ПРЕБИОТИК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАРУШЕННЫМ СОСТАВОМ ИЛИ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬЮ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОМА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/715 A61K31/732 A61K35/745 A61P3/04 A61P3/08 A61P1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу терапевтического или профилактического лечения расстройств, ассоциированных с нарушением состава или функциональности кишечного микробиома у пациента, расстройство выбирают из метаболического расстройства и дисфункции кишечного барьера, указанный способ включает пероральное введение пребиотической композиции пациенту, указанная пребиотическая композиция содержит полисахарид рамногалактуронан I (RG-I), происходящий из фруктов, моркови, гороха, цикория или сахарной свеклы.

Изобретение дополнительно относится к пребиотической композиции и синбиотической композиции, подходящей для применения в вышеупомянутом способе лечения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Взаимоотношения между кишечной микробиотой и здоровьем человека прогрессивно изучаются. В настоящее время установлено, что здоровая кишечная микробиота во многом ответственна за общее здоровье организма хозяина.

Человек хозяин обеспечивает среду обитания и питание для большой и разнообразной экосистемы микробных сообществ, которые играют ключевую роль в пищеварении, метаболизме и модуляции иммунной функции и оказывают значительное влияние на желудочно-кишечный тракт. Изменения многообразия и функции таких сообществ ассоциированы с далеко идущими последствиями для состояния здоровья хозяина и связаны с рядом расстройств, включая функциональные расстройства кишечника, воспалительные заболевания кишечника и другие иммуноопосредованные расстройства (целиакия, аллергии) и метаболические расстройства (диабет 2 типа, НАСГ (NASH)).

Дисбиоз (также называемый дисбактериоз) представляет собой термин для микробного дисбаланса или дезадаптации на или внутри тела, например, нарушенная микробиота. Например, бактериальные сообщества, занимающие определенные области поверхности хозяина, такие как кишечная микробиота, кожная микробиота или влагалищная микробиота, могут становиться модифицированными/измененными с недостаточным присутствием обычно доминирующих видов, и количество обычно конкурентных или контейнированных видов увеличивается до нежелательного уровня. Набор бактерий в таких сообществах в общем называется микробиотой. Локальная микробиота вместе с микроорганизмами, включающими дрожжи, грибы, вирусы и паразиты, остающиеся в таких нишах, называется микробиомом. Дисбиоз не ограничивается дисбалансом микробиоты, но также может включать другие микроорганизмы в микробиоме (например, вирусы, архебактерии и грибы).

Когда микробиом хорошо сбалансирован, под названием нормобиоз, микроорганизмы, занимающие специфическую нишу, образуют более или менее стабильное сообщество, которое хорошо адаптировано к местным условиям, имеет метаболическую способность жить на доступном субстрате, эффективно взаимодействует со стрессорными факторами и изменениями доступности субстрата и имеют регуляторные механизмы на месте, которые вносят вклад в метастабильность сообщества и участвуют в поддержании состояния здоровья хозяина.

Дисбиоз наиболее часто изучают, как состояние в желудочно-кишечном тракте, но он может поражать любую полость тела, поверхности слизистых и кожи, заселенных микробным сообществом.

Дисбиоз ассоциирован с заболеваниями хозяина; кишечный дисбиоз, например, ассоциирован с воспалительными заболеваниями кишечника, синдромом хронической усталости, ожирением, раком, кардиометаболическими состояниями, нечувствительностью к инсулину, (пре)диабетом, бактериальным вагинозом и колитом.

На состав и стабильность микробиоты влияет генетическая предрасположенность хозяина, окружающие условия или стрессорные факторы, которые включают, например, питание, образ жизни, применение лекарственных препаратов - например, антибиотиков - и стадия развития (возраст) хозяина. Это преобразуется в постоянное и комплексное взаимодействие между хозяином и основными компонентами локальной микробной экосистемы. Такие компоненты включают микробиоту, иммунную систему хозяина, локальный эпителиальный барьер и, в случае кишечника, кишечную нервную систему.

Микробиота новорожденного устанавливается самостоятельно с рождения и заметно меняется в течение первых недель и месяцев, становясь похожей на ядерную микробиоту взрослого около 3-4 лет. Такая прогрессирующая микробная колонизация кишечника является ключевой для обучения и созревания иммунитета хозяина и кишечной нервной системы, кишечного барьера и функции, и метаболического программирования хозяина, что оказывает влияние на краткосрочное и более позднее в жизни состояние здоровья и риск заболеваний. На микробиоту новорожденного влияет материнская диета и микробиота, тип родоразрешения, питание младенца (грудное вскармливание или молочная смесь) и условия окружающей среды.

Наоборот, ядерная микробиота здорового взрослого является более стабильной в том смысле, что при воздействии различных стрессорных факторов (например, применении антибиотиков или лекарственных препаратов), она возвращается близко к своему оригинальному составу у здоровых субъектов, что называют стойкостью микробиоты. Потеря вариабельности, отсутствие или низкая обогащенность полезными микроорганизмами и потеря стойкости ассоциированы с заболеваниями.

Микробиота пожилых или старых людей отличается от таковой здоровой взрослой популяции изменениями состава, приводящими к меньшему бактериальному разнообразию, уменьшению полезных микроорганизмов и сниженной стойкости. Все такие изменения ассоциированы с изменениями состояния здоровья.

Микробиота состоит из большого многообразия видов, которые соревнуются за пространство и ресурсы/питательные вещества, но также могут кормить друг друга своими соответствующими продуктами ферментации, таким образом приводя к сообществу микроорганизмов, которые в здоровом состоянии живут в симбиозе с млекопитающим хозяином. Высокое микробное разнообразие в кишечной микробиоте расценивается полезным для здоровья хозяина, так как разнообразие делает микробиоту более стойкой к факторам, которые нарушают кишечную микробиоту (например, антибиотики, изменения в питании, инвазии новыми видами). Также важным является объединение микробов, т.е. метастабильные комбинации различных микроорганизмов, которые кормят друг друга продуктами ферментации и вместе образуют более или менее стабильную экосистему, которая благополучно развивается в определенной нише с использованием доступного субстрата (например, из слизи, обломков клеток и питания).

Типичные микробные виды, обнаруживаемые на или внутри организма являются главным образом полезными или безвредными. Патобионты или даже патогены также являются частью “нормальной” микробиоты, пока они остаются ниже критического уровня. Кишечная микробиота млекопитающих несет ряд полезных и обязательных функций, таких как помощь в переваривании, обеспечение энергии из пищи, обеспечение специфических (микро)нутриентов для хозяина, продукция ключевых метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты, и обучение (новорожденные и младенцы) или поддержание (взрослые) иммунной системы хозяина. Они также помогают защищать организм от проникновения патогенных микробов или токсических соединений.

Микробные виды также экскретируют множество различных типов отходов побочных продуктов. С использованием различных механизмов удаления отходов в нормальных обстоятельствах организм эффективно справляется с такими побочными продуктами с минимальными или отсутствием проблем. К сожалению, избыточные микробные популяции и несоответствующее доминирование микробных видов из-за их повышенного количества, экскретируют повышенное количество таких побочных продуктов. При увеличении количества микробных побочных продуктов более высокий уровень побочных продуктов может перегрузить механизмы удаления отходов организма. Примером этого является образование аммиака при ферментации белка, который может быть дополнительно ферментирован в соединения, которые вредны для хозяина.

Бывает относительное доминирование или недостаточное представление определенных видов микробов, низкое разнообразие и/или нарушенная продукция микробных метаболитов, которые вызывают множество негативных симптомов, наблюдаемых у пациентов, страдающих от дисбиоза.

Потребление пробиотиков и/или пребиотиков может оказывать благоприятное воздействие на кишечную микробиоту.

Пробиотики представляют собой “живые микроорганизмы, которые, при введении в адекватных количествах, полезны для здоровья хозяина” (определение Всемирной Организации Здравоохранения).

Пребиотики представляют собой неперевариваемые пищевые ингредиенты, которые полезны для хозяина в результате селективной стимуляции роста и/или активности одного или ограниченного количества микробных видов в сообществе.

Наиболее известными пребиотиками являются олигомеры идентичных сахаров (таких как фруктоза, галактоза или арабиноза), связанные гликозидными связями. Они стимулируют селективный избыточный рост микробных видов, которые имеют метаболические способности (быстро) ферментировать такие относительно простые субстраты для получения полезных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты. Типичные побочные эффекты применения таких легко ферментируемых субстратов включают дискомфорт в кишечнике, вздутие и регургитацию. Такие побочные эффекты вызваны быстрой ферментативной продукцией газов.

