработанную в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) (Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю., Каратаев Г.И. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. ЖМЭИ. 2018; 4; 33-41).

Указанная вакцина использовалась также в качестве модели кандидатной вакцины, прошедшей две фазы клинических исследований и получившая разрешение на проведение многоцентровых исследоваий (Медкова А.Ю., Лиджиева А.А., Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Сюндюкова Р.А., Дьяков И.Н., Колобухина Л.В., Кружкова И.С., Меркулова Л.Н., Русанова М.Г., Антипят Н.А., Сметанина С.В., Каратаев Г.И. Клинические исследования безопасности и переносимости живой вакцины интраназального применения для профилактики коклюша. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021; 10(1):114-119. https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-1-114-119

Статистически достоверное уменьшение времени выведения аттенуированных бактерий в носо/ротоглотке иммунизированнных (вакцинированных) добровольцев, в сравнении с контрольной не иммунизированной группой (плацебо) демонстрирует защитную эффективность кандидатной вакцины.

Другой аспект изобретения относится к способу оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение роста специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах после введения аттенуированных бактерий, следующего за вакцинацией кандидатной вакциной

Вакцинация и введение после вакцинации аттенуированных бактерий индуцируют выраженный рост специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах, увеличивающийся после введения аттенуированных бактерий. Подъем уровня антител после повторной вакцинации более выражен и регистрируется в более ранние сроки, чем после первой, подтверждает иммуногенность кандидатной вакцины.

Предлагаемый метод оценки защитной активности кандидатных коклюшных вакцин впервые позволяет, в отличие от существующих методов, оценить защитную активность коклюшных вакцин на этапе доклинического исследования и сделать более достоверными результаты оценки их эффективности при эпидемиологическом исследовании.

Разработанная впервые авторами модель оценки сроков выведения аттенуированных коклюшных бактерий после его вакцинации кандидатной вакциной, адекватно отражает защитную, противобактерийную активность кандидатной вакцины, измеренную в ходе клинических исследований на добровольцах и может рассматриваться как наиболее перспективная для определения защитной активности коклюшных вакцин на этапе регистрационных и пострегистрационных исследований.

Разработанный способ определения иммуногенности кандидатной вакцины, основанный на ускорении выработки и увеличении уровня антител, индуцированных введением аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам, в сравнении с контрольной группой не вакцинированных, позволяет избежать использования вакцин сравнения, особенно в случае отсутствия адекватной для сравнения вакцины. Метод имитирует природную инфекцию добровольцев естественным для коклюша капельным способом и позволяет оценить ее иммуногенность и противобактерийную активность в условиях близких к реальной коклюшной инфекции.

Краткое описание Фигур.

Фиг. 1 представляет график, отображающий значения числа молекул ДНК В. pertussis (ГЭ) в динамике наблюдения. Представленные данные демонстрируют более раннее выведение аттенуированных бактерий из рото-\носоглотки после повторного введения препарата у большинства вакцинированных добровольцев.

Фиг. 2. Абсолютные значения IgG в крови иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинации

Фиг. 3. Абсолютные значения IgG в крови добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введения

Фиг. 4. Абсолютные значения IgA в крови иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинации

Фиг. 5. Абсолютные значения IgA в крови добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введения.

Фиг. 6. Абсолютные значения IgA в аспиратах иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинации

Фи. 7. Абсолютные значения IgA в аспиратах добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введения

Фиг. 8. Титр (число разведения сывороток) в реакции агглютинации у иммунизированных добровольцев.

Фиг. 9. Титр (число разведения сывороток) в реакции агглютинации в группе плацебо.

Фиг. 10. Процент добровольцев, достигших «+++» в реакции агглютинации сывороткой в разведении более 1:80 на различные сроки после введений вакцины

Подробное описание изобретения

Впервые предложен способ оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение скорости выведения бактерий у субъекта, вакцинированного кандидатной вакциной, после интраназальной инокуляции аттенуированных коклюшных бактерий.

