Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины Российский патент 2019 года по МПК C12N1/00 

Область техники.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бесклеточной коклюшной вакцины.

Уровень техники.

Проблема получения высокоэффективных бесклеточных коклюшных вакцин является актуальной, поскольку, несмотря на высокий уровень вакцинации населения в странах, использующих БКВ, количество вспышек коклюшной инфекции не снижается, что является следствием недостаточного уровня создаваемого ими иммунитета.

Так, известны штаммы бактерий В. pertussis №475, серовариант 1.2.3 и №305, серовариант 1.2.0, используемые для производства коклюшных вакцин. Недостатком известных штаммов является недостаточно высокий уровень протективных свойств получаемых на их основе вакцин.(1)

Сиквенс-анализ генома В. pertussis, проведенный в ряде стран мира, показал наличие изменений в аллельных вариантах основных протективных антигенов коклюшного микроба: КТ, ФГА, пертактина и фимбрий у современных циркулирующих штаммов В. pertussis, как следствие адаптации их к условиям существования (4). Получение новых свежевыделенных штаммов В. pertussis, обладающих повышенной протективной активностью, для производства коклюшной бесклеточной вакцины, является одним из важных условий совершенствования этих препаратов.

Задачей изобретения является получение нового свежевыделенного штамма Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины, обладающей повышенной протективной активностью.

Для решения данной задачи предлагается свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis №211-03, который депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России под №317 - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.

Раскрытие изобретения.

Сущность изобретения состоит в том, что для получения комплекса протективных антигенов, применяемого для производства бесклеточной коклюшной вакцины, используют новый свежевыделенный штамм Bordetella pertussis, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под №317 - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.

Штамм культивируют в жидкой синтетической питательной среде с добавлением анионообменной смолы в статических условиях в течение 70-122 часов при температуре (36±1)°C. Концентрация бактерий в конце культивирования составляет 60±10 международных оптических единиц (МОЕ) в мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта - 10,2±2,4 лейкоцитозстимулирующих единиц (ЛСЕд) в 0,1 мл; количество коклюшного токсина, определенного иммуноферментным методом, составляло - 18±3,8 нг/МОЕ/мл, филаментозного гемагглютинина - 28,8±5,4 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 1 - 11,4±1,8 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 2 - 8,4±1,3 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 3 - 1,9±0,3 нг/МОЕ/мл.

Молекулярно-генетические исследования вакцинных штаммов №305 и 475 и свежевыделенного штамма В. pertussis показали, что ген субъединицы А коклюшного токсина, ptxA вакцинных штаммов №305 и 475 характеризуется аллельными вариантами ptxA2(AJ245367) и ptxA4(AJ245368) соответственно; ген пертактина (белка наружной мембраны) характеризуется аллельным вариантом prn1(A)011091.1); ген фимбрий 2 - аллельным вариантом 2-1 и фимбрий 3 вакцинных штаммов 305 и 475 - аллельным вариантом 3А(Х51543), в то время как ген субъединицы А коклюшного токсина свежевыделенного штамма №317 характеризуется аллельным вариантом ptxA1(AJ245366), ген пертактина - аллельным вариантом prn2(А)011092.1), ген фимбрий 2 - аллельным вариантом 1 и ген фимбрий 3 - аллельным вариантом 3B(AY464180). Генотипирование с помощью мультилокусного секвенирования ДНК определило принадлежность штамма к сиквенс-типу 322MAST2, который с 2005 г является одним из доминирующих на территории Российской Федерации.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение нового свежевыделенного штамма В. pertussis для производства коклюшной бесклеточной вакцины, обладающей повышенной протективной активностью.

Краткое описание чертежей и иных поясняющих материалов.

Таблица 1 Протективная активность БКВ1 и БКВ2, где

ЛД₅₀=27 клеток (ЛД₅₀ - доза заражающей культуры В. pertussis шт. 18323, вызывающая гибель 50% мышей)

Заражающая доза - 1852 ЛД₅₀

* МЗЕ - Международная защитная единица.

**ОСО - Отраслевой стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины ОСО 42-28-89-01П.

Осуществление изобретения.

Свежевыделенный штамм В. pertussis, полученный от 8-и летнего больного ребенка в г. Москва в 2003 г, был адаптирован к жидкой синтетической питательной среде культивирования вакцинных штаммов.

Штамм имеет следующие характеристики:

Морфологические и культуральные свойства. Грамотрицательные коккобактерии - мелкие типичные палочки овоидной формы, располагающиеся в мазках отдельно или парами, образующие на среде Борде-Жангу с добавлением 20-25% дефибринированной крови человека мелкие колонии, диаметром 0,5-1,0 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, блестящие (с характерным «жемчужным» блеском), полупрозрачные, сероватого цвета, в тонком слое среды (1,5-2 мм) окружены нерезко ограниченной зоной гемолиза. Культура агглютинируется коклюшной антибактериальной сывороткой в титре не ниже 1:10240 и адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2 и 3 в титрах 1:2560; 1:2560; 1:1280, соответственно.

Молекулярно-генетическая характеристика штамма. Ген субъединицы А коклюшного токсина характеризуется как аллельный вариант ptxA1(AJ245366), ген пертактина как аллельный вариант prn2(А)011092.1), ген фимбрий 2 как аллельный вариант 1 и ген фимбрий 3 - аллельный вариант 3B(AY464180).