Пектин является структурным гетерополисахаридом, который присутствует в первичных клеточных стенках наземных растений.

Пектиновые полисахариды представляют собой гетерогенную группу полисахаридов, включающих различные количества следующих полисахаридных компонентов:

(i) гомогалактуронан (HG),

(ii) ксилогалактуронан (XG),

(iii) апиогалактуронан (AG)

(iv) рамногалактуронан-I (RG-I), и

(v) рамногалактуронан-II (RG-II).

На фиг. 1 представлено схематическое изображение структуры пектиновых полисахаридов, включающих вышеупомянутые 4 полисахаридных компонента. Отмечено, что полисахаридные компоненты HG, XG и RG-II обычно представляют только минимальную фракцию пектиновых полисахаридов.

Полисахаридные компоненты HG, XG и RG-II каждый включают основу, которая состоит из линейной цепи моносахаридных единиц α-(1-4)-связанной D-галактуроновой кислоты.

Только RG-I включает основу, которая состоит из линейной цепи повторяющихся дисахаридных единиц: 4)-α-D-галактуроновая кислота -(1,2)-α-L-рамноза-(1. Схематическое представление структуры RG-I показано на фиг. 2.

Состав и тонкая структура пектиновых полисахаридов широко варьируются в зависимости от растительного источника и применяемых условий экстракции. Домен гомогалактуронана может иметь длину до около 100 последовательных остатков D-GalA. RG-I домен, содержащий боковые цепи, обычно называют ‘разветвленным участком’ или ‘волосатым участком’, тогда как домен гомогалактуронана (между двумя доменами RG-I) обычно не замещен олигосахаридами.

Остатки GalA в RG-I связаны с остатками Rha через положения 1 и 4, тогда как остаток Rha связан с остатком GalA через аномерное и 2-OH положения. В общем около 20-80% остатков Rha разветвлено в положении 4-OH (в зависимости от растительного источника и способа выделения), с нейтральными и кислыми боковыми цепями. Такие боковые цепи состоят главным образом из остатков Ara и Gal, связанных различным образом, составляющих полимеры, известные как арабиногалактан I (AG-I) и/или AG-II. AG I состоит из основы бета-(1,4)-связанной D-Gal с замещениями в 3-OH альфа-L-арабинозиловых групп; Gal основа может иметь вставленные альфа(1,5)-L-Ara фрагменты. AG-II состоит из высоко разветвленного галактана с главным образом внутренним бета(1,3)-связанным D-Gal с замещениями короткими (1,6)-связанными цепями снаружи. Последний имеет дополнительные прикрепления (1,3)- и/или альфа(1,5)-связанных L-Ara. Олигосахаридные боковые цепи могут быть линейными или разветвленными и некоторые из таких боковых цепей могут оканчиваться альфа-L-фукозидами, бета-D-глюкуронидами, и 4-O-метил бета-D-глюкурониловыми остатками.

В Gоmez et al. (Prebiotic potential of pectins and pectic oligosaccharides derived from lemon peel wastes and sugar beet pulp: A comparative evaluation, Journal of Functional Foods, Volume 20, January 2016, Pages 108-121) описаны результаты исследования, в котором свекловичную пульпу (SBP) и отходы лимонной цедры (LPW) использовали для получения двух смесей пектиновых олигосахаридов (обозначенных как SBPOS и LPOS, соответственно). Соответствие пектиновых олигосахаридов, пектинов из SBP и LPW и коммерческого FOS в отношении развития пребиотических эффектов сравнивали посредством ферментации in vitro и флуоресценции in situ гибридизации с использованием инокулята человеческих экскрементов и восьми различных бактериальных проб. Общая популяция бифидобактерий и лактобацилл возрастала с 19% до 29%, 34% и 32% в культурах с LPOS, SBPOS и FOS, соответственно. Количество Faecalibacterium и Roseburia также увеличивалось со всеми субстратами (особенно с LPOS). Наибольшие концентрации органических кислот наблюдали в среде, содержащей олигосахариды. В соответствии с авторами, указанная работа подтверждает, что пектиновые олигосахариды демонстрируют лучшие пребиотические свойства, чем пектины, и такие же или лучшие, чем FOS.

Chatterjee, et al. (Effect of Fruit Pectin on Growth of Lactic Acid Bacteria, J Prob Health 2016, 4:2) сообщают об исследовании, в котором тестировали эффект пектина, экстрагированного из различных типов фруктовых отходов (Musa sp. и Citrus limetta и корка Citrullus lanatus и очищенные плоды Solanum lycopersicum и Psidium guajava) на рост молочнокислых бактерий (LAB) и бифидобактерий (Lactobacillus casei, L. acidophilus и Bifidobacterium bifidum). Наблюдали, что пектин оказался способен значительно усиливать рост бактерий и титруемую кислотность. Авторы заключили, что пектин, который экстрагируют из фруктовых отходов, может быть использован для усиления роста лактобацилл и бифидобактерий.

Babbar, et al. (Pectic oligosaccharides from agricultural by-products: production, characterization and health benefits, Crit. Rev. Biotech. 2016; 36(4) 594-606) упоминают, что пектин-содержащие сельскохозяйственные побочные продукты являются потенциальными источниками нового класса пребиотиков, известных как пектиновые олигосахариды (POS). Контролируемый гидролиз пектин-содержащих сельскохозяйственных побочных продуктов, как сахарная свекла, яблоки, оливки и цитрусовые, посредством химической, ферментативной и гидротермической обработки может быть использован для получения олиго-галактуронидов, галакто-олигосахаридов, рамногалактуронан-олигосахаридов, и др.

Hoon Kim et al. (Effect of arabinoxylan- and rhamnogalacturonan I-rich polysaccharides isolated from young barley leaf on intestinal immunostimulatory activity, Journal of Functional Foods, 2017; 35, 384-390) получили четыре фракции полисахаридов из листьев ячменя и сравнили in vitro кишечную иммуностимулирующую активность. Среди фракций высокомолекулярная фракция, полученная ферментативной экстракцией (BLE-P), показала эффективность в активации пролиферации клеток костного мозга посредством Пейеровых бляшек (PP), и в стимуляции продукции цитокинов in vitro. BLE-P был идентифицирован как смесь гемицеллюлозного глюкуроноарабиноксилана и пектинового рамногалактуронана I, составляющего более 80%. Впоследствии, BLE-P вводили перорально мышам в течение 20 дней для изучения эффекта на кишечную иммуностимулирующую активность in vivo. Введение BLEP не только способствовало продукции иммуноглобулина A (IgA), но также увеличивало уровни IgA-связанных цитокинов, таких как трансформирующий фактор роста-β и интерлейкин-10.

В US 2014/275233 описан способ лечения желудочно-кишечного дисбиоза у пациента, включающий пероральное введение пациенту эффективного количества композиции, включающей выделенную растительную ткань, имеющую содержание глицеоллина по меньшей мере 0,25 мг на грамм растительной ткани. Три очень сходных фитоалексина, называемых глицеоллин I, глицеоллин II, и глицеоллин III, получали из сои, когда растение подвергали воздействию почвенных микроорганизмов, ультрафиолетового света (УФ) или тяжелых металлов.

В WO 2011/069781 описан полисахарид, который способен модулировать иммунный ответ, указанный полисахарид получают из растения вида Camellia sinensis, где основа полисахарида включает перемежающиеся домены рамногалактуронана-1 и альфа(1,4)-связанной полигалактуроновой кислоты или доменов альфа(1,4)-связанной олигогалактуроновой кислоты, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозила в основе полисахарида варьируется от 2,5:1 до 1:1, и где полисахарид имеет молекулярную массу по меньшей мере 70 кДа.

В WO 2012/148277 описан препарат, имеющий содержание сухого вещества по меньшей мере 20 мас.%, указанный препарат содержит по меньшей мере 50 мас.% сухого вещества смеси пектиновых полисахаридов, включая по меньшей мере 20%, рассчитанных по массе пектиновых полисахаридов, пектинов рамногалактуронана-I, имеющих молекулярную массу более чем 40 кДа, указанная смесь пектиновых олигосахаридов характеризуется:

* степенью метилирования остатков галактуроновой кислоты не более чем 20%;

* степенью ацетилирования остатков галактуроновой кислоты не более чем 20%;

где препарат не образует гель, когда его разводят водным раствором 50 мМ аммонийбикарбоната до содержания твердого вещества 2,5 мас.%. Также описано применение указанного препарата в качестве лекарственного препарата для модуляции иммунного ответа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что расстройства, ассоциированные с нарушенным составом или функциональностью кишечного микробиома, а именно метаболические расстройства или дисфункцию кишечного барьера, можно лечить терапевтически или профилактически посредством перорального введения полисахаридов рамногалактуронана I (RG-I), происходящих из фруктов, моркови, гороха, цикория или сахарной свеклы, указанные RG-I полисахариды имеют молекулярную массу более 15 кДа и имеют основу, включающую домены рамногалактуронана-I и необязательно домены альфа(l,4)-связанной гомо-галактуроновой кислоты, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозы в указанной основе находится в диапазоне от 20:1 до 1:1.