Разработанный способ впервые позволяет оценить эффективность кандидатной вакцины на стадии, предшествующей эпидемиологическому исследованию и сделать более достоверными результаты последнего.

Заявленный способ определения защитной активности относится к оценке бактериальной нагрузки в рото/носоглотке добровольцев в динамике после интраназального введения кандидатной вакцины и последующего введения аттенуированных бактерий здоровым добровольцам.

В другом аспекте изобретения относится к способу оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека, предусматривающему определение роста специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах после введения аттенуированных бактерий, следующего за вакцинацией кандидатной вакциной.

Оценка параметров гуморального иммунного ответа после однократного и двукратного интраназального введения препаратов здоровым добровольцам в сравнении с плацебо путем определения уровня IgG и IgA в сыворотке крови и назофарингеальных\ носоглоточных аспиратах добровольцев позволяет определить иммуногенность кадидатной вакцины, и также подтверждает эффективность заявленного способа определения защитной активности по оценке бактериальной нагрузки в рото/носоглотке добровольцев в динамике после интраназального введения кандидатной вакцины и последующего введения аттенуированных бактерий здоровым добровольцам.

Определение титров агглютинации суспензии бактерий B. pertussis сывороткой крови добровольцев после однократного и двукратного интраназального введения препарата здоровым добровольцам в сравнении с плацебо также подтверждает пригодность заявленного способа для определения эффективности кандидатной вакцины. Оценка эффективности противококлюшных вакцин изучена на модели ГамЖВК при использовании ее в качестве как кандидатной вакцины, так и тест-препарата. Бактериальную нагрузку тестировали в динамике с помощью ПЦР РВ. Продемонстрирована защита вакцинированных добровольцев от контакта с инфекцией, проявляющаяся в более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев после введения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша. Этот результат, с одной стороны подтверждает защитную активность ГамЖВК, с другой - эффективность использования, входящих в ее состав аттенуированных бактерий B. pertussis, в качестве тест-бактерий для определения защитной активности кандидатных вакцин.

Статистически достоверное снижение бактериальной нагрузки в аспиратах после интраназального введения тест-бактерий иммунизированным добровольцам в сравнении с не иммунизированными продемонстритовано в Пример 1.

ДНК аттенуированных бактерий B. pertussis зарегистрирована через 1 час и через 24 часа после первой и повторной инокуляции в образцах от всех добровольцев, получивших вакцину.

Динамика изменения абсолютного числа ГЭ в рото/носоглотке добровольцев продемонстрирована в табл. 1а и 1б и Фиг. 1. В табл. 2 представлены данные достоверности различий числа ГЭ между группами вакцинированных и плацебо.

Представленные в таблице 1а и 1б и Фиг. 1 данные показывают, что при интраназальном введении после повторной инокуляции бактерий уже на 7-е сутки исчезают различия по количеству ГЭ между вакцинированными добровольцами и группой плацебо, тогда как после первой вакцинации содержание ГЭ B. pertussis достоверно выше у вакцинированных в сравнении с плацебо вплоть до 14 суток. Этот результат свидетельствует об ускоренной элиминации бактерий B. pertussis при введении препарата вакцинированным добровольцам.

Способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека предусматривает определение иммуноглобулинов IgA и IgG у субъектов, вакцинированных кандидатной вакциной, после интраназального ведения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша. Интраназальная вакцинация индуцирует дозозависимое формирование специфических иммуноглобулинов IgG и IgA в крови добровольцев, характеризующее развитие гуморального поствакцинального ответа (пример 2). Повторное введение бактерий индуцирует бустерный рост специфических сывороточных иммуноглобулинов. Схожий рост специфических IgA наблюдается в назофарингеальных и ротоглоточных аспиратах.