Пример 1. Для культивирования Bordetella pertussis используют жидкую синтетическую питательную среду, содержащую аминокислоты (цистеин, глутаминовую кислоту, пролин), соли (КН₂РО₄; KCl, MgSO₄; CaCl₂; NaCl) и витамины (аскорбиновая и никотиновая кислоты).

Лиофилизированный штамм №317 восстанавливают из сухого состояния на чашках Петри со средой Борде-Жангу с 20-25% крови человека. Чашки инкубируют при температуре (36±1)°C в течение 47-73 часов. Морфологию и чистоту культуры контролируют микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. Затем 10-15 типичных колоний пересевают с чашек на пробирки со средой Борде-Жангу или с казеиново-угольным агаром и инкубируют в течение 48-72 часов. После 2-3 пассажей на плотных средах смывы культуры с пробирок используют в качестве посевного материала для выращивания штамма в жидкой полусинтетической питательной среде в колбах Эрленмейера (110 мл среды + анионообменная смола). Колбы встряхивают на шуттель аппарате при температуре (36±1)°C в течение 16-18 часов. После микроскопического контроля морфологических свойств культуру В. pertussis из колб пересевают в матрацы с жидкой синтетической питательной средой, содержащей анионообменную смолу. Выращивание проводят в статических условиях в течение 70-122 часов при температуре (36±1)°C.

В конце культивирования концентрация бактерий составляет 60±10 Международных оптических единиц (МОЕ), лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта 10,2±2,4 ЛСЕд в 0,1 мл, количество коклюшного токсина при определении иммуноферментным методом 18±3,8 нг/МОЕ/мл, серовариант штамма 1.2.3.

Пример 2. Получение из заявляемого штамма бесклеточной коклюшной вакцины БКВ1.

По окончании культивирования от микробных клеток отделяют надосадочную жидкость центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут. Из центрифугата осаждают токсин путем добавления 3-7% раствора гексаметафосфата натрия, 2н. серной, 2н. соляной, 2н. трихлоруксусной кислот в изоэлектрической зоне рН=3,4-3,6. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение одного часа, осторожно промывают дистиллированной водой, растворяют в 1/15М фосфатном буфере, гомогенизируют на электрическом гомогенизаторе в течение 12 секунд. Полученный токсин переводят в анатоксин путем добавления сахарозы до концентрации 10% с последующим выдерживанием в холодильнике в течение одного часа при периодическом осторожном перемешивании и последующего добавления к смеси формалина до концентрации 0,4%, после чего смесь помещают в термостат при 36,5°C на 19-20 суток, периодически осторожно перемешивая смесь. Сорбируют полученный анатоксин на геле гидроокиси алюминия (добавляют 1 мг геля гидроксида алюминия в 1 мл смеси). Смесь шуттелируют на холоду в течение одного часа и переносят в холодильник (2,3).

Пример 3. Сравнительное изучение протективных свойств БКВ1 из заявляемого штамма и БКВ2 из двух известных вакцинных штаммов В. pertussis (№305 и 475).

Было показано, что БКВ1 из заявляемого штамма обладала более высокой протективной активностью, чем БКВ2 из известных штаммов. Результаты представлены в таблице 1.

Результаты исследований показали, что протективная активность БКВ1 из заявляемого штамма составляла 17,1 МЗЕ/мл и в 1,9 раз превышала таковую БКВ2 из известных штаммов, составляющую 9,0 МЗЕ/мл. Это свидетельствует о высоких протективных свойствах заявляемого штамма в сравнении с известными вакцинными штаммами.

Исследования безвредности БКВ1 и БКВ2 показали их безопасность в 1 иммунизирующей дозе для человека - 25 мкг и отсутствие сенсибилизации к гистамину в дозах, более 100 мкг (4 иммунизирующие дозы для человека).

Таким образом, получен новый свежевыделенный штамм Bordetella pertussis, продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под №317, обладающий высокими протективными свойствами, который может быть использован для производства бесклеточной коклюшной вакцины.

Литература.

1. Е.М. Зайцев, И.Г. Бажанова, М.В. Брицина и др. Протективная активность и безопасность бесклеточной коклюшной вакцины из вакцинных и свежевыделенного штамма. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2017, 2(93), том 16, с. 31-35.

2. Захарова Н.С., Брицина М.В., Бажанова И.Г. и др. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. ЖМЭИ, 2008, 1, с. 35-41.

3. Патент №1369042 «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis». 14 июля 1993 г.

4. A.J. King, Т. van Gorkom, J/LA Pennings, et all. Comparative genomic profiling of Dutch clinical Bordetella pertussis isolates using DNA microarrays: Identification of genes absent from epidemic strains. BMC Genomics 2008, 9:311/

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой свежевыделенный от больного коклюшем штамм бактерий Bordetella pertussis 211-03, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под номером 317 как кандидатный вакцинный штамм, соответствующий по генетическим характеристикам сиквенс-типу 322MAST2, доминирующему с 2005 года на территории Российской Федерации. Полученный штамм обладает высокими протективными свойствами и может быть использован для производства бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ). 1 табл.

Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis, депонированный в Коллекции штаммов бактерий ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России под №317, - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.