Хотя авторы изобретения не желают быть связанными теорией, считается, что RG-I полисахариды действуют как пребиотик, посредством обеспечения высокого разнообразия микробов в кишечной микробиоте, посредством стимуляции роста или активности полезных бактерий (например, Akkermansia muciniphila и Bifidobacterium spp.) и/или посредством увеличения стойкости кишечной микробиоты в отношении неприятностей.

Кроме того, было обнаружено, что кишечная ферментация RG-I полисахаридов приводит к образованию полезных короткоцепочечных жирных кислот. Неожиданно, ферментативная конверсия RG-I полисахаридов в короткоцепочечные жирные кислоты сопровождалась по существу меньшим газообразованием, чем то, которое наблюдают для классических пребиотиков, таких как, например, инулин.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к пребиотической композиции для применения в способе терапевтического или профилактического лечения заболеваний, ассоциированных с нарушенным составом или функциональностью микробиома кишечника у пациента, заболевание выбирают из метаболического расстройства и дисфункции кишечного барьера, указанное применение включает пероральное введение пребиотической композиции пациенту, где композиция содержит по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества RG-I полисахаридов, происходящих из фруктов, моркови, гороха, цикория или сахарной свеклы, указанные RG-I полисахариды, имеют молекулярную массу более 15 кДа и имеют основу, состоящую из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне от 20:1 до 1:1.

RG-I полисахариды, которые используются в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выделены из фруктов, моркови, гороха, цикория или сахарной свеклы посредством водной экстракции, необязательно в комбинации с ферментативной обработкой (с использованием, например, полигалактуроназы).

Другой аспект настоящего изобретения относится к пребиотической композиции, включающей:

* по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества вышеупомянутых RG-I полисахаридов; и

* по меньшей мере 1 мас.% сухого вещества одного или более пребиотиков, выбираемых из лактулозы, инулина, фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, олигосахаридов молока, гуаровой камеди, гуммиарабика и любых их комбинаций.

Еще один аспект изобретения относится к синбиотической композиции, включающей:

* по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества вышеупомянутых RG-I полисахаридов; и

* один или более пробиотических микробных штаммов в форме живых микроорганизмов, неживых микроорганизмов и их комбинаций.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один аспект изобретения относится к пребиотической композиции для применения в способе терапевтического или профилактического лечения заболеваний, ассоциированных с нарушенным составом или функциональностью кишечного микробиома у пациента, расстройство выбирают из метаболического расстройства и дисфункции кишечного барьера, указанное применение включает пероральное введение пребиотической композиции пациенту, где композиция содержит по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества полисахаридов рамногалактуронана I (RG-I), происходящих из фруктов, моркови, гороха, цикория или сахарной свеклы, указанные RG-I полисахариды имеют молекулярную массу более 15 кДа и имеют основу, состоящую из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне от 20:1 до 1:1.

Терминология “расстройства, ассоциированные с нарушенным составом или функциональностью кишечного микробиома”, как используется в настоящем описании, охватывает кишечное дисбиотическое состояние (нарушенный состав) и расстройства, ассоциированные с недостаточной ферментативной продукцией необходимых метаболитов кишечного микробиома (нарушенная функциональность). Короткоцепочечные жирные кислоты (ацетат, пропионат и бутират) являются примером таких необходимых метаболитов.

Термин “кишечное дисбиотическое состояние”, как используется в настоящем описании, относится к состоянию, которое нежелательным образом влияет на состояние здоровья пациента и которое вызвано значительным отклонением от сбалансированного кишечного микробиома (нормобиоз).

Термин “разветвленные полисахариды”, как используется в настоящем описании, относится к полисахаридам, включающим линейную основную цепь из моносахаридных блоков, связанных вместе гликозидными связями, где по меньшей мере один из моносахаридных блоков несет боковую цепь из одного или более гликозидно связанных моносахаридных блоков.

Термины “основная цепь” и “основа” являются синонимами.

Термин “пектиновые полисахариды”, как используется в настоящем описании, относится к необязательно разветвленным полисахаридам, имеющим молекулярную массу более чем 15 кДа и основу, которая состоит из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы.

Термин “цепь”, как используется в настоящем описании, относится к последовательности двух или более гликозидно связанных моносахаридов с основой из полисахарида, за исключением боковых цепей, которые прикреплены к нему.

Термин “домен”, как используется в настоящем описании, относится к цепи плюс любые боковые цепи, которые прикреплены к боковой цепи.

Термин “цепь рамногалактуронана-I” или “RG-I цепь” относится к цепи, состоящей из пар галактуроновой кислоты (GalA) и рамнозы (Rha), где остатки GalA связаны с остатками Rha через положения 1 и 4, тогда как остатки Rha связаны с остатком GalA посредством аномерного и 2-OH положений, т.е. альтернирующих остатков альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты в цепи RG-I могут быть эстерифицированы. Эстерифицированная галактуроновая кислота может появляться в форме метилового эфира или ацетилового эфира.

RG-I домен может включать боковые цепи, такие как, например, галактан, арабинан и арабиногалактан.

Термин “полисахарид рамногалактуронан-I” или “RG-I полисахарид” относится к необязательно разветвленному пектиновому полисахариду, который включает основу, которая содержит одну или более цепей рамногалактуронана-I.

Термин “цепь альфа(l,4)-связанной галактуроновой кислоты” относится к цепи, состоящей из альфа(1→4)-галактуроновых остатков.

Кроме доменов RG-I, RG-I полисахариды по настоящему изобретению могут содержать один или более из следующих доменов:

* гомогалактуронан (HG),

* ксилогалактуронан (XG),

* апиогалактуронан (AG)

* рамногалактуронан-II (RG-II).

Домены XG, AG и RG-II обычно представляют собой только минимальную фракцию RG-I полисахаридов.

HG домены, XG домены, AG и RG-II домены, которые необязательно присутствуют в RG-I полисахаридах по настоящему изобретению, включают основу, которая состоит из линейной цепи или двух или более α-(1-4)-связанных D-галактуроновых кислот. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты в основе указанных доменов могут быть эстерифицированы. Эстерифицированная галактуроновая кислота может появляться в форме метилового сложного эфира или ацетилового сложного эфира.

HG домены не содержат каких-либо боковых цепей.

Основа XG доменов содержит одну или более боковых цепей в форме D-ксилозы.

Основа AG доменов содержит одну или более боковых цепей, которые состоят из одного или более остатков D-апиозы.

Основа RG-II содержит одну или более боковых цепей, которые состоят не исключительно из D-ксилозы или D-апиозы.

Термин “фрукт”, как используется в настоящем описании, относится к семянесущим структурам в цветущих растениях.

Термин “пребиотик”, как используется в настоящем описании, относится к веществам, которые селективно индуцируют рост активности микроорганизмов, которые участвуют в благополучии их хозяина.

Термин “пробиотик”, как используется в настоящем описании, относится к микроорганизмам, которые при пероральном введении в адекватных количествах, обеспечивают здоровье и благополучие. Такие микроорганизмы выбирают из живых микроорганизмов, неживых микроорганизмов, фрагментов микроорганизмов и их комбинаций.

Термин “синбиотик” относится к композиции, которая содержит комбинацию (a) одного или более пребиотиков и (b) одного или более пробиотиков.

Концентрация различных полисахаридов и их моносахаридный состав может быть получен аналитическими методиками, известными специалисту в области техники. После кислого гидролиза, моносахаридный состав может соответственно быть определен посредством Высокоэффективной Анионообменной Хроматографии в комбинации с Амперометрическим определением (HPAEC-PAD).

Распределение размера молекул может быть определено посредством Высокоэффективной Эксклюзионной Хроматографии с использованием определения рефрактивного индекса (RI) (концентрации), определения рассеяния света (определение молекулярной массы), УФ определения (показательное для присутствия белков) и определения дифференциального давления (определение внутренней вязкости).