Значения IgG у добровольцев, получивших плацебо или аттенуированные бактерии, представлены на Фиг. 2. Данные достоверности различий прироста абсолютных значений IgG у добровольцев, получивших плацебо или аттенуированные бактерии, представлены в табл. 3.

На Фиг. 2 виден выраженный рост уровня IgG в крови добровольцев после вакцинации. Значения IgG в сыворотке крови добровольцев, получивших плацебо, остаются неизменными на протяжении всего срока наблюдения (Фиг. 3). Таблица 2 иллюстрирует, что уже на 7 сутки после вакцинации у добровольцев регистрируется достоверный рост в сравнении с плацебо значений IgG. Рост IgG продолжается после повторного введения препарата.

Приведенные результаты свидетельствуют о выраженной иммуногенности тестируемого препарата, а их сравнение с результатами тестирования ДНК возбудителя в носоглотке подтверждает защитный эффект исследуемой вакцины.

Результаты исследования уровня IgA в сыворотке крови, приведенные на Фиг. 4, 5 и в таблице 3, демонстрируют, что достоверный рост сывороточных IgA регистрируется на 14 сутки после вакцинации и продолжается после последующего введения аттенуированных бактерий. После повторного введения бактерий, как и в случае с IgG, наблюдается бустерный эффект, проявляющийся в росте сывороточных IgA уже на 7 сутки после повторного введения препарата и более чем 10 кратном увеличении значения IgA в сравнении с довакцинным уровнем.

Анализ гуморального ответа добровольцев подтвержает, что вакцинация и последующее введение аттенуированных бактерий индуцируют выраженный рост специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев, увеличивающийся после повторной вакцинации. Подъем уровня антител после повторного введения бактерий добровольцам регистрируется в более ранние сроки, что подтверждает наличие, так называемого бустерного эффекта, свидетельствующего об иммуногенности кандидатной вакцины и дополнительно подтверждает защитный эффект тестируемой кандидатной вакцины.

Также, IgA определяли отдельно в супернатантах, полученных после смыва назофарингеальных и ротоглоточных зондов (аспиратах). Для анализа использовали среднее, либо максимальное из двух измеренных значений IgA.

Из Фигур 6 и 7 видно, что максимальный уровень секреторных антител IgA достигается на 28 сутки после вакцинации и последующего введения бактерий. Достоверный в сравнении с плацебо прирост значений секреторных IgA наблюдается на 14 день после первого и второго введения аттенуированных бактерий (таблица 4).

Таким образом, авторами установлено, что оценка иммуногенности кандидатных вакцин может быть определена путем тестирования роста специфических секреторных иммуноглобулинов в носо-/ротоглотке здоровых вакцинированных добровольцев, после интраназального введения аттенуированных бактерий, сопровождающгося дальнейшим ростом количества секреторных IgA.

Определение титра агглютинации сыворотки крови вакцинированных добровольцев и плацебо культурой вирулентных бактерий B. pertussis описано в примере 3.

Результаты изменения титра агглютинации в динамике для указанных групп добровольцев и их сравнительный анализ представлены на Фигурах 8-10

Анализ титров агглютинации сыворотки добровольцев использовался для дополнительной характеристики гуморального ответа на вакцинацию кандидатной вакциной.

Представленные на Фиг. 8, 9 и в табл. 5 результаты демонстрируют нарастание титров агглютинации в РА после вакцинации и последующего введения аттенуированных бактерий и подтверждают иммуногенность кандидатной вакцины. Из Фиг. 10 следует, что нарастание титров агглютинации выше после последующего ведения аттениурованных бактерий и концу срока наблюдения достигается не менее чем у 94% добровольцев.

Анализ параметров гуморального иммунного ответа, таких как специфических антител IgG и IgA в сыворотке крови, секреторных специфических противококлюшных антител IgA в рото-/носоглоточных аспиратах, показал статистически достоверный рост количества противококлюшных иммуноглобулинов у добровольцев после вакцинации и подтвердил защитный потенциал и иммунгенность вакцины.

