Способ определения противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных клеток Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу оценки противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта (БМКП) на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга путем исследования содержания в крови цитокинов, а именно фактора некроза опухоли-альфа (англ. tumor necrosis factor alpha, TNF-α). Способ включает в себя определение концентрации TNF-α в крови до и после введения БМКП на фоне асептического воспаления. Он обеспечивает быструю и точную диагностику подавления асептического воспалительного процесса в результате терапии и является примером оценки эффективности применения конкретного клеточного продукта.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на определении содержания в крови провоспалительного цитокина (TNF-α) методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель изобретения - разработать способ определения противовоспалительной активности БМКП на основе МСК костного мозга.

Биомедицинские клеточные продукты - новая группа препаратов, представляющих собой клеточные линии различного происхождения, используемые для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний, в том числе для подавления иммунного конфликта при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и тяжелых аутоиммунных процессах [1, 2].

Одной из таких клеточных линий являются МСК. Клетки данной группы получают из различных органов и тканей, но наиболее перспективными источниками считаются костный мозг и жировая ткань. Используемые в качестве БМКП клетки должны быть жизнеспособны и функционально активны. Известно, что МСК способны влиять на функции иммунокомпетентных клеток, используя ряд механизмов, позволяющих ускользать от иммунного ответа реципиента при введении в организм. Они модифицируют функции элементов системы врожденного иммунитета таким образом, что обеспечивают свою защиту от повреждающего действия этих факторов. МСК подавляют пролиферацию, экспрессию рецепторов и эффекторные функции натуральных киллеров, ингибируют окислительный взрыв нейтрофилов, изменяют характер продукции цитокинов и иных медиаторов воспаления [3, 4]. Установлено, что МСК участвуют в регуляции иммунного ответа, негативно влияя на созревание дендритных клеток и дифференцировку Т-лимфоцитов [5]. Таким образом, для оценки эффекта от применения БМКП, содержащего МСК, необходим показатель, отражающий характер ответа со стороны иммунной системы. Учитывая, что TNF-α играет важнейшую роль в развитии воспалительного процесса, возможна оценка динамики его содержания при использовании в качестве маркера ответа на лечение препаратами МСК.

Известен способ оценки воспалительного процесса по тесту прямого повреждения нейтрофилов и определению концентрации циркулирующих иммунных комплексов после создания экспериментального асептического воспаления у лабораторных животных с использованием скипидара и вазелинового масла [6]. Однако эти методики дают возможность анализировать только отдельные звенья иммунного ответа, не демонстрируя полной картины.

Другой способ позволяет оценить течение воспалительного процесса по уровню лейкоцитов крови в разные временные периоды. Его реализация включает моделирование асептического воспаления путем введения подопытным животным скипидара и вазелинового масла с последующим визуальным наблюдением места инъекции (отек тканей с очагами некроза).

Опубликованные данные свидетельствуют об изменении числа лейкоцитов крови на разных этапах воспалительного процесса [7].

Наиболее близким к изобретению является способ оценки эффективности лечения воспалительных заболеваний кишечника с применением МСК. Он заключается в исследовании динамики численного состава субпопуляций Т- и В-лимфоцитов до и после введения БМКП. При содержании в периферической крови аутореактивного клона В1 лимфоцитов (0,013-0,027)×10⁹/л, CD3+CD4+CD38+(0,12-0,22)×10⁹/л, CD3+CD8+CD38+(0,057-0,073)×10⁹/л, значении иммунорегуляторного индекса 1,35-1,43, эффективность терапии воспалительных заболеваний кишечника с применением МСК оценивают как удовлетворительную [8]. Однако данный способ позволяет охарактеризовать только клеточное звено иммунитета и технически сложен, т.к. требует наличия проточного цитофлуориметра и навыков его использования.

Исследование содержания TNF-α в сыворотке крови методом ИФА позволяет в полной мере оценить эффективность применяемого БМКП на основе МСК, достаточность введенной дозы клеток и необходимость повторного назначения препарата для купирования воспалительного процесса.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа оценки противовоспалительной активности БМКП на основе МСК костного мозга, который включает в себя определение концентрации цитокина TNF-α в сыворотке периферической крови методом ИФА до и после введения МСК на фоне асептического воспаления. Его прикладное значение заключается в возможности определения функциональной активности, эффективности введенного клеточного продукта и достаточности применяемой дозы. В соответствии с прототипом, успешное применение МСК при асептическом воспалении (например, при возникновении реакции «трансплантат против хозяина») должно снижать уровень провоспалительного цитокина TNF-α в крови не менее 50% от значения до введения БМКП.

Способ доступен для выполнения в большинстве лабораторий, оснащенных стандартным оборудованием для ИФА, не требует использования технически сложных методик, обеспечивает быстрое получение результата и точную оценку эффективности применения конкретного клеточного продукта.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории клеточных технологий, лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии, отделе обеспечения качества ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА

Способ реализован следующим образом. Объектом исследования служили МСК костного мозга белых мышей, полученные в результате культивирования. Для проведения эксперимента использовали самцов лабораторных нелинейных мышей (n=41) в возрасте 6 мес.массой 19-21 г. Испытания выполнены на базе лаборатории клеточных технологий, лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии, отдела обеспечения качества ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. Для исследования отобраны здоровые особи надлежащего вида, имевшие свободный доступ к свежей воде и пище. [9].