Вышеупомянутые аналитические методы описаны в: Analytical Biochemistry Vol. 207, Issue 1, 1992, pg 176 (для анализа нейтральных сахаров) и в Mol. Nutr. Food Res., Vol 61, Issue 1, 2017, 1600243 (для анализа галактуроновой кислоты и распределения размера молекул).

Все проценты, упомянутые в настоящем описании, если не указано иначе, относятся к процентам по массе.

Пациентом, которому перорально вводят композицию, содержащую RG-I полисахариды, по настоящему изобретению предпочтительно является млекопитающее, более предпочтительно человек. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения пациентом человеком является младенец (<4 лет) все еще в состоянии развития ядерной взрослой микробиоты, или пожилой человек (>50 лет) с риском потери разнообразия и стойкости его ядерной взрослой микробиоты.

Пероральное введение в контексте настоящего способа лечения охватывает самостоятельное применение.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, пациент, который получает пероральное введение композиции, включающей RG-I полисахариды, страдает от или имеет риск развития метаболического расстройства. Наиболее предпочтительно пациент страдает от метаболического расстройства.

Метаболические расстройства, которые успешно лечат (терапевтически или профилактически) с помощью настоящего лечения, включают избыточную массу, ожирение, метаболический синдром, дефицит инсулина или расстройства, связанные с инсулинорезистентностью, сахарный диабет 2 типа, нарушение толерантности к глюкозе, нарушение метаболизма липидов, гипергликемия, стеатоз печени, дислипидемия, высокий холестерин, повышенные триглицериды. Настоящее лечение является особенно подходящим для терапевтического или профилактического лечения избыточной массы тела или ожирения и инсулинорезистентности.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения пациент страдает от или имеет риск развития дисфункции кишечного барьера. Более предпочтительно пациент страдает от дисфункции кишечного барьера.

Кишечный барьер или кишечный слизистый барьер относится к способности слизистой оболочки кишечника, которая обеспечивает адекватное содержание нежелательного содержимого просвета в кишечнике, при этом сохраняя способность абсорбции питательных веществ. Разделение, которое он обеспечивает между организмом и содержимым просвета кишечника, предотвращает неконтролируемую транслокацию содержимого просвета в организм. Его роль в защите слизистых оболочек и циркуляторной системы от воздействия провоспалительных патогенов, токсинов и антигенов является жизненно важной для поддержания здоровья и благополучия. Дисфункция кишечного барьера вовлечена во множество состояний здоровья, такие как: пищевые аллергии, микробные инфекции, синдром раздраженного кишечника, воспалительные заболевания кишечника, целиакия, метаболический синдром, неалкогольная жировая болезнь печени, диабет и септический шок.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, пребиотическую композицию используют для терапевтического или профилактического лечения кишечного дисбиотического состояния.

Пациентом, получающим лечение кишечного дисбиотического состояния в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно является пациент, страдающий от или имеющий риск развития патогенного кишечного дисбиотического состояния, наиболее предпочтительно пациент, страдающий от такого патогенного кишечного дисбиотического состояния. Здесь “патогенный” обозначает, что состояние способно вызывать или ухудшать болезнь.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, пребиотическую композицию используют для увеличения кишечной ферментативной продукции короткоцепочечных жирных кислот.

Полисахариды RG-I, которые используются в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно происходят из растительного источника, выбираемого из яблока, болгарского перца, черники, моркови, цитрусовых, винограда, гороха, цикория, сахарной свеклы и оливок, бамии и их комбинации. Еще более предпочтительно полисахариды RG-I, происходящие из растительного источника, выбирают из яблока (например, яблочного жмыха), болгарского перца, моркови, кожуры цитрусовых, винограда, цикория, сахарной свеклы (например, свекловичной пульпы), оливок (например, оливкового жмыха), бамии и их комбинаций. Наиболее предпочтительно полисахариды RG-I происходят из моркови или яблок.

Полисахариды RG-I предпочтительно включают в пребиотическую композицию в форме изолята пектинового полисахарида, который обогащен RG-I полисахаридами. Соответственно, в особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения RG-I полисахариды составляют по меньшей мере 20 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 40 мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 мас.% пектиновых полисахаридов, присутствующих в пребиотической композиции.

RG-I полисахариды имеют основу, которая включает цепи рамногалактуронана и необязательно цепи альфа(1,4)-связанной гомо-галактуроновой кислоты. Молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне от 20:1 до 1:1. Предпочтительно молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты к остаткам рамнозы в RG-I полисахаридах варьируется от 15:1 до 1:1, более предпочтительно от 12:1 до 1:1, еще более предпочтительно от 10:1 до 1:1, наиболее предпочтительно от 9:1 до 1:1.

Предпочтительно, остатки рамнозы представляют собой 3-50%, более предпочтительно 5-50% и наиболее предпочтительно 10-50% остатков моносахаридов в основе RG-I полисахаридов.

Остатки рамнозы обычно представляют 3-50%, более предпочтительно 3,5-40% и наиболее предпочтительно 4-35% всех моносахаридных остатков в RG-I полисахаридах, т.е. включая моносахаридные остатки, которые содержатся в боковых цепях.

Остатки галактуроновой кислоты обычно составляют 50-97%, более предпочтительно 50-95% и наиболее предпочтительно 50-90% моносахаридных остатков в основе RG-I полисахаридов.

Остатки галактуроновой кислоты обычно составляют 10-80%, более предпочтительно 15-70% и наиболее предпочтительно 20-65% всех моносахаридных остатков, содержащихся в RG-I полисахаридах, т.е. включая моносахаридные остатки, которые содержатся в боковых цепях.

RG-I полисахариды обычно имеют молекулярную массу по меньшей мере 20 кДа. Предпочтительно RG-I полисахариды имеют молекулярную массу от 25 кДа до 2000 кДа, более предпочтительно от 30 кДа до 1500 кДа, еще более предпочтительно от 35 кДа до 1200 кДа, наиболее предпочтительно от 40 кДа до 1000 кДа.

Средняя молекулярная масса RG-I полисахаридов, которые содержатся в настоящей композиции, предпочтительно превосходит 30 кДа, более предпочтительно превосходит 40 кДа и наиболее предпочтительно превосходит 60 кДа.

Предпочтительно, менее чем 85% остатков галактуроновой кислоты в RG-I полисахаридах являются эстерифицированными в форме метилового эфира. Более предпочтительно RG-I полисахариды имеют такую степень эстерификации от 0% до 70%, более предпочтительно от 0% до 60%, еще более предпочтительно от 0% до 55%, наиболее предпочтительно от 0% до 50%.

Предпочтительно, 0-95% остатков галактуроновой кислоты в RG-I полисахаридах являются эстерифицированными в форме ацетилового эфира. Более предпочтительно RG-I полисахариды имеют такую степень эстерификации от 5% до 90%, более предпочтительно от 7% до 50%, наиболее предпочтительно от 8% до 30%.

Основа RG-I полисахаридов состоит из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы. Если RG-I полисахариды включают одну или более боковых цепей, полисахарид может дополнительно содержать остатки арабинозы и/или галактозы. Более того, боковые цепи RG-I полисахарида могут обеспечивать минимальные количества остатков мономеров фукозы, глюкозы, глюкуроновой кислоты, ксилозы и/или уроновой кислоты. Одну или более боковых цепей предпочтительно выбирают из галактановых боковых цепей, арабинановых боковых цепей и арабиногалактановых боковых цепей.

Арабинановая боковая цепь включает по меньшей мере один или более остаток альфа(1,5)-связанной арабинозы и является замещенным в положении 4-OH остатком рамнозы в домене RG-I. Арабинановая боковая цепь может быть линейной или разветвленной. В случае, когда боковая цепь является линейной, боковая цепь состоит из остатков альфа (1,5)-связанной арабинозы. В случае, когда арабинановая боковая цепь является разветвленной боковой цепью, один или более остатков альфа-арабинозы связаны с 2-OH и/или 3-OH альфа(1,5)-связанных арабиноз. Длина арабинановой боковой цепи (выражаемая, как количество мономерных единиц) предпочтительно составляет от 1 до 100 мономерных единиц, более предпочтительно от 1 до 50 единиц, еще более предпочтительно от 1 до 30 единиц.

Галактановая боковая цепь включает по меньшей мере один или более остатков бета (1,4)-связанной галактозы и является замещенной в положении 4-OH остатком рамнозы в домене RG-I.