Таким образом, интраназальное введение добровольцу живых аттенуированных бактерий B. pertussis, предпочтительно в составе препарата ГамЖВК, обеспечивает оценку защитной эффективности кандидатной вакцины, основанную на более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки иммунизированных добровольцев в сравнении с контрольными. Более ранняя элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев после введения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша иммунизированным добровольцам, коррелирует с ускоренной выработкой специфических иммуноглобулинов IgG и IgA в сыворотке крови и IgA в назофарингеальных/ротоглоточных аспиратах, и дополнительно свидетельствует об уммуногенности и защитном потенциале кандидатной вакцины.

Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Примеры.

Лекарственная форма: ГамЖВК - лиофилизат для приготовления суспензии в растворе натрия хлорида 0,9% для интраназального введения.

Способ применения и дозы:

В исследовании участвовали 49 добровольцев, включая 10 человек получивших плацебо. Добровольцам вводили исследуемый препарат/плацебо интраназально, капельным методом дважды с интервалом 2 месяца, оба раза в дозе (4-5)×10⁹ КОЕ.

Спустя 60±2 дня после первой инокуляции препарата/плацебо добровольцам повторно вводили ту же дозу препарата/плацебо

Исследования проводили на здоровых добровольцах, в крови которых не было выявлено IgM (IgM<14 U/мл), а значения IgG≤45 U/мл.

Интраназальная двукратная вакцинация добровольцев препаратом ГамЖВК в дозе 4-5×10⁹ КОЕ показала хорошую переносимость и благоприятный профиль безопасности (Синяшина Л.Н., Сёмин Е.Г., Медкова А.Ю. и др. Доклиническое исследование токсичности и безопасности кандидатной живой коклюшной вакцины интраназального применения. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2018; 17(6))

Плацебо - стерильный лиофилизат стабилизатора для последующего растворения в 0,9% натрия хлорида для инъекций. 10% раствор сахарозы и 1% раствор желатины для стабилизации аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS в процессе высушивания и хранения. После высушивания суспензии бактерий и стабилизатора - таблеткообразная масса белого или светло-желтого цвета во флаконе для приготовления суспензии в 0,9% растворе натрия хлорида. Во флаконе содержится 0,1 г сахарозы и 0,01 г желатины.

Статистическую обработку данных по эффективности иммунного ответа на введение ГамЖВК проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Нормальность распределения оценивали с помощью KS теста. Для статистической обработки и оценки достоверности различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. При оценке гуморального ответа определяли достоверность различий измеряемых параметров в контрольных точках с их значениями в нулевой точке (до вакцинации) среди добровольцев, получивших плацебо вакцину разными методами, после первой и второй вакцинации. Для оценки достоверности различий между сравниваемыми группами для каждой контрольной точки проводили групповой анализ с использованием множественного t-теста

Пример 1. Определение скорости элиминации аттенуированных бактерий в носоглотке добровольцев после одно- и двукратного интраназального применения препарата ГамЖВК.

Назофарингеальные/ротоглоточные мазки исследовались для определения бактерий методом посева и ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) (Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; №4:19-22.). Аспират из ротоглотки забирали ротоглоточным тампоном на деревянной палочке, а аспират из носоглотки гибким носоглоточным зондом.

Материал с зондов смывали в 0,5 мл физиологического раствора, смывы тщательно суспендировали с помощью пипетки и вортекса, центрифугировали 10 минут на микроцентрифуге типа Эпендоф при 7000 об/мин. Осадок использовали для выделения ДНК и ПЦР анализа, а супернатанты для определения содержания секреторных IgA.

Клинический материал забирают натощак, до применения полоскания или других видов исследования при хорошем освещении. Взятие материала проводится заднеглоточным тампоном со слизистой задней стенки ротоглотки и назофарингеальным зондом со слизистой носоглотки. Все процедуры выполняли в соответствии с СП3.1.2.3162-14 и рекомендацией ВОЗ [36].