С целью выделения МСК после умерщвления животного извлекали обе бедренные кости, удаляли эпифизы и вымывали костный мозг во флакон с полной питательной средой, содержащей следующие компоненты: среду αМЕМ (StemCells), эмбриональную телячью сыворотку (20%), гепарин (Sigma, 2 Ед/мл), L-глутамин 2 мМ (StemCells). Дальнейшее культивирование осуществляли в CO₂-инкубаторе Sanyo-5AC в стандартных условиях (5% углекислого газа, температура 37°С). Полную замену среды производили каждые 4-5 сут. После формирования конфлюэнтного монослоя клетки открепляли 0,25% раствором «Трипсин-ЭДТА», затем ингибировали действие фермента, добавляя избыток полной питательной среды. Количество жизнеспособных МСК подсчитывали в камере Горяева с использованием красителя трипанового синего, после чего "выполняли пересев в культуральные флаконы из расчета 1500 мезенхимальных клеток/см². Оставшиеся клетки замораживали с раствором диметилсульфоксида в конечной концентрации 10% для дальнейшего использования.

В эксперименте лабораторных мышей разделили на 4 группы. Первая группа мышей - контрольная, включала интактных животных (6 мышей). Остальные группы были экспериментальными. Подопытным особям второй (5 мышей), третьей (20 мышей) и четвертой (10 мышей) индуцировали асептическое воспаление путем подкожного введения смеси из 0,1 мл скипидара и 0,1 мл вазелинового масла. Третья и четвертая группы мышей на фоне воспалительного процесса получили соответственно однократное (на 6 сутки после индукции воспаления) либо двукратное (на 5,6 сутки) введение БМКП, содержащего МСК, в хвостовую вену в дозе 0,06×10⁶ клеток на 1 мышь. В течение эксперимента проводили ежедневный визуальный контроль состояния подопытных особей. На 7 сутки животных умерщвляли, собирали кровь в пробирки типа Эппендорф и отделяли сыворотку путем центрифугирования при комнатной температуре +22°С на скорости 3000 об/мин в течение 20 минут с использованием центрифуги MultiSpin MSC-3000.

Измерение уровня TNF-α проводили методом ИФА с использованием набора реагентов TNF alpha Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific, США).

Полученные результаты представлены в таблице в виде медианы (Me) и интерквартального интервала 25-75 процентилей (Q_0,25-Q_0,75). Для определения различий использовали критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05.

Обнаружено, что на фоне индукции асептического воспаления содержание TNF-α в сыворотке крови мышей значительно превышало границы референсных значений. После введения БМКП, содержащего МСК, выявлено снижение концентрации указанного провоспалительного цитокина. Следует отметить, что в группе с однократным введением МСК только у 20% мышей уровень TNF-α был сопоставим с показателями контрольной интактной группы, тогда как при двукратной инъекции - у 40%.

Обнаруженные различия между показателями в исследуемых группах лабораторных животных свидетельствуют о целесообразности использования уровня TNF-α в качестве маркера противовоспалительной активности БМКП на основе МСК. Таким образом, предлагаемый способ удобен для клинического использования и может быть применен в практике для определения противовоспалительной активности МСК с целью оценки эффективности введенного клеточного продукта.

Список литературы

1. Рачинская О.А., Меркулов В.А. Применение методов цитогенетического анализа при оценке качества клеточных линий в составе биомедицинских клеточных продуктов // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2018. - Т. 18. - №. 1. - С. 25-32.

2. Владимирская Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии // Онкогематология. - 2007. - №. 1. - С. 4-16.

3. Климович В.Б. Иммуномодулирующая активность мезенхимальных стромальных (стволовых) клеток // Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16, №.2. - С. 107-126.

4. Human mesenchymal stem cells inhibit neutrophil apoptosis: a model for neutrophil preservation in the bone marrow niche / Raffaghello L., Bianchi G., Bertolotto M. [et al.]. // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 151-162.

5. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism / Djouad F., Charbonnier L.M., Bouffi C. [et al.]. // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25. - P. 2025-2032.

6. Балабекова M.К. Состояние иммунного статуса интактных крыс с асептическим воспалением (экспериментальное исследование) // Вестник Казахского Национального медицинского университета. - 2010. - №. 5 (часть 3). - С. 278-281.

7. Динамика течения воспаления, вызванного на фоне металлиндуцированной иммунодепрессии / Балабекова М.К., Рыспекова Н.Н., Жукешева М.К. [и др.]. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №6. (URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=23780).

8. Способ оценки эффективности лечения мезенхимальными стромальными клетками воспалительных заболеваний кишечника: пат. 2463596 Рос. Федерация: МПК G01N 33/49 / Князев О.В.; заявитель и патентообладатель Князев О.В., Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г. и др. - №2011116520/15; заявл. 26.04.2011; опубл. 10.10.2012. - 8 с.

9. Гоглова, О.О. Этика работы с экспериментальными животными / Гоглова О.О., Богомолов А.Ф. // Медицинское право и этика. - 2003 - №4. - С. 4-6.

10. Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.)

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен способ оценки противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных стромальных клеток костного мозга путем исследования содержания в крови цитокинов, а именно фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α). Способ включает в себя определение концентрации TNF-α в сыворотке периферической крови до и после введения МСК костного мозга на фоне асептического воспаления. Изобретение обеспечивает быструю и точную диагностику снижения интенсивности асептического воспалительного процесса после использования БМКП, отражая эффективность применения конкретного клеточного продукта и достаточность введенной дозы. 1 табл., 1 пр.

Способ определения противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных клеток костного мозга путем оценки уровня фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) в сыворотке крови, включающий в себя определение TNF-α методом иммуноферментного анализа до и после введения продукта, отличающийся тем, что анализируется динамика содержания указанного провоспалительного цитокина как комплексный показатель ослабления интенсивности воспалительного процесса, в качестве показателя эффективности лечения принято снижение уровня TNF-α не менее чем на 50% от исходного.