Галактановая боковая цепь предпочтительно является по существу линейной (неразветвленной), т.е. менее чем 10 моль% остатков галактозы в цепи являются остатками бета(1,3)-связанной или бета (1,6)-связанной галактозы, предпочтительно менее чем 5 моль%, предпочтительно менее чем 2 моль%, предпочтительно менее чем 1 моль%. Длина галактановой боковой цепи предпочтительно составляет от 1 до 100 мономерных единиц, более предпочтительно от 1 до 50 единиц, еще более предпочтительно от 1 до 30 единиц.

Арабиногалактановая боковая цепь замещена в положении 4-OH остатком рамнозы в домене RG-I и может быть типом I арабиногалактана (AGI) или типом II арабиногалактана AGII). AGI состоит из (1→4)-β-D-Galp основы, на которой могут иметь место замещения мономерными Galp единицами в положении O-6 или O-3. AGI является дополнительно замещенной остатками α-L-Araf-p и/или короткими боковыми цепями (1→5)-α-L-Araf. AGII состоит из основы α(1→3)-β-D-Galp, снабженной вторичными цепями (1→6)-β-D-Galp, которые являются арабинозилированными.

Предпочтительно молярное отношение остатков арабинозы к остаткам рамнозы в RG-I полисахариде не превосходит 30:1, более предпочтительно не превосходит 15:1, еще более предпочтительно оно не превосходит 8:1 и наиболее предпочтительно оно не превосходит 5:1.

Молярное соотношение остатков галактозы к остаткам рамнозы в RG-I полисахариде предпочтительно не превосходит 30:1, более предпочтительно не превосходит 15:1, еще более предпочтительно не превосходит 8:1 и наиболее предпочтительно не превосходит 5:1.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения по меньшей мере 20% остатков рамнозы в RG-I цепях являются замещенными в 4-OH положении. Более предпочтительно по меньшей мере 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере 40%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 45% остатков рамнозы являются замещенными в 4-OH положении. Предпочтительно максимально 90%, более предпочтительно максимально 80% таких остатков рамнозы являются замещенными в 4-OH положении.

Пребиотическая композиция для применения в настоящем способе предпочтительно содержит по меньшей мере 0,2%, более предпочтительно 0,3-10% и наиболее предпочтительно 0,4-5 мас.% сухого вещества RG-I полисахаридов, как описано в настоящем описании.

Пребиотическая композиция для применения в настоящем способе преимущественно содержит один или более пребиотиков, кроме RG-I полисахаридов. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере 1 мас.% сухого вещества, более предпочтительно по меньшей мере 3 мас.% сухого вещества одного или более пребиотиков, выбираемых из лактулозы, инулина, фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, молочных олигосахаридов, гуаровой камеди и гуммиарабика.

Считают, что RG-I полисахариды являются особенно эффективными в настоящем способе лечения, если они более не запутываются в матрице материала клеточной стенки. Соответственно в определенном предпочтительном варианте осуществления изобретения RG-I полисахариды, содержащие композицию по настоящему изобретению, содержат по меньшей мере 0,05 мас.% сухого вещества, более предпочтительно по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,2 мас.% сухого вещества и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,3 мас.% сухого вещества легко растворимых в воде RG-I полисахаридов. Концентрация легко растворимых в воде RG-I полисахаридов в RG-I полисахарид-содержащей композиции, может быть определена посредством смешивания 100 мл деминерализованной воды (20°C) с достаточным количеством RG-I полисахарид-содержащей композиции для получения 2,5 грамм сухого вещества с последующим перемешиванием в течение 5 минут и фильтрацией через 100 мкм фильтр. RG-полисахариды в фильтрате представляют собой легко растворимые в воде RG-I полисахариды.

В соответствии с определенным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения настоящую композицию вводят пациенту перорально в течение периода по меньшей мере 2 дня в количестве, обеспечивающем по меньшей мере 1 мг RG-I полисахаридов на кг массы тела в сутки. Более предпочтительно количество по меньшей мере 4 мг RG-I полисахаридов на кг массы тела, еще более предпочтительно по меньшей мере 15 мг/кг массы тела в сутки, наиболее предпочтительно по меньшей мере 20-100 мг/кг RG-I полисахаридов на кг массы тела в сутки обеспечивают в течение периода по меньшей мере 7 дней, наиболее предпочтительно в течение периода по меньшей мере 14 дней, посредством введения композиции, содержащей RG-I полисахариды.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения композицию, содержащую RG-I полисахариды, вводят пациенту в перорально течение периода по меньшей мере 21 день, для обеспечения RG-I полисахаридов в количестве по меньшей мере 4 мг RG-I полисахаридов на кг массы тела в сутки, более предпочтительно 15-300 мг RG-I полисахаридов на кг массы тела в сутки.

Обнаружили, что пребиотическая композиция по настоящему изобретению способна индуцировать рост кишечных микроорганизмов, которые способны обеспечивать пользу для здоровья, а именно Akkermansia muciniphila и Bifidobacterium spp. Соответственно, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, включающая RG-I полисахариды, способна индуцировать рост или активность Akkermansia muciniphila и/или Bifidobacterium spp. в кишечной микробиоте пациента. Наиболее предпочтительно композиция способна индуцировать рост или активность Akkermansia muciniphila в кишечной микробиоте пациента.

Обнаружили, что пребиотическая композиция по настоящему изобретению способна индуцировать продукцию короткоцепочечных жирных кислот кишечной микробиотой, тогда как это сопровождается существенно меньшей продукцией газа по сравнению с классическими пребиотиками, такими как инулин. Соответственно, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая RG-I полисахариды, способна усиливать кишечную ферментативную продукцию короткоцепочечных жирных кислот с меньшими побочными эффектами, такими как кишечный дискомфорт, вздутие и рвота, ассоциированные с быстрой продукцией газа.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения композицию выбирают из напитка, пероральной лекарственной формы, порошка, батончика и спреда.

Напитком обычно является жидкость. Предпочтительно напиток содержит по меньшей мере 80 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 85 мас.% воды. Напиток предпочтительно содержит по меньшей мере 1,5 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 3 г/л и наиболее предпочтительно 5-200 г/л RG-I полисахаридов.

Пероральная лекарственная форма предпочтительно представляет собой капсулу или таблетку. Пероральная лекарственная форма предпочтительно имеет массу в диапазоне от 50 до 1500 миллиграмм, более предпочтительно от 100 до 800 миллиграмм. Пероральная лекарственная форма предпочтительно содержит по меньшей мере 1 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 20 мас.% и наиболее предпочтительно 40-90 мас.% RG-I полисахаридов.

Композиция в форме порошка предпочтительно является водорастворимым порошком, который может быть использован для получения напитка. Обычно порошок содержит по меньшей мере 0,5 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 5 мас.% и наиболее предпочтительно 10-75 мас.% RG-I полисахаридов.

Композиция в форме батончика предпочтительно является батончиком, предпочтительно батончик имеет массу в диапазоне от 10 до 200 грамм, более предпочтительно от 25 до 100 грамм. Батончик обычно содержит по меньшей мере 0,1 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мас.% и наиболее предпочтительно 1-20 мас.% RG-I полисахаридов.

Композиция в форме спреда предпочтительно представляет собой эмульсию типа вода-в-масле, предпочтительно эмульсию типа вода-в-масле, включающую 20-90 мас.% жировой фазы и 10-80 мас.% водной фазы. Спред предпочтительно содержит по меньшей мере 0,3 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 1-10 мас.% и наиболее предпочтительно 1,5-16 мас.% RG-I полисахаридов.

Другой аспект настоящего изобретения относится к пребиотической композиции, включающей:

* по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества RG-I-полисахаридов, как определено в настоящем описании ранее; и

* по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 3 мас.% сухого вещества одного или более пребиотиков, выбираемых из лактулозы, инулина, фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, молочных олигосахаридов, гуаровой камеди и гуммиарабика.

Еще более предпочтительно продукт содержит по меньшей мере 1 мас.% сухого вещества, более предпочтительно по меньшей мере 3 мас.% сухого вещества одного или более пребиотиков, выбираемых из лактулозы, инулина, фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов и молочных олигосахаридов.

Предпочтительные варианты осуществления пребиотической композиции такие же, как описано в настоящем описании ранее в отношении пребиотической композиции для применения в настоящем способе лечения.

Еще один аспект изобретения относится к синбиотической композиции, включающей:

* по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества RG-I-полисахаридов, как определено в настоящем описании ранее; и

* один или более пробиотических микробных штаммов в форме живых микроорганизмов, неживых микроорганизмов, фрагментов микроорганизмов и их комбинаций.

Предпочтительные варианты осуществления синбиотической композиции являются такими же, как описано в настоящем описании ранее в отношении пребиотической композиции для применения в настоящем способе лечения.