Выявление бактерий B. pertussis методом высева на питательную среду.

Материал заднеглоточного мазка, сразу после взятия от добровольца, переносили на среду КУА с кровью методом штрихования. Бактерий B. pertussis культивировали на твердой питательной среде КУА или КУА с добавлением 15% дефибринированной крови барана в течение 3-5 суток (МУК 4.2.2317-08). Для посева использовали готовую среду КУА производства ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Дефибринированная кровь барана получена из ООО «ЭКОлаб М».

Выросшие колонии тестировали с помощью ПЦР, визуально на наличие зон гемолиза и соответствие морфологии колоний бактерий B. pertussis.

Количественное определение ДНК B. pertussis в аспиратах методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ).

Для молекулярно биологического анализа использовали ДНК, выделенную из бактерий и смывов заднеглоточных мазков или назофарингеальных зондов (аспиратов). Осадки препаратов после центрифугирования обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы «Promega» США [Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; №4:19-22.]. Для определения количества геном-эквивалентов ДНК B. pertussis в аспиратах использована разработанная и валидированная авторами тест-система ПЦР РВ [Нестерова Ю.В., Медкова А.Ю., Бабаченко И. Проблема персистенции Bordetella pertussis в условиях массовой вакцинопрофилактики. Материалы всероссийского ежегодного конгресса «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика». Журнал инфектологии. 2017; Т9, №4:85].

ДНК аттенуированных бактерий B. pertussis зарегистрирована через 1 час и через 24 часа после первой и повторной инокуляции в образцах от всех добровольцев, получивших аттенуированные бактерии. Во всех случаях, бактерии обнаруживали и при посевах материала аспиратов.

Для дальнейшего анализа в качестве числа ГЭ использовали среднее из значений, определенных в аспирате из носа- и ротоглотки.

Результаты исследования представлены на Фиг. 1 и в табл. 1а, б. Фиг. 1 представляет динамику изменения абсолютного числа ГЭ после однократного и двукратного интраназального введения препарата. Результаты статистической обработки данных представлены в табл. 2. В таблице 1 представлены уровни достоверности отличия значений числа ГЭ, обнаруженных у иммунизированных добровольцев и добровольцев, получивших плацебо. Из данных, представленных на Фиг. 1 и в таблицах 1а и 1б следует, что после повторной вакцинации уже на 7-е сутки достоверные различия по количеству ГЭ между вакцинированными добровольцами и группой плацебо отсутствуют, тогда как после первой вакцинации содержание ГЭ B. pertussis достоверно выше, чем в плацебо вплоть до 14 суток. Таким образом, достоверным в сравнении с плацебо, можно считать элиминацию аттенуированных бактерий на 2-7 сутки после повторной вакцинации в сравнении с 14-28 суками после первой вакцинации. Микробиологическим методом бактериальные колонии зарегистрированы только спустя 1 час, 7 и 14 дней после первого введения ГамЖВК и через 1 час после повторного введения.

Эти результаты доказывают более раннее выведение аттенуированных бактерий после повторного интраназального введения.

Пример 2. Параметры гуморального иммунного ответа после однократного и двукратного интраназального введения препарата здоровым в сравнении с плацебо.

Оценку иммуногенности проводили в результате измерения количества IgG и IgA в сыворотке крови, IgA в назофарингеальных/ротоглоточных аспиратах и титра агглютинации бактерий возбудителя коклюша сыворотки крови иммунизированных и контрольных добровольцев (РА).

Количество специфических антител к возбудителю коклюша определяли с помощью ИФА в соответствии с инструкцией производителя тест-систем RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037), RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426),

IgA- и IgG-антитела к антигенам В. pertussis определяли в сыворотке крови добровольцев методом ELISA с использованием коммерческих наборов RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426), RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 13316), RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037) соответственно. Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Определение уровня специфических антител IgG и IgA (в сыворотке крови и рото/назафарингеальных секретах) проводили до приема препарата, на 8, 15, 29, 60 дни исследования после первого и повторного введения препарата.