Один или более пробиотических микробных штаммов предпочтительно являются живыми микробными штаммами, более предпочтительно живыми бактериальными штаммами.

Один или более пробиотических микробных штаммов могут быть выбраны из штаммов дрожжей, грибковых штаммов, штаммов бактерий и их комбинаций. Примеры подходящих штаммов дрожжей включают штаммы, принадлежащие к Saccharomyces, Debaromyces, Candida Pichia и их комбинациям. Примеры подходящих грибковых штаммов включают штаммы, принадлежащие к Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и их комбинации. Примеры подходящих штаммов бактерий включают штаммы, принадлежащие к Bifidobacterium, Bacteroides, Fusobacterium, Melissococus, Propionibacterium, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Faecalibacterium, Akkermansia, Oenococcus, Lactobacillus, Allobaculum, Eubacterium и их комбинации.

В соответствие с особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения один или более пробиотических микробных штамма выбирают из Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus (Streptococcus) faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. Casei, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp. Lactis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus halophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis, Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia hominis, и Eubacterium hallii.

Синбиотическая композиция предпочтительно содержит один или более пробиотических микробных штаммов в концентрации от 10⁴ до 10¹⁰ КОЕ, или их эквивалент в случае пробиотических микробных штаммов, применяемых в неживой форме. Более предпочтительно, симбиотическая композиция содержит один или более пробиотических микробных штаммов в концентрации от 10⁵ до 10⁹ КОЕ или их эквиваленте.

Akkermansia muciniphila предпочтительно содержится в синбиотической композиции в концентрации от 10⁵ до 10¹⁰ КОЕ/грамм, более предпочтительно от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/грамм.

Bifidobacterium spp. предпочтительно содержится в синбиотической композиции в концентрации от 10⁶ до 10¹⁰ КОЕ/грамм, более предпочтительно от 10⁷ до 10⁹ КОЕ/грамм.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Фракцию RG-I полисахаридов выделяли из сухого порошка болгарского перца (Paprika Mild 80-100 Atsa Steamtr- Felix Reverte S.A.) в экспериментальной установке с использованием методики, описанной ниже.

Материал болгарского перца (100 кг) промывали три раза при аккуратном перемешивании с 80% водным этанолом, т.е. два раза при 80°C в течение 2 часов и затем в течение ночи при комнатной температуре; каждый раз с использованием 12,5% (масс/об), для удаления растворимого материала этанола. Нерастворимый остаток этанола восстанавливали каждый раз центрифугированием (1000 G в течение 10 мин). Нерастворимый остаток этанола, полученный после 3 циклов промывки сушили и 90 кг экстрагировали дважды с помощью 1000 л горячей воды, имеющей температуру 95°C в течение 90 минут. Каждый раз надосадочную жидкость удерживали после центрифугирования при 1000 G в течение 10 минут. Собранную надосадочную жидкость впоследствии фильтровали через ткань и ультрафильтровали с использованием ограничивающих мембран молекулярной массы 2 КДа для удаления низкомолекулярного материала. Сухой экстракт, обогащенный RG-I, получали посредством лиофилизации ультраконцентрата, получая приблизительно 5 кг сухого экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами.

Характеристика экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами

Распределение молекулярной массы:

Распределение молекулярной массы полисахаридных образцов определяли высокоэффективной эксклюзионной хроматографией с использованием определения индекса рефракции (RI) (концентрации), определения рассеяния света (определение молекулярной массы), определения УФ (показательный для присутствия белков) и определения дифференциального давления (определение внутренней вязкости). Стандарты молекулярной массы пуллулана использовали для калибровки.

Композиция моносахаридов:

Полисахаридные образцы растворяли в 0,5 M водной трифторуксусной кислоте и гидролизовали при 120°C в течение 2 часов. Затем образцы нейтрализовали NaOH, и хранили замороженными до анализа посредством анионообменнной хроматографии с высоким рН (HPAEC) с использованием пульсового амперометрического определения (PAD). Уроновую кислоту в образцах определяли с использованием колориметрического анализа м-гидроксидифенила (Achmed & Labavitch, J. Food Biochem, 1978, 361)), автоматизированного на аутоанализаторе (Skalar)

Степень эстерификации

Полисахаридные образцы обрабатывали гидроксидом натрия (0,25 M, 5 ч, 20°C) и затем нейтрализовали. Высвободившийся метанол измеряли, как поглощение при 420 нм, после инкубации с этанолоксидазой в комбинации с проявителем (ацетилацетон и уксусная кислота в 2M ацетата аммония). Высвободившуюся уксусную кислоту определяли с использованием набора анализа уксусной кислоты K-ACETAF (Megazyme). Пектин сахарной свеклы с известной степенью метилирования и ацетилирования использовали в качестве стандарта. Степень эстерификации выражали, как молярное количество метанола и уксусной кислоты, высвобожденное как процент количества уроновой кислоты.

Молекулярные характеристики фракции RG-I полисахаридов показаны в таблицах 1а и 1b.

Таблица 1a

Моносахариды (% моль/моль) Красный болгарский перец Rha (рамноза) 5,0 GalA (Галактуроновая кислота) 70,0 Ara (Арабиноза) 9,0 Gal (Галактоза) 9,0 Glc (Глюкоза) 3,0 Xyl (ксилоза) 2,0

Таблица 1b

Молекулярные соотношения Красный болгарский перец GalA/Rha 14 Ara/Rha 1,8 Gal/Rha 1,8 Степень метилирования, % 39 Степень ацетилирования, % 9,0

Пример 2

Шестимесячным без специфических патогенов самкам мышей C57BL/6 давали по потребности стерилизованную питьевую воду и полусинтетическое облученное питание AIN-93G (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, The Netherlands) с 30 ммоль/кг кальция (неинфицированная и инфицированная группа) или то же самое питанием, дополненное 1% (масс/масс) RG-I обогащенного экстракта из болгарского перца.

Мышей случайно распределяли на группы лечения и размещали по 3 мыши на клетку в течение 2 недель и затем отдельно в течение еще одной недели. Состав питания AIN-93G описан Reeves et al. (AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr (1993)123: 1939-1951).

Фекалии собирали до диетического вмешательства исходно и после 3 недель диетического вмешательства. Геномную ДНК экстрагировали из образцов фекалий следуя протоколу производителя (Zymo research). Выделенную гДНК подвергали микробной идентификации посредством секвенирования гена 16S рРНК. Специфические праймеры использовали для ПЦР амплификации интересующего геномного участка, как V3-V4 или V4 гипервариабельные участки гена 16S рРНК. Считывания последовательностей с парными концами получали с использованием системы Illumina MiSeq. FASTQ файлы последовательностей создавали с использованием Illumina Casava pipeline версии 1.8.3. Исходная оценка качества основана на фильтрации Illumina Chastity. Впоследствии считывания, содержащие контрольный сигнал PhiX, удаляли с использованием внутреннего протокола фильтрации (Baseclear). Кроме того, считывания, содержащие (частичные) адапторы клипировали (до минимальной длины считывания 50н.п.). Вторая оценка качества была основана на оставшихся считываниях с использованием средства контроля качества FASTQC версия 0.10.0.

Секвенирование бактериальной ДНК

Данные Illumina Miseq анализировали с помощью поточной схемы, использующей магистраль Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME, v8) (Caporaso et al., QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data, Nature Methods (2010), 7(5), 335-336 and Edgar, Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST, Bioinformatics (Oxford, England), (2010), 26(19), 2460-2461. Данные извлекали и фильтровали для несоответствующих штрихкодов и мелких фрагментов (>50нт). Выделение с открытой рамкой OTU проводили в QIIME с использованием базы данных Silva 111, и химеры определяли посредством USEARCH и фильтровали из OTU. Из отфильтрованных OTU создавали биомный файл и файл филогенетического дерева с использованием базы данных Silva 111. Следующие исходы получали посредством QIIME, такие как, например, фильтрованные считывания на образец, оценку разнообразия цельного дерева PD и таксономическое распределение уровня 1-6 с относительной обогащенностью.

Влияние экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами, на микробный состав

Отдельные образцы фекалий 12 мышей на группу подвергали секвенированию 16S рРНК Illumina для получения дополнительных данных по микробному составу. На образец получали от 26×10³ до 79×10⁴ считываний. Результаты показаны в таблицах 2, 3 и 4.