В те же сроки определяли антитела IgA в смывах ротоглоточных и назофарингеальных мазков с использованием коммерческой тест-системы RIDASCREEN® Bordetella IgA, предназначенной для определения IgA в сыворотке крови. Определение проводили в соответствии с инструкциями производителя с одним изменением. Смывы для проведения реакции и определения оптической плотности (ОП) разводили в 2 раза.

На Фиг. 2, 3 виден выраженный рост уровня IgG в крови добровольцев после вакцинации. Более чем двукратное увеличение IgG регистрируется на 14 сутки. К 28 дню, IgG возрастает примерно в 3 раза. Рост уровня IgG продолжается во все последующие сроки и достигает максимума на 74 сутки (на 14 сутки после повторного введения препарата).

После повторной введения препарата достоверный рост IgG регистрируется уже на 7 и увеличивается до значений выше 4-х крат к 14 суткам, тогда как после первого введения препарата достоверный рост регистрируется только на 14 сутки. Приведенные результаты свидетельствуют о выраженном бустерном эффекте повторной вакцинации и коррелируют с выявленной более ранней элиминацией бактерий после их повторного введения. Значения IgG в сыворотке крови добровольцев, получивших плацебо, остаются неизменными на протяжении всего срока наблюдения. Данные таблицы 3 подтверждают вывод графического анализа результатов и демонстрируют, что достоверный рост значений IgG в сыворотке крови после интраназального введения препарата в сравнении с плацебо регистрируется уже на 7 сутки после вакцинации.

Представленные результаты показывают достоверный рост уровня IgG после первой и повторной вакцинации. Максимальный эффект достигается после повторного введения аттенуированных бактерий.

Уровень IgA оценивали с использованием тех же подходов, что и уровень IgG. Результаты исследования приведены на Фиг. 4, 5 и в таблице 4. Из полученных данных видно, что на 14-е сутки после вакцинации отмечается достоверное увеличение уровня специфических антител в сыворотке добровольцев. После ревакцинации, как и в случае с IgG наблюдается бустерный эффект, проявляющийся в росте IgA уже на 7 сутки после повторного введения препарата и более чем 10 кратном увеличении значения IgA в сравнении с довакцинным уровнем.

Таким образом, авторами отмечено увеличение IgA гуморального иммунного ответа после первого интраназального введения препарата здоровым добровольцам и его усиление при повторном введении препарата (бустерный эффект).

Для определения IgA в аспиратах использовали сухие назофарингеальные и ротоглоточные зонд, как описано в разделе "Материалы и методы". Материал с зондов смывали в 0,5 мл физиологического раствора, смывы тщательно суспендировали с помощью пипетки и вортекса, центрифугировали 10 минут на микроцентрифуге типа Эпендоф при 7000 об/мин. Осадок использовали для выделения ДНК и ПЦР анализа, а супернатанты для определения содержания секреторных IgA.

Для определения секреторных IgA использовали ту же тест систему, что и для определения IgA в сыворотке крови - RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 14210). Определение проводили в соответствии с инструкциями производителя с одним изменением. Опытным путем было подобрано разведение смывов 1/2 раза, тогда как для сывороток рекомендуется 1/100. Поскольку указанные наборы не имеют калибровочных образцов, для количественной оценки содержания IgA в смывах полученный результат делили на 50 (что соответствует 50-картно меньшему разведению образца в сравнении с классической постановкой). Отсутствие калибровки, стандартных образцов и положительных контролей, с нашей точки зрения, позволяет использовать коммерческие наборы только для регистрации изменения количества секреторных IgA в динамике, а не их абсолютных значений.

На первом этапе IgA определяли отдельно в супернатантах, полученных после смыва назофарингеальных и ротоглоточных зондов. Для анализа использовали среднее, либо максимальное из двух измеренных значений IgA. Значительной разницы в результатах при использовании того или иного выбора выявлено не было, однако достоверность отличий медиан IgA некоторых группах сравнения оказалась выше при использовании максимального из двух измеренных значения IgA. Выбор максимальных значений представляется логичным, так как нас интересует возможность максимального сбора секрета от каждого добровольца, независимо от того как он собран. По этой причине представленный ниже анализ включает максимальный результаты измерения, полученный в одном из двух собранных аспиратов.

На Фиг. 6, 7 представлены результаты анализа секреторных антител IgA в смывах. Достоверность различия медиан IgA представлены в таблице 5.

Из приведенных Фигур видно, что максимальный уровень секреторных антител IgA достигается при интраназальном введении препарата ГамЖВК на 28 сутки после первой и повторной вакцинации. Достоверные отличия в приросте содержания секреторных антител у вакцинированных в сравнении с плацебо наблюдаются, начиная с 7 дня после первого и повторного введения аттенуированных бактерий.

Таким образом, авторами установлено, что интраназальное введение кандидатной вакцины добровольцам приводит к росту специфических секреторных иммуноглобулинов в носо-/ротоглотке здоровых добровольцев. Последующее введение аттенуированных тест-бактерий сопровождается дальнейшим ростом количества секреторных IgA. Наблюдающийся бустерный эффект свидетельствует об иммуногенности тестируемой кандидатной вакцины

Пример 3. Изучение динамики изменения титра аглютинации сывороток крови добровольцев со временем после первой и второй вакцинации.

Определение титров агглютинации сыворотки крови добровольцев суспензии бактерий возбудителя коклюша (РА): до приема препарата, на 8, 15, 29, 60 дни исследования после первого и повторного введения препарата

Получение сыворотки крови

Кровь у добровольцев забирали в вакуумные пробирки Vacuette с активатором свертывания крови (красная крышка). Пробирки центрифугировали 20 мин при 300g для уплотнения сгустка. Затем сыворотку крови отбирали по аликвотам в отдельные пробирки Eppendorf объемов 1,5 мл. Для определения антител в одну из пробирок добавляли 0,1% NaN₃ для предотвращения бактериального пророста. Остальные аликвоты были заморожены. Для анализа в ELISA использовали незамороженные аликвоты сыворотки крови.

Агглютинацию бактерий В. pertussis сывороткой крови определяли с помощью тест-системы «Диагностикум коклюшный жидкий» производства БИОМЕД им. Мечникова (Россия).

Сыворотку разводили в 20, 40, 80, 160 раз, соответственно с кратностью равной 1 (:20), 2 (:40), 3 (:80) и 4 (:160). Положительным значением считалась агглютинация бактериальной суспензии, достигающая +++ в соответствии с рекомендациями производителя

Динамика изменения титров агглютинации после первой и повторной вакцинаций представлена на Фиг. 8-10. Таблица 6 демонстрирует, что достоверные различия с плацебо в титре сыворотки в реакции агглютинации регистрируются, начиная с 7-х суток.

Достоверные различия с плацебо в титре сыворотки в реакции агглютинации регистрируются, начиная с 7-х суток.

Рост числа добровольцев, сыворотка крови которых в каждой контрольной точке способна к агглютинации в разведениях больших, чем 1:80, представлена на Фиг. 10.

Представленные результаты демонстрируют иммуногенность кандидатной вакцины при интраназальном введении добровольцам, проявляющуюся в индуцированном росте титров агглютинации сывороткой, титры агглютинации более 1:80 достигаются после повторного введения аттенуированных бактерий. При интраназальном способе вакцинации максимальное число добровольцев имеющих агглютинацию на +++ достигается к концу срока наблюдения у 94%.