Таблица 2

Обогащенность % Соотношение Firmicutes/ Bacteriodetes Firmicutes Bacteriodetes Исходный контроль 0,459±0,184 0,436±0,144 1,336±1,059 RG-I исходно 0,554±0,117 0,381±0,089 1,596±0,684 Контроль 3 нед 0,489±0,225 0,361±0,235 1,350±1,459 RG-I исходно 0,502±0,190 0,178±0,124* 4,239±2,648*

* Обозначает значимость относительно RG-I исходно

Таблица 3

Обогащение % Actinobacteria Verrucomicrobia Исходный контроль 0,083±0,080 0,000±0,000 RG-I исходно 0,036±0,044 0,002±0,006 Контроль 3 нед 0,071±0,084 0,002±0,006 RG-I исходно 0,231±0,159* 0,036±0,022*

* Обозначает значимость относительно RG-I исходно

Таблица 4

Обогащение % Bifidobacterium Akkermansia Исходный контроль 0,003±0,001 0,000±0,000 RG-I исходно 0,001±0,001 0,002±0,006 Контроль 3 нед 0,028±0,060 0,002±0,006 RG-I исходно 0,134±0,110* 0,041±0,027*

* Обозначает значимость относительно RG-I исходно

На уровне типа добавление экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами, в питании достоверно увеличивало обогащенность Actinobacteria и Verrucomicrobia, тогда как обогащенность Bacteroidetes и Proteobacteria снижалась (>0,5% обогащенность; Wilcoxon, P<0,05) приводя к увеличенному соотношению Firmicutes/Bacteroidetes.

На уровне рода анализ избытка показал, что добавление экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами, в питание оказывало значительное влияние на микробный состав (P<0,05; Monte Carlo преобразование). Включение экстракта, обогащенного RG-I полисахаридами, в питание приводит к более высокой обогащенности Bifidobacterium (Phylum Actinobacteria), Allobaculum (Phylum Firmicutes), Akkermansia (Phylum Verrucomicrobia) и группами неопределенных бактерий.

Пример 3

Неперевариваемые полисахариды главным образом перевариваются в толстом кишечнике человека при помощи кишечной микробиоты. Это может приводить к росту полезных для здоровья бактерий, снижению pH, увеличению резистентности к кишечным патогенам и модуляции метаболической активности микробиоты. Полезные (пребиотические) функциональные углеводы обеспечат продукцию полезных для здоровья метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA, т.е. ацетат, пропионат и бутират) при уменьшении продукции нежелательных метаболитов метаболизма белка, как разветвленные SCFA и аммиак.

Растительные экстракты полисахаридов тестировали в отношении их воздействия на метаболическую активность микробиоты с использованием установленной краткосрочной модели толстокишечной инкубации.

В начале инкубации основную толстокишечную среду без сахара, содержащую питательные вещества, которые присутствуют в толстой кишке (например, гликаны хозяина, такие как муцин), вводили в 70 мл бутыли пенициллина, уже содержащие тестируемые экстракты (5 г/л конечной концентрации). Бутыли закрывали резиновыми пробками и получали анаэробиоз посредством пропускания N₂. Впоследствии, инокулят человеческих фекалий получали посредством смешивания свежесобранного образца фекалий с анаэробным фосфатным буфером. После гомогенизации и удаления частиц посредством центрифугирования (2 мин, 500 g) инокулят фекалий добавляли в различные бутыли. В этот момент начинали инкубацию в течение периода 48 ч в течение которых температуру устанавливали на 37°C и обеспечивали непрерывное перемешивание с помощью смесителя (90 об/мин). Образцы получали через 6, 24 и 48 ч инкубации для анализа pH (Senseline F410; ProSense, Oosterhout, The Netherlands), давления газа (Hand-held pressure indicator CPH6200; Wika, Echt, The Netherlands) и SCFA. SCFA, будучи ацетатом, пропионатом, бутиратом и разветвленным SCFA (изобутират, изовалерат и изокапроат), измеряли, как описано De Weirdt et al (Human faecal microbiota display variable patterns of glycerol metabolism, FEMS Microbiol. Ecol. 2010, 74, 601-611.).

Среду толстой кишки без сахара и инулин, хорошо известный пребиотик (Beneo, DP ≥23, ~100% инулин), использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно.

Образец A получали из порошка болгарского перца (Paprika poeder, Natural Spices Mijdrecht, the Netherlands) посредством водной экстракции (10% масс/масс, 2ч 90°C), центрифугирования для удаления нерастворимых остатков, фильтрации (отсечка 40 кДа) для удаления мелких молекул и сушки для получения порошка.

Образец B получали из высушенной морковной выжимки, остатка продукции морковного сока (порошок волокон моркови, GreendFields, Poland). Образец B получали водной экстракцией (10% масс/масс 2 ч 45°C) с использованием пектиназы (Pectinex® Ultra Mash, Novozymes), тепловой инактивации (90°C, 10 мин), удаления нерастворимых остатков посредством слива и ультрафильтрации (отсечка 40 кДа) и наконец сушки.

Образец C экстрагировали из порошка яблочного жмыха (яблочный жмых, GreendFields, Poland) таким же образом, как образец B.

Образец D получали из порошка бамии (Ground Okra, My Foods, Blue mountain peak, UK) с использованием экстракции горячей водой (10% масс/масс, 2 ч при 90°C), диализа против воды в течение нескольких часов для удаления низкомолекулярного материала. Диализированный экстракт затем лиофилизировали.

Определение моносахаридного состава вышеупомянутых образцов проводили, как описано для примера 1. Результаты показаны в таблице 5.

Таблица 5

Источник А В С D Болгарский перец Морковь Яблоко Бамия Rha (рамноза) %моль/моль 8 17 8 31 GalA (галактуроновая кислота) %моль/моль 50 23 18 40 Ara (арабиноза) %моль/моль 13 23 48 1 Gal (галактоза) %моль/моль 14 33 9 22 Glc (глюкоза) %моль/моль 9 2 6 0 Xyl (ксилоза) %моль/моль 3 2 6 0 Всего 98 100 99 100 GalA/Rha 6,0 1,4 2,2 1,3 Ara/Rha 1,5 1,4 5,7 0,0 Gal/Rha 1,7 1,9 1,1 0,7 % метилирования 39 16 27 Н.д.

Результаты экспериментов инкубации показаны в таблице 6.

Таблица 6

Среда Инулин А В С D Болгарский перец морковь яблоко бамия Снижение рН 0,01 0,66 0,39 0,63 0,64 0,52 Продукция SCFA мМ 27,8 51,1 49,3 56,4 55,6 52,9 Продукция газа кПа 28,6 86,5 47,9 49,5 57,2 57,1 Разветвленные SCFA мМ 2,8 1,2 1,9 1,3 1,1 1,7 Аммиак Мг/л 373 169 346 221 214 287

Результаты показывают, что все четыре растительных экстракта RG-I полисахаридов легко ферментировались кишечной микробиотой.

Все экстракты RG-I полисахаридов увеличивали продукцию SCFA. Фактически все экстракты увеличивали продукцию SCFA до уровня, сходного с или превосходящего уровень, наблюдаемого для инулина.

Все экстракты RG-I полисахаридов снижали продукцию разветвленных SCFA и аммиака. Неожиданно продукция газа, наблюдаемая для всех экстрактов RG-I полисахаридов, была по существу ниже, чем продукция газа, наблюдаемая для инулина. Избыточная продукция газа может приводить к дискомфорту в животе и вздутию, хорошо известному нежелательному побочному эффекту большинства классических пребиотиков, включая инулин.

Пример 4

Пастеризованный молочный напиток получали на основании рецепта, показанного в таблице 7.

Таблица 7

Мас.% Молочный жир 1 Защелаченный какао 0,1 Сахароза 3 RG-I полисахаридный изолят ¹ 2 Инулин 2 Каррагенан 0,01 Высокоацильный геллан 0,05 гидроксипропилкрахмал 0,2 Карбоксиметилцеллюлоза 0,1 Снятое молоко остальное

¹ выделенный из высушенного жмыха моркови (см. пример 3)

Потребление 200 мл такого молочного напитка в день взрослым человеком улучшает здоровье кишечника и обеспечивает экстра защиту против простуды и гриппа.

Пример 5

Питательный батончик (45 г) получали на основании рецепта, показанного в таблице 8.

Таблица 8

Мас.% Мальтодекстрин 12,9 Изолят молочного белка 9,0 Изолят соевого белка 0,5 Рисовая мука 5,3 Ржаные отруби 14,4 Рисовые хлопья 9,0 Кристаллическая фруктоза 6,8 Сироп выпаренного сахарного тростника 27,7 соль 0,3 глицерин 1,0 Миндальное масло 3,3 Изолят RG-I полисахаридов ¹ 4,5 Инулин 1 Витаминно/минеральная смесь 3,1 ваниль 1,2

¹ выделенный из высушенного жмыха моркови (см. пример 3)

Батончик получали как указано далее: все влажные ингредиенты смешивали вместе (сироп, глицерин, миндальное масло и ароматизаторы) при 50°C.

Отдельно сухие ингредиенты смешивали вместе, затем влажную суспензию добавляли к сухой смеси и массу перемешивали в течение 2-5 минут при высоком сдвиге. Тесто выкладывали плитками и нарезали по форме батончиков перед упаковкой.

Потребление 2 батончиков в сутки взрослым человеком улучшает здоровье кишечника и обеспечивает экстра защиту против обычной простуда и гриппа.

Пример 6

Пищевую добавку получали в форме капсулы, содержащей сухую смесь, показанную в таблице 9.

Таблица 9

мг Изолят RG-I полисахаридов¹ 300 D-альфа токоферол 10 Олигомерный проантоцианидин 15 Витамин В1 1,4 Витамин В2 1,6 Ниацин (витамин В3) 18,0 Пантотеновая кислота (витамин В5) 6,0 Витамин В6 2,0 Витамин В12 1,0 Фолиевая кислота (витамин В9) 0,2 Биотин 0,15 Микрокристаллическая целлюлоза 30

¹ выделенный из высушенного жмыха моркови (см. пример 3)

Пример 7

Фракции RG-I полисахаридов экстрагировали из различных материалов источника для исследования в краткосрочной модели инкубации в толстой кишке, описанной в примере 3. Толстокишечную среду без сахара и инулин, хорошо известный пребиотик (Beneo, DP ≥23, ~100% инулин), использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно.

Образец A получали из высушенной и измельченной кожуры гороха (ex Cosucra, Warcoing, Belgium). Порошок диспергировали в деминерализованной воде (100 г/л) и подвергали ферментативному пре-гидролизу с термостабильной альфа-амилазой (Megazyme) при 90°C в течение 30 мин и дополнительному гидролизу с помощью пектиназы (2 ч 45°C, 0,2 об/об% Pectinex® Ultra Mash, Novozymes). Ферментацию заканчивали посредством нагревания при 100°C в течение 10 мин, с последующим центрифугированием (18000 g, 10 мин) и обширным диализом надосадочной жидкости с использованием мембраны отсечки 12-14 кДа (Visking, London, UK). Материал затем лиофилизировали.

Образец B получали с использованием того же способа из высушенного и измельченного жмыха сахарной свеклы (ex Suiker Unie, Dinteloord, NL), за исключением стадии пре-инкубации α-амилазы.

Образец C получали с использованием того же метода из высушенного и измельченного жмыха цикория (ex Cosucra, Warcoing, Belgium), за исключением стадии пре-инкубации α-амилазы.

Состав моносахаридов вышеупомянутых образцов определяли с использованием способа, описанного в примере 1. Результаты показаны в таблице 10.

Таблица 10

Источник А В С Горох Сахарная свекла Цикорий Rha (рамноза) % моль/моль 8 7 8 GalA (галактуроновая кислота) % моль/моль 57 40 35 Ara (Арабиноза) % моль/моль 14 45 48 Gal (Галактоза) % моль/моль 6 7 8 Glc (Глюкоза) % моль/моль 8 1 1 Xyl (Ксилоза) % моль/моль 6 0 0 Всего GalA/Rha 7,1 5,7 4,4 Ara/Rha 1,8 6,4 6,0 Gal/Rha 0,8 1,0 1,0 % метилирования 33 26 27

Результаты эксперимента инкубации показано в таблице 11.

Таблица 11

Среда Инулин А В С Горох Сахарная свекла Цикорий Снижение рН 0,00 0,61 0,47 0,62 0,66 Продукция SCFA мМ 27,5 59,7 61,3 66,4 61,7 Продукция газа кПа 31,9 87,6 62,6 70,0 74,6 Разветвленные SCFA мМ 3,4 0,5 3,0 3,0 1,9 Аммиак Мг/л 362 181 316 293 228

Полученные результаты показывают, что такие экстракты RG-I полисахаридов, полученные из различных растений, легко ферментировались кишечной микробиотой.

Все экстракты RG-I полисахаридов увеличивали продукцию SCFA. Фактически было обнаружено, что все экстракты увеличивали продукцию SCFA до уровня, сходного с или выше уровня, полученного для инулина.

Все экстракты RG-I полисахаридов снижали продукцию разветвленных SCFA и аммиака по сравнению с контрольной средой.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и может быть использована для терапевтического или профилактического лечения расстройства, ассоциированного с нарушением кишечного микробиома у пациента. Предложено применение рамногалактуронан-I (RG-I) полисахаридов в получении пребиотической композиции для терапевтического или профилактического лечения заболеваний, которые выбирают из избыточной массы, ожирения, инсулинорезистентности и дисфункции кишечного барьера, где композиция включает по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества RG-I полисахаридов, происходящих из фруктов, моркови, гороха, цикория, сахарной свеклы, бамии или их комбинаций, причем указанные RG-I полисахариды имеют молекулярную массу более 15 кДа и имеют основу, состоящую из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне 20:1-1:1. Предложена также синбиотическая композиция, включающая по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества указанных рамногалактуронана I (RG-I) полисахаридов и 10⁴-10¹⁰ КОЕ/г Akkermansia muciniophila и/или 10⁶-10¹⁰ КОЕ/г Bifidobacterium spp. Кишечная ферментация RG-I полисахаридов приводит к образованию полезных короткоцепочечных жирных кислот, уменьшает газообразование и стимулирует рост или активность полезных бактерий. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 7 пр.

1. Применение рамногалактуронан-I (RG-I) полисахаридов в получении пребиотической композиции для терапевтического или профилактического лечения заболеваний, ассоциированных с нарушенным составом или функциональностью кишечного микробиома у пациента, заболевание выбирают из избыточной массы, ожирения, инсулинорезистентности и дисфункции кишечного барьера, где композиция включает по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества RG-I полисахаридов, происходящих из фруктов, моркови, гороха, цикория, сахарной свеклы, бамии или их комбинаций, где указанные RG-I полисахариды имеют молекулярную массу более 15 кДа и имеют основу, состоящую из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне 20:1-1:1.

2. Применение RG-I полисахаридов по п. 1, где RG-I полисахариды составляют по меньшей мере 20 мас.% пектиновых полисахаридов, присутствующих в пребиотической композиции.

3. Применение RG-I полисахаридов по п. 1 или 2, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы в RG-I полисахаридах не превосходит 15:1, предпочтительно не превосходит 12:1, более предпочтительно не превосходит 10:1.

4. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где молярное соотношение остатков арабинозы и остаткам рамнозы в RG-I полисахаридах не превосходит 30:1.

5. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где молярное соотношение остатков галактозы и остатков рамнозы в RG-I полисахаридах не превосходит 30:1.

6. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где менее чем 85% остатков галактуроновой кислоты в RG-I полисахаридах являются эстерифицированными в форме метиловых эфиров.

7. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где RG-I полисахариды происходят из растительного источника, выбираемого из моркови, яблока, болгарского перца, цитрусовых, черники, винограда, гороха, цикория, сахарной свеклы, оливок, бамии и их комбинаций.

8. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где пациент страдает от или имеет риск развития метаболического расстройства.

9. Применение RG-I полисахаридов по любому из пп. 1-7, где пациент страдает от или имеет риск развития дисфункции кишечного барьера.

10. Применение RG-I полисахаридов по любому из предшествующих пунктов, где композицию выбирают из напитка, капсулы, таблетки, порошка, батончика и спреда.

11. Синбиотическая композиция, включающая:

* по меньшей мере 0,1 мас.% сухого вещества рамногалактуронана I (RG-I) полисахаридов, происходящих из моркови или яблока, указанные RG-I полисахариды имеют молекулярную массу больше 15 кДа и имеют основу, состоящую из остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы, указанные остатки рамнозы содержатся в остатках альфа(1→4)-галактуроновой-альфа(1→2)-рамнозы, где молярное соотношение остатков галактуроновой кислоты и остатков рамнозы в RG-I полисахаридах находится в диапазоне 20:1-1:1; и

* 10⁴-10¹⁰ КОЕ/г Akkermansia muciniophila и/или 10⁶-10¹⁰ КОЕ/грамм Bifidobacterium spp.

12. Композиция по п.11, где композицию выбирают из напитка, капсулы, таблетки, порошка, батончика и спреда.