Таким образом, согласно изобретению, при анализе параметров гуморального иммунного ответа: специфических антител IgG и IgA в сыворотке крови, титров агглютинации бактерий возбудителя коклюша сывороткой крови иммунизированных добровольцев, секреторных специфических противококлюшных антител IgA в рото-/носоглоточных аспиратах, выявлена статистически достоверная динамика роста количества противококлюшных имуноглобулинов и титра агглютинации. Во всех случаях зарегистрирован достоверный бустерный эффект, выражавшийся в ускорении роста и увеличении абсолютного количества антител после повторного введения аттенуированных бактерий вакцинированным кандидатной вакциной добровольцам, что позволяет оценивать иммуногенность тестируемых кандидатных вакцин наряду с их защитной активностью.

Выявленное статистически достоверное снижение времени элиминации бактерий из назофарингеальных/ротоглоточных аспиратов, после интраназального введения тестовых аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам, в сравнении с указанными сроками после первой вакцинации, демонстрирует защитные свойства вакцины относительно последующего контакта с инфекцией, проявляющисяе в более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев. Регистрации бустерного роста количества специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови и IgA в назальных аспиратах добровольцев демонстрирует иммуногенные свойства кандидатной вакцины.

Предлагаемые в изобретении способы оценки защитной активности и иммуногенности новых противококлюшных вакцин, основанный на интраназальном введении аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам и регистрации времени их выведения и наличия бустерного эффекта синтеза иммуноглобулинов, являются наиболее адекватными и максимально приближенным к эпидемиологическому методу. Использование заявленных способов позволяет сократить время и стоимость регистрации новых противококлюшных вакцин,

Группа изобретений относится к медицине и биотехнологии. Предложены способ оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий сравнение времени элиминации аттенуированных бактерий возбудителя коклюша из носо/ротоглотки добровольцев исследованной и контрольной групп, причем в качестве аттенуированных коклюшных бактерий используют вакцину коклюшную живую рекомбинантную ГамЖВК в дозе 5×10⁹ КОЕ; и применение вакцины коклюшной живой рекомбинантной ГамЖВК для оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека. Наличие противобактерийной защитной активности кандидатной вакцины определяют по уменьшению времени выведения аттенуированных бактерий В. pertussis из носо/ротоглотки добровольцев исследованной группы в сравнении с контрольной. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека на этапах клинического исследования. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 3 пр.

1. Способ оценки защитной активности живых коклюшных вакцин у человека, предусматривающий введение кандидатной живой коклюшной вакцины добровольцам; интраназальное введение аттенуированных бактерий возбудителя коклюша, причем в качестве аттенуированных коклюшных бактерий используют вакцину коклюшную живую рекомбинантную ГамЖВК в дозе 5×10⁹ КОЕ; анализ препаратов ДНК, выделенных из смывов назофарингеальных и ротоглоточных мазков; интраназальное введение аттенуированных бактерий В. pertussis в дозе 5×10⁹ КОЕ контрольной невакцинированной группе добровольцев; анализ препаратов ДНК, выделенных из назофарингеальных и ротоглоточных смывов мазков у добровольцев контрольной группы с помощью количественного ПЦР РВ; сравнение времени элиминации бактерий из носо/ротоглотки добровольцев исследованной и контрольной групп; определение наличия противобактерийной защитной активности кандидатной вакцины по уменьшению времени выведения аттенуированных бактерий В. pertussis из носо/ротоглотки добровольцев исследованной группы в сравнении с контрольной.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что скорость выведения бактерий тестируют в аспиратах.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что скорость выведения бактерий тестируют с помощью определения динамики изменения числа геном-эквивалентов с помощью ПЦР РВ.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что взятие назофарингеальных и ротоглоточных мазков у добровольцев контрольной группы после введения ГамЖВК проводят в следующие сроки: 1 ч, 24 ч, 3 сут, 7 сут, 28 сут и 60 сут.

5. Применение вакцины коклюшной живой рекомбинантной ГамЖВК для оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека.