ПОЛИСАХАРИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА, И АГЕНТ, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ, ИЛИ ПРОДУКТ ПИТАНИЯ И НАПИТОК, СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО Российский патент 2023 года по МПК C08B37/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полисахариду, обладающему иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, и к стимулятору врожденного иммунитета или к продукту питания и напитку, содержащему полисахарид.

Предшествующий уровень техники

У высших позвоночных животных, таких как человек, есть два типа иммунных механизмов (иммунных систем) – это врожденный иммунитет и приобретенный иммунитет. Оба иммунных механизма работают согласованно для защиты от источников инфекции. Напротив, многие другие живые организмы, такие как насекомые, лишены приобретенного иммунного механизма, и таким образом, защищаются от источников инфекции только с помощью врожденного иммунного механизма.

Врожденный иммунитет является распространенным механизмом защиты от инфекций среди живых организмов. Врожденный иммунитет является неспецифическим и быстро реагирует, что позволяет эффективно функционировать против различных источников инфекции. Неспецифический врожденный иммунитет считается более важным, чем специфический приобретенный иммунитет против источника инфекции у высших позвоночных животных, таких как человек, потому что он обеспечивает раннюю фазу устойчивости к инфекциям, профилактику онкологических заболеваний и заболеваний, связанных с образом жизни, восстановление тканей и тому подобное.

Врожденный иммунитет является ключевым фактором механизма биологической защиты хозяина на ранней стадии инфекции. Активация врожденного иммунитета считается эффективной для профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Поскольку важность разработки противораковых лекарств в последние годы становится все более значимой, привлекла внимание иммуностимулирующая активность в отношении врожденного иммунитета у полученных из грибов полисахаридов, которые также обеспечивают противоопухолевую активность.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение стимуляторов врожденного иммунитета, таких как β-глюканы, полученные из грибов, или пептидогликаны, полученные из бактерий, в препараты мышц шелкопрядов индуцирует цитокин насекомого, паралитический пептид, который активирует врожденный иммунитет наряду с сокращением мышц (Патентный документ 1 и Непатентные документы 1-3). Используя изменение длины тела в результате этого сокращения мышц в качестве показателя, авторы изобретения создали простую систему скрининга стимуляторов врожденного иммунитета, которая позволила выявить иммуностимулирующую активность в отношении врожденного иммунитета для полисахаридов, извлеченных из зеленого чая и т.д. (Непатентные документы 4 и 5).

Опытным путем установлено, что овощи важны для потребления необходимых питательных веществ для поддержания здоровья человека, а также используются во всем мире в качестве традиционных лекарственных растений. Овощи могут потенциально содержать стимулятор врожденного иммунитета, но до сих пор не было выявлено никаких веществ из овощей, которые стимулировали бы функцию врожденного иммунитета.

Авторы изобретения обнаружили, что экстракт брокколи проявляет иммуностимулирующую активность в отношении врожденного иммунитета (Патентный документ 1). Однако не было выяснено, какой компонент в брокколи непосредственно отвечает за иммуностимулирующую активность в отношении врожденного иммунитета. Также не выяснено, какая часть (химическая структура) компонента (соединения) обладает иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Ранее было предпринято всего несколько попыток очистить активные части (химические структуры) для использования в качестве стимуляторов врожденного иммунитета путем разложения химических связей компонентов (соединений), выделенных из живых организмов, включая брокколи. Другими словами, стимулятор врожденного иммунитета, определенный специфической химической структурой, который эффективен для стимуляции врожденного иммунитета, по сути не был приготовлен (синтезирован) с использованием компонента (соединения), извлеченного из живого организма в качестве сырьевого материала.

Список цитирования

Патентная литература

Патентный документ 1: Международная публикация № WO2008/126905

Непатентная литература

Непатентный документ 1: «Activation of the silkworm cytokine by bacterial and fungal cell wall components via a reactive oxygen species-triggered mechanism». Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M, Sekimizu K. J Biol Chem. 2008, 283(4), 2185-91.

Непатентный документ 2: «Insect cytokine paralytic peptide (PP) induces cellular and humoral immune responses in the silkworm Bombyx mori». Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M, Nakamura Y, Noda H, Imamura K, Mita K, Sekimizu K. J Biol Chem. 2010, 285 (37), 28635-42.

Непатентный документ 3: «Porphyromonas gingivalis peptidoglycans induce excessive activation of the innate immune system in silkworm larvae». Ishii K, Hamamoto H, Imamura K, Adachi T, Shoji M, Nakayama K, Sekimizu K. J Biol Chem. 2010, 285 (43), 33338-47.

Непатентный документ 4: «Purification of innate immune stimulant from green tea using a silkworm muscle contraction assay». Dhital S, Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Sekimizu K. Drug Discovery & Therapeutics. 2011, 5 (1), 18-15.

Непатентный документ 5: «Evaluation of innate immune stimulating activity of polysaccharides using a silkworm (Bombyx mori) muscle contraction assay». T. Fujiyuki, H. Hamamoto, K. Ishii, M. Urai, K. Kataoka, T. Takeda, S. Shibata and K. Sekimizu. Drug Discovery & Therapeutics, 6 (2), 88-93, 2012.

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая проблема, которую необходимо решить

С учетом уровня техники, описанного выше, настоящее изобретение было создано для обеспечения нового вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Решение проблемы

Авторы изобретения провели интенсивные исследования для решения этой проблемы, используя метод сокращения мышц тутового шелкопряда, разработанный авторами изобретения, и успешно выделили вещество, стимулирующее врожденный иммунитет, из экстракта брокколи. Авторы изобретения дополнительно проанализировали структуру этого вещества, чтобы выявить часть, ответственную за иммуностимулирующую активность.

В результате авторы изобретения обнаружили новые полисахариды, имеющие неизвестную структуру, из очищенного экстракта брокколи, которые обладают иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что цепь полигалактуроновой кислоты, которая является составной частью полисахарида, играет важную роль для иммуностимулирующей активности в отношении врожденного иммунитета, благодаря чему создано настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает полисахарид, обладающий стимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, содержащий:

- в качестве составляющих сахаров от 25 до 50 молярных долей галактуроновой кислоты, от 15 до 50 молярных долей галактозы, от 0 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 30 молярных долей арабинозы, от 0 до 6 молярных долей ксилозы, и от 3 до 15 молярных долей рамнозы; и

- в качестве главной цепи - цепь полигалактуроновой кислоты, включающую α-1,4-связанную галактуроновую кислоту.

Настоящее изобретение также обеспечивает стимулятор врожденного иммунитета, содержащий вышеуказанный полисахарид в качестве активного компонента.

Настоящее изобретение также относится к продукту питания или напитку, содержащему вышеуказанный полисахарид.

Эффекты изобретения

Настоящее изобретение предлагает полисахарид с новой химической структурой, обладающий иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Настоящее изобретение также обеспечивает стимулятор врожденного иммунитета, содержащий полисахарид в качестве активного компонента, а также продукт питания или напиток, содержащий полисахарид, обладающий иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Полисахарид по настоящему изобретению максимально безопасен, и не имеет побочных эффектов. Кроме того, полисахарид можно легко перерабатывать в различные лекарственные формы и легко добавлять в пищу и напитки. Следовательно, полисахарид эффективно и безопасно стимулирует врожденный иммунитет в форме стимулятора врожденного иммунитета или функционального продукта питания.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой график, показывающий измерение удельной активности (значения C), полученное путем инъекции фракции, абсорбированной на ДЭАЭ-целлюлозе, шелкопрядам.

Фигура 2(а) представляет собой спектр анализа ВЭЖХ для стандартного образца.

Фигура 2(b) представляет собой спектр анализа ВЭЖХ для гидролизата фракции, адсорбированной на ДЭАЭ-целлюлозе.

Фигура 3 представляет (а) спектр ¹Н ЯМР при 500 МГц и (b) спектр ¹³С ЯМР при 125 МГц для фракции, адсорбированной на ДЭАЭ-целлюлозе.

Фигура 4 представляет собой спектр анализа метилирования фракции, адсорбированной на ДЭАЭ-целлюлозе против производного альдитол ацетата.

Фигура 5 показывает (а) ¹H ЯМР спектр при 500 МГц и (b) ¹³С ЯМР спектр при 125 МГц для продукта гидролиза щавелевой кислотой.

Фигура 6 представляет собой график фракционирования гель-фильтрационной хроматографией продукта, обработанного пектиназой.

Фигура 7 представляет собой принципиальную схему, иллюстрирующую типичные химические структуры полисахарида по настоящему изобретению и его обработанного продукта.

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение будет дополнительно объяснено ниже, но настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными ниже. Настоящее изобретение может быть произвольно модифицировано в рамках объема изобретения.

<Полисахарид>

Полисахарид по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, и характеризуется тем, что содержит:

- от 25 до 50 молярных долей галактуроновой кислоты, от 15 до 50 молярных долей галактозы, от 0 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 30 молярных долей арабинозы, от 0 до 6 молярных долей ксилозы и от 3 до 15 молярных долей рамнозы в виде составляющих сахаров; а также

- цепь полигалактуроновой кислоты, имеющую α-1,4-связанную галактуроновую кислоту в качестве главной цепи.

Для полисахарида по настоящему изобретению необходимо включать от 25 до 50 молярных долей галактуроновой кислоты, от 15 до 50 молярных долей галактозы, от 0 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 30 молярных долей арабинозы, 0 до 6 молярных долей ксилозы и от 3 до 15 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров.

Предпочтительно, полисахарид содержит от 25 до 45 молярных долей галактуроновой кислоты, от 20 до 50 молярных долей галактозы, от 1 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 20 молярных долей арабинозы, от 0 до 6 молярных долей ксилозы и от 4 до 14 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров.

Более предпочтительно, полисахарид содержит от 25 до 40 молярных долей галактуроновой кислоты, от 30 до 50 молярных долей галактозы, от 3 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 10 молярных долей арабинозы, от 0 до 5 молярных долей ксилозы и от 5 до 13 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров.

Особо предпочтительно, полисахарид содержит от 30 до 40 молярных долей галактуроновой кислоты, от 35 до 45 молярных долей галактозы, от 5 до 6 молярных долей глюкозы, от 0 до 5 молярных долей арабинозы, от 0 до 5 молярных долей ксилозы и от 6 до 12 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров.

Полисахарид по настоящему изобретению может содержать моносахарид, отличный от указанных выше моносахаридов, при условии, что эффект по настоящему изобретению не ухудшается.

Полисахарид по настоящему изобретению содержит цепь полигалактуроновой кислоты, имеющую α-1,4-связанную галактуроновую кислоту в качестве главной цепи. Цепь полигалактуроновой кислоты может содержать моносахарид, отличный от галактуроновой кислоты, при условии, что эффект по настоящему изобретению не нарушается.

Примеры «моносахаридов, отличных от галактуроновой кислоты» включают рамнозу.

Доля галактуроновой кислоты (звеньев) в «цепи полигалактуроновой кислоты» предпочтительно составляет от 20 до 99 моль%, более предпочтительно от 30 до 97 моль% и особо предпочтительно от 40 до 95 моль% по отношению к общему количеству «цепи полигалактуроновой кислоты».

Если доля связанной галактуроновой кислоты (звеньев) в главной цепи «цепи полигалактуроновой кислоты» слишком низкая, стимулирующая активность полисахарида в отношении врожденного иммунитета может уменьшиться. Напротив, если доля слишком высока, полисахарид трудно получить.

Полисахарид по настоящему изобретению имеет новую структуру, не содержащую метиловый эфир галактуроновой кислоты, что делает полисахарид по настоящему изобретению отличным от пектинов. Кроме того, «полисахарид по настоящему изобретению» представляет собой новое вещество будучи веществом, очищенным из натурального продукта, и содержащим химическую структуру с иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Полисахарид по настоящему изобретению был обнаружен путем очистки экстракта брокколи, который состоит из множества компонентов. Сложно идентифицировать компонент, обладающий стимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, среди столь большого множества разных компонентов.

Авторы изобретения неоднократно измеряли иммуностимулирующую активность в отношении врожденного иммунитета у каждого из «множества компонентов экстракта брокколи» по отдельности, используя простой и более этичный анализ сокращения мышц шелкопряда, и наконец, создали настоящее изобретение. Кроме того, авторы изобретения разложили и очистили химические структуры (единицы) из компонентов, которые повторно анализировали с помощью анализа сокращения мышц тутового шелкопряда, и наконец, достигли настоящего изобретения, обнаружив химическую структуру (единицу), обладающую иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, из множества химических структур (единиц).

Полисахарид по настоящему изобретению может быть выделен из природного источника, и получен путем очистки, разложения и тому подобного из натурального продукта, получен путем химической модификации натурального продукта в качестве сырья, или полностью синтезирован.

<Стимулятор врожденного иммунитета>

Стимулятор врожденного иммунитета по настоящему изобретению характеризуется включением вышеуказанного полисахарида в качестве активного компонента.

Полисахарид, содержащийся в качестве активного компонента стимулятора врожденного иммунитета по настоящему изобретению, может быть получен из натурального продукта или синтезирован.

Отношение объема полисахарида, активного компонента стимулятора врожденного иммунитета по настоящему изобретению, к общему количеству стимулятора врожденного иммунитета, особо не ограничивается и может быть соответствующим образом определено в зависимости от цели. Предпочтительно в отношении 100 массовых частей общего стимулятора врожденного иммунитета общее содержание полисахарида предпочтительно составляет от 0,01 до 100 массовых частей, более предпочтительно от 0,1 до 99 массовых частей, особо предпочтительно от 1 до 95 массовых частей и еще более предпочтительно от 10 до 90 массовых частей.

Стимулятор врожденного иммунитета по настоящему изобретению может включать «другие компоненты» в дополнение к активному компоненту полисахарида.

«Другие компоненты» конкретно не ограничены и могут быть выбраны соответствующим образом в зависимости от цели, при условии, что эффект настоящего изобретения не ухудшается. Примеры других компонентов включают фармацевтически приемлемые носители.

Носитель конкретно не ограничен и может быть выбран соответствующим образом в зависимости, например, от лекарственной формы, описанной ниже. Содержание «других компонентов» в стимуляторе врожденного иммунитета также особо не ограничено и может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от цели.

Лекарственная форма стимулятора врожденного иммунитета по настоящему изобретению конкретно не ограничена и может быть соответствующим образом выбрана в зависимости, например, от необходимого способа введения, описанного ниже.

Конкретные примеры лекарственной формы включают пероральный твердый препарат (такой, как таблетка, таблетка с оболочкой, гранула, порошок или капсула), жидкий препарат для перорального применения (такой как жидкость для внутреннего применения, сироп или эликсир), для инъекций (например, раствор или суспензия), мазь, пластырь, гель, крем, порошок для наружного применения, спрей и ингалятор.

Твердый состав для перорального применения может быть получен в соответствии с общепринятым способом путем добавления вспомогательного вещества, и если необходимо, добавок, таких как связующий агент, дезинтегрант, лубрикант, краситель и ароматизатор, к активному компоненту, описанному выше.

Примеры вспомогательного вещества включают лактозу, сахарозу, натрия хлорид, глюкозу, крахмал, кальция карбонат, каолин, микрокристаллическую целлюлозу и кремниевую кислоту.

Примеры связующего агента включают воду, этанол, пропанол, простой сироп, раствор глюкозы, раствор крахмала, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилкрахмал, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, шеллак, кальция фосфат и поливинилпирролидон.

Примеры дезинтегранта включают сухой крахмал, альгинат натрия, порошковый агар, натрия гидрокарбонат, кальция карбонат, натрия лаурилсульфат, моноглицерид стеарат и лактозу.

Примеры лубриканта включают очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, буру и полиэтиленгликоль.

Примеры красителя включают титана оксид и железа оксид.

Примеры ароматизатора включают сахарозу, апельсиновую кожуру, лимонную кислоту и винную кислоту.

Жидкая композиция для полости рта может быть получена в соответствии с общепринятым способом, например, путем добавления добавок, таких как ароматизатор, буфер и стабилизатор, к активному компоненту, описанному выше.

Примеры ароматизатора включают сахарозу, апельсиновую кожуру, лимонную кислоту и винную кислоту. Примеры буфера включают натрия цитрат. Примеры стабилизатора включают камедь трагаканта, аравийскую камедь и желатин.

Формы для инъекций могут быть получены в соответствии с обычным способом для подкожного введения, внутримышечного введения или внутривенного введения, например, путем добавления регулятора pH, буфера, стабилизатора, агента тоничности, местного анестетика и т.д. к активному компоненту, описанному выше.

Примеры регулятора pH и буфера включают натрия цитрат, натрия ацетат и натрия фосфат. Примеры стабилизатора включают натрия пиросульфит, ЭДТА, тиогликолевую кислоту и тиомолочную кислоту. Примеры тонизирующего агента включают натрия хлорид и глюкозу.

Примеры местного анестетика включают прокаина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид.

Мазь может быть получена, например, путем добавления основы, стабилизатора, увлажняющего агента, консерванта и т.д., все из которых известны, к активному компоненту, описанному выше, и их смешивания в соответствии с обычной методикой.

Примеры основы включают жидкий парафин, белый вазелин, белый пчелиный воск, октилдодециловый спирт и парафин. Примеры консерванта включают метил-п-оксибензоат, этил-п-оксибензоат, и пропил-п-оксибензоат.

Пластырь может быть получен, например, путем нанесения мази в форме крема, геля или пасты на известную подложку с применением обычного способа. Примеры подложки включают тканое полотно или нетканое полотно, изготовленное из хлопка, штапельного волокна или химического волокна; пленку из мягкого винилхлорида, полиэтилена, полиуретана и тому подобного; и листовой пенопласт.

Стимулятор врожденного иммунитета из настоящего изобретения можно использовать для применения, например, у индивидуума, у которого необходима стимуляция механизма врожденного иммунитета (такого, как индивидуум, у которого необходимо укрепление здоровья или восстановление после болезни, индивидуум, у которого необходима профилактика или лечение рака или заболевания, связанного с образом жизни, или индивидуум, инфицированный бактерией, грибком, вирусом, и тому подобным).

Животное, у которого применяют стимулятор врожденного иммунитета из настоящего изобретения, не ограничивается конкретно, и примеры включают человека, мышей, крыс, обезьян, лошадей; сельскохозяйственных животных, таких как коровы, свиньи, козы и куры; и домашних животных, таких как кошки и собаки.

Способ применения стимулятора врожденного иммунитета не ограничивается конкретно, и может быть выбран подходящим образом, в зависимости, например, от лекарственной формы стимулятора врожденного иммунитета. Примеры включают пероральное применение, интраперитонеальное применение, введение в кровь и инфузию в кишечник.

Доза стимулятора врожденного иммунитета не ограничивается конкретно, и может быть выбрана подходящим образом, в зависимости от возраста и массы тела индивидуума, у которого его применяют, необходимой степени эффекта, и тому подобного. Например, доза в сутки у взрослого индивидуума предпочтительно составляет от 1 мг до 30 г, более предпочтительно от 10 мг до 10 г, и особо предпочтительно от 100 мг до 3 г общего количества полисахарида в качестве активного компонента.

Время применения стимулятора врожденного иммунитета не ограничивается конкретно, и может быть выбрано подходящим образом, в зависимости от цели. Например, стимулятор врожденного иммунитета может быть применен с профилактической или терапевтической целью.

<Продукт питания или напиток>

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению отличается тем, что содержит вышеописанный полисахарид или вышеописанный стимулятор врожденного иммунитета по настоящему изобретению.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета.

Содержание полисахарида или стимулятора врожденного иммунитета в продукте питания или напитке, содержащем полисахарид или стимулятор врожденного иммунитета (далее сокращенно обозначаемом как «продукт питания или напиток по настоящему изобретению»), конкретно не ограничивается и может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от назначения или формы (типа) продукта питания или напитка. Содержание общего стимулятора врожденного иммунитета предпочтительно составляет от 0,001 до 100 массовых частей, более предпочтительно от 0,01 до 100 массовых частей и особо предпочтительно от 0,1 до 100 массовых частей по отношению к 100 массовым частям всего продукта питания или напитка.

Либо полисахарид, либо стимулятор врожденного иммунитета можно использовать отдельно, либо два или более полисахаридов или стимуляторов врожденного иммунитета можно использовать в комбинации. Когда два или более полисахаридов или стимуляторов врожденного иммунитета используются в комбинации, отношение содержания каждого вещества в продукте питания или напитке не ограничивается конкретно и может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от цели.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению может дополнительно содержать «другие компоненты» в дополнение к полисахариду или стимулятору врожденного иммунитета по настоящему изобретению.

«Другие компоненты» в продукте питания или напитке по настоящему изобретению, обладающие такой иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, конкретно не ограничены и могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от цели, при условии, что эффект по настоящему изобретению не ухудшается. Примеры «других компонентов» включают различные пищевые ингредиенты. Содержание «других компонентов» конкретно не ограничено и может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от цели.

Тип продукта питания или напитка не ограничивается конкретно и может быть выбран соответствующим образом в зависимости от цели. Примеры продуктов питания или напитков включают кондитерские изделия, такие как желе, конфеты, шоколад и печенье; сладкие напитки, такие как зеленый чай, черный чай, кофе и освежающие напитки; молочные продукты, такие как кисломолочные продукты, йогурты и мороженое; обработанные овощные или фруктовые продукты, такие как овощные напитки, фруктовые напитки и джемы; жидкие продукты, такие как супы; обработанные зерновые продукты, такие как хлеб и лапша; и различные приправы.

Способ производства этих продуктов питания или напитков не ограничен конкретно. Продукты питания или напитки могут быть получены подходящим образом в соответствии с обычным способом производства различных продуктов питания или напитков.

Продукт питания или напиток может быть изготовлены в виде перорального твердого препарата, такого как пилюля, гранула или капсула, или в виде жидкого препарата для перорального применения, такого как жидкость для внутреннего применения или сироп. Способ получения перорального твердого состава или перорального жидкого состава не ограничен конкретно и может быть выбран соответствующим образом в зависимости от цели. Например, пероральный твердый состав или пероральный жидкий состав может быть получен в соответствии с вышеописанным способом получения лекарственного средства в форме перорального твердого состава или перорального жидкого состава.

Продукт питания или напиток считают особенно пригодным в качестве функционального или полезного для здоровья продукта питания или напитка и т.п. для стимуляции механизма врожденного иммунитета.

Когда полисахарид или стимулятор врожденного иммунитета по настоящему изобретению используют для производства продукта питания или напитка, способ получения может быть способом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Специалисты в данной области техники смогут приготовить интересующий продукт питания или напиток, соответствующим образом комбинируя различные этапы, такие как этап смешивания полисахарида по настоящему изобретению с другими компонентами, этап формования, этап стерилизации, этап ферментации, этап выпекания, этап сушки, этап охлаждения, этап гранулирования и этап упаковки.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно с использованием Примеров, Сравнительных примеров и Опытных примеров. Настоящее изобретение не ограничивается этими Примерами до тех пор, пока это не выходит за пределы сущности настоящего изобретения.

<Экстракция горячей водой>

Разрезали различные овощи, к которым добавляли воду, и затем автоклавировали при 121°С в течение 20 минут. Овощи оставляли охлаждаться, а затем центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 минут, для получения надосадочной жидкости в виде «экстракта горячей водой».

<Анализ сокращения мышц шелкопряда>

Образец растворяли в буфере, и из раствора 100 мкл вводили в мышечный препарат тутового шелкопряда для измерения мышечного сокращения. Иммуностимулирующую способность в отношении врожденного иммунитета считали положительной, если образец обеспечивал удельную активность или значение С (значение сокращения) 0,15 или более, которое рассчитывали путем деления разницы в длине мышечного препарата между значениями до и после инъекции на длину мышечного препарата до инъекции.

<Очистка фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой>

Экстракт брокколи горячей водой подвергали осаждению этанолом. Экстракцию горячей водой проводили в соответствии со способом, описанным в Патентном документе 1. Полученный осадок растворяли в воде Milli-Q, а затем подвергали диализу против воды Milli-Q и лиофилизировали. Лиофилизированный продукт подвергали колоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, и в каждой из полученных фракций измеряли количество восстанавливающих сахаров методикой с фенолом и серной кислотой. Фракции пиков, содержащие элюированные сахара, собирали, подвергали диализу и лиофилизировали.

<Структурный анализ фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой>

1. Анализ состава моносахаридов

Фракцию, адсорбированную на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гидролизовали трифторуксусной кислотой. Гидролизат метили этиловым эфиром аминобензойной кислоты, который подвергали анализу ВЭЖХ с использованием колонки ОДС. Образец, полученный путем смешивания следующих стандартных моносахаридов, анализировали аналогичным образом и сравнивали время удерживания для L-арабинозы (Ara), L-фукозы (Fuc), D-галактозы (Gal), D-глюкозы (Glc), D-маннозы (Man), L-рамнозы (Rha), D-рибозы (Rib), D-ксилозы (Xyl), D-галактуроновой кислоты (GalA), D-глюкуроновой кислоты (GlcA), N-ацетил-D-галактозамина (GalNAc), N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc) и N-ацетил-D-маннозамина (ManNAc).

2. ЯМР-анализ

27 мг фракции, адсорбированной на ДЭАЭ-целлюлозной колонке, растворяли в дейтерированной воде (D₂O) при 40°С, а затем подвергали ¹Н ЯМР-анализу, ¹³С ЯМР-анализу, DQF-COSY-анализу (двухмерной ядерной магнитно-резонансной спектроскопии – корреляционной спектроскопии), HMQC-анализу (гетероядерной одноквантовой корреляционной спектроскопии), HMBC-анализу (гетероядерной моногосвязанной корреляционной спектроскопии) и TOCSY анализу (полной корреляционной спектроскопии).

3. Анализ метилирования

Фракцию, адсорбированную на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, метилировали, а затем гидролизовали трифторуксусной кислотой. Гидролизат ацетилировали, получая альдитол ацетат, который анализировали с помощью ГХ-МС.

<Селективное разложение фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой>

1. Селективное разложение арабинозы гидролизом щавелевой кислотой

Фракцию, адсорбированную на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гидролизовали щавелевой кислотой, нейтрализовали, подвергали диализу, а затем лиофилизировали.

2. Разложение цепи полигалактуроновой кислоты пектиназой

Фракцию, адсорбированную на колонке с DEAE-целлюлозой, обрабатывали пектиназой (Sigma-Aldrich Co., LLC.). После нагревания для дезактивации фермента фракцию подвергали гель-проникающей хроматографии на колонке с Bio-gel P4. В каждой из полученных фракций измеряли количество восстанавливающих сахаров методом с фенолом и серной кислотой. Колонка для гель-фильтрации Bio-gel P4 имела размеры 1150 нм х 15 мм ∅, и в качестве элюента использовали 0,2 М уксусную кислоту. Фракции пиков, содержащие элюированные сахара, собирали и сушили при пониженном давлении.

Пример 1

Скрининг овощей, содержащих вещество, стимулирующее врожденный иммунитет

Экстракты, полученные с горячей водой из 17 видов овощей (брокколи, капуста, морковь, перец, плоды архата (Siraitia grosvenorii), шпинат, чеснок, тыква, имбирь, помидоры черри, редис, ростки гороха, петрушка, огурец, баклажан, лук-батун и пекинская капуста) сравнивали по их потенциалу к стимуляции врожденного иммунитета с помощью анализа сокращения мышц тутового шелкопряда.

Таблица 1

Овощи Удельная активность
(значение C) (единицы/мг) Брокколи 7 Капуста <0,4 Морковь 0,6 Перец 0,3 Плоды Siraitia grosvenorii 0,6 Шпинат <0,2 Чеснок 0,0 Тыква <0,1 Имбирь <0,3 Томаты черри 0,5 Редис 0,2 Ростки гороха <0,2 Петрушка 0,7 Огурец 0,8 Баклажан 0,5 Лук-батун 1 Пекинская капуста 0,3

В таблице 1 приведены измеренные значения удельной активности (значения C) для экстрактов горячей водой из 17 овощей, полученные в результате анализа сокращения мышц тутового шелкопряда. Установлено, что экстракт горячей водой, который проявлял удельную активность (значение С) 0,15 или более, обладает способностью к стимуляции врожденного иммунитета. Результаты в Таблице 1 показывают, что экстракт брокколи горячей водой проявлял сильную способность к стимуляции врожденного иммунитета.

Пример 2

Очистка вещества, стимулирующего врожденный иммунитет, из брокколи

Вещество, стимулирующее врожденный иммунитет, очищали из экстракта брокколи горячей водой с использованием показателя активности сокращения мышц шелкопряда. В Таблице 2 приведены результаты значений удельной активности (значения С) на разных этапах очистки.

Таблица 2

Фракция Общая активность (единицы) Количество (мг) Удельная активность (значение C) (единицы/мг) Экстракция горячей водой 50,000 800 63 Экстракция этанолом 11,000 250 44 Фракция, абсорбированная на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой 13,000 100 130

В результате осаждения этанолом экстракта, полученного с горячей водой, в осадке собирали активный компонент (Таблица 2), что указывает на то, что активное вещество может представлять собой полисахарид. Последующая колоночная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе дала элюирование однородного пика сахара градиентом NaCl. Фракция этого пика показала повышенную удельную активность (Таблица 2).

Затем эту фракцию исследовали на дозозависимый ответ. Результат показан на Фигуре 1. На Фигуре 1 ордината представляет удельную активность (значение C), а абсцисса представляет количество фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (мкг).

Эта фракция показала удельную активность 67 единиц/мг (Фигура 1), где активность, соответствующая значению С (величина сокращения) 0,15, установлена как 1 единица. Дальнейший анализ был проведен в Примерах с использованием этой фракции в качестве очищенной фракции.

Пример 3

Структурный анализ фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Чтобы выявить моносахаридный состав фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гидролизат этой фракции трифторуксусной кислотой анализировали с помощью ВЭЖХ. Результат анализа показан на Фигуре 2. На Фигуре 2a показан результат анализа ВЭЖХ стандартного образца, а на Фигуре 2b показан результат ВЭЖХ анализа фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

На Фигуре 2 цифра 1 представляет D-глюкуроновую кислоту, цифра 2 представляет D-галактуроновую кислоту, цифра 3 представляет D-галактозу, цифра 4 представляет D-маннозу, цифра 5 представляет D-глюкозу, цифра 6 представляет L-арабинозу, цифра 7 обозначает D-рибозу, цифра 8 обозначает N-ацетил-D-маннозамин, цифра 9 обозначает D-ксилозу, цифра 10 обозначает N-ацетил-D-глюкозамин, цифра 11 обозначает L-фукозу, цифра 12 представляет L-рамнозу, а цифра 13 представляет N-ацетил-D-галактозамин.

Результат, приведенный на Фигуре 2, показывает, что были обнаружены галактуроновая кислота (GalA), галактоза (Gal), глюкоза (Glc), арабиноза (Ara) и рамноза (Rha), а их молярное соотношение, выраженное GalA: Gal: Glc: Ara: Rha, составило 12,4: 4,9: 1,0: 7,3: 1,2.

Затем структуру сахарной цепи анализировали методом ЯМР. Результаты показаны на Фигуре 3.

Результат 1D ЯМР анализа показал закономерности, характерные для сахаров, но отсутствие сигналов, характерных для белков и липидов (Фигура 3).

Затем были выполнены различные режимы анализа 2D ЯМР, и обнаруженные сигналы были идентифицированы. Результаты в совокупности показаны в Таблице 3.

Таблица 3

Интенсивность сигнала основного компонента GalA (галактуроновая кислота) была высокой, что позволило определить образование цепи α-1,4-связанной полигалактуроновой кислоты. Аrа (арабиноза) содержалась во втором по величине количестве, и часть сигналов можно было отнести к Аrа. Значение химического сдвига предполагало, что Аrа была α-1,5 связанной. Другие незначительные остатки сахаров, обнаруженные при анализе состава моносахаридов, давали сигналы низкой интенсивности, и таким образом, не все сигналы были идентифицированы.

Поэтому анализ метилирования был использован в качестве попытки определить положение сахарной связи. Результат показан на Фигуре 4. На Фигуре 4 цифра 1 представляет T-Araf, цифра 2 представляет T-Rhap, цифра 3 представляет 3-Araf, цифра 4 представляет 5-Araf, цифра 5 представляет T-Glcp, цифра 6 представляет T-Galp, цифра 7 представляет 3,5-Araf, цифра 8 представляет 2,4-Rhap, цифра 9 представляет 4-GalpA, цифра 10 представляет 4-Galp, цифра 11 представляет 3-Galp, цифра 12 представляет 6-Galp, а цифра 13 представляет 3,6-Galp.

Как показано на Фигуре 4, были обнаружены пики, относящиеся к 13 типам частично метилированного альдитола ацетата. Тип сахара и положение связи определяли по времени удерживания и характеру МС фрагментации каждого пика, результаты которых в совокупности показаны в Таблице 4.

В Таблице 4, например, «T-Araf» представляет невосстанавливающую концевую арабинозу, «3-Galp» представляет 3-связанную галактозу, а «3,5-Araf» представляет 3,5-связанную арабинозу.

Таблица 4

При анализе метилирования в качестве основных компонентов были обнаружены 1→4 связанная галактуроновая кислота (GalA) и 1→5 связанная арабиноза (Ara), что подтвердило результаты анализа ЯМР. Кроме того, положение связи было определено для других незначительных остатков сахаров, обнаруженных при анализе моносахаридного состава.

Пример 4

Структура, необходимая для иммуностимулирующего потенциала в отношении врожденного иммунитета во фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Чтобы определить структуру, требуемую для стимулирующей способности в отношении врожденного иммунитета во фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, основные компоненты арабинозы и галактуроновой кислоты были селективно разложены для получения структурно модифицированного продукта. Стимулирующий потенциал продукта в отношении врожденного иммунитета оценивали с помощью анализа сокращения мышц шелкопряда. Результаты показаны в Таблице 5.

Таблица 5

Образец Состав сахаров (моль%) Активность (единицы) GalA Gal Glc Ara Xyl Rha Очищенный продукт из экстракта брокколи 46 18 3,7 27 НО 4,5 630 Гидролиз щавелевой кислотой 30 45 5,5 3,2 3,6 12 670< Пектиназа Пик 1 23 22 5,0 28 5,0 18 370 Пик 2 24 24 6,0 17 5,5 24 240 Пик 3 НО 36 5,7 47 НО 12 <160 Пик 4 100 НО НО НО НО НО <160

Во-первых, селективное разложение и удаление арабинозы (Ara) проводили путем гидролиза щавелевой кислотой, где гидролизат анализировали по составу моносахаридов, и было показано значительное снижение содержания Ara (Таблица 5).

Кроме того, гидролизат после гидролиза щавелевой кислотой растворяли в дейтерированной воде (D₂O) при 70°C, и раствор подвергали ЯМР анализу. Результат показан на Фигуре 5.

Результат 1D ЯМР анализа показывает, что сигнал арабинозы исчез (Фигура 5). Этот образец (продукт гидролиза щавелевой кислотой) был подвергнут анализу сокращения мышц тутового шелкопряда, который показал, что способность к стимуляции врожденного иммунитета не была потеряна (Таблица 5).

Затем полигалактуроновую кислоту разлагали обработкой пектиназой. Разложившийся продукт фракционировали с помощью гель-фильтрации на колонке с гелем Bio-gel Р4. Результат фракционирования показан на Фигуре 6. Цифры с 1 по 4 на Фигуре 6 соответствуют значениям «Пика 1» - «Пика 4» в Таблице 5, соответственно.

Как показано на Фигуре 6, было выявлено четыре пика. Для каждого пика анализировали моносахаридный состав (Таблица 5), который показал, что GalA, Gal, Glc, Ara, Rha и Xyl были обнаружены в пиках 1 и 2. В пике 3 GalA не был обнаружен, но Gal, Glc, Ara, Rha и Xyl были обнаружены. Начиная с пика 4, был обнаружен мономер GalA, выделенный при обработке пектиназой. Каждый пик подвергали анализу сокращения мышц тутового шелкопряда (Таблица 5), который показал, что способность к стимуляции врожденного иммунитета ухудшалась с уменьшением молекулярной массы и что активность не обнаруживалась в Пике 3 или Пике 4.

<Краткое изложение и обсуждение примеров>

В результате скрининга экстрактов горячей водой из 17 видов овощей на наличие вещества со стимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета с помощью анализа сокращения мышц тутового шелкопряда была отмечена высокая активность для брокколи. В примерах фракцию, адсорбированную на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, имеющую стимулирующий потенциал в отношении врожденного иммунитета, очищали из брокколи.

Фракцию, адсорбированную на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, подвергали структурному анализу, в результате чего было высказано предположение, что фракция представляет собой кислый полисахарид, содержащий GalA, Gal, Glc, Ara и Rha, и имеющий основную структуру, состоящую из α-1,4-связанной цепи полигалактуроновой кислоты в качестве главной цепи и α-1,5-связанной арабинановой цепи в качестве боковой цепи.

Вышеуказанный результат привел к заключению, что фракция, адсорбированная на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, представляет собой тип пектина, который является компонентом клеточной стенки растений. Однако в результате ЯМР анализа почти не было обнаружено сигнала, относящегося к метиловому эфиру GalA, обычно содержащемуся в пектине. Это говорит о том, что структура фракции отличается от структуры пектинов, о которых сообщалось до сих пор.

Чтобы определить структуру, необходимую для стимулирующего потенциала в отношении врожденного иммунитета во фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, арабинозу и галактуроновую кислоту, которые были основными составляющими, избирательно разлагали. В результате разложения цепи полигалактуроновой кислоты при обработке пектиназой иммуностимулирующий потенциал в отношении врожденного иммунитета ухудшался с уменьшением молекулярной массы и исчезал.

На Фигуре 7 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая примерные структуры, как ожидается из результатов Примеров, полисахарида по настоящему изобретению и обработанного продукта полисахарида. Структура полисахарида по настоящему изобретению не ограничивается структурой, показанной на схематической диаграмме Фигуры 7.

Было много сообщений о том, что пектины, извлеченные из различных растений, таких как травы, обладают иммуностимулирующим потенциалом. Было сделано несколько сообщений о взаимосвязи между иммунореактивностью и структурой, и сообщалось, что для активности необходима структура галактана, содержащаяся в пектинах.

Однако в случае фракции, адсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, очищенной в Примерах, для активности требовалась структура полигалактуроновой кислоты. Это указывает на то, что фракция, адсорбированная на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, имеет механизм действия, отличный от иммуностимулирующего потенциала пектинов, о котором сообщалось ранее.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение позволяет получить полисахарид, оказывающий сильное стимулирующее влияние на врожденную иммунную функцию, и поэтому его можно широко использовать в различных видах продуктов питания или напитков, пилюлях, гранулах и жевательных таблетках. Полисахарид по настоящему изобретению особенно подходит для использования в качестве функционального питания или указанного диетического питания, обладающего иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета in vivo, или в качестве ингредиента рациона пациента, рациона для ухода за больными или тому подобного, необходимого для лечения расстройства иммунитета. Кроме того, полисахарид по настоящему изобретению может широко использоваться также в качестве сырьевого материала для медицинских препаратов.

Изобретение относится к технологии получения полисахаридов. Предложен способ получения полисахарида из брокколи. Способ включает резку брокколи, добавление воды, последующее автоклавирование при 121°С в течение 20 минут. Оставляют охлаждаться и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут для получения надосадочной жидкости в виде «экстракта горячей водой», который подвергают осаждению этанолом. Полученный осадок растворяют в воде Milli-Q, а затем подвергают диализу против воды Milli-Q и лиофилизируют. Лиофилизированный продукт подвергают колоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для получения фракции, абсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Полученная фракция содержит полисахарид, содержащий от 25 до 50 молярных долей галактуроновой кислоты, от 15 до 50 молярных долей галактозы, от 0 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 30 молярных долей арабинозы, от 0 до 6 молярных долей ксилозы и от 3 до 15 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров; и цепь полигалактуроновой кислоты в качестве главной цепи, содержащей α-1,4-связанную галактуроновую кислоту. Изобретение позволяет получить полисахарид, обладающий иммуностимулирующей активностью. 7 ил., 5 табл., 4 пр.

Способ получения полисахарида, где способ включает резку брокколи, добавление воды, последующее автоклавирование при 121°С в течение 20 минут, затем оставление охлаждаться и центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 минут для получения надосадочной жидкости в виде «экстракта горячей водой», который подвергают осаждению этанолом, полученный осадок растворят в воде Milli-Q, а затем подвергают диализу против воды Milli-Q и лиофилизируют, лиофилизированный продукт подвергают колоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для получения фракции, абсорбированной на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, где фракция содержит полисахарид, содержащий от 25 до 50 молярных долей галактуроновой кислоты, от 15 до 50 молярных долей галактозы, от 0 до 7 молярных долей глюкозы, от 0 до 30 молярных долей арабинозы, от 0 до 6 молярных долей ксилозы и от 3 до 15 молярных долей рамнозы в качестве составляющих сахаров; и цепь полигалактуроновой кислоты в качестве главной цепи, содержащей α-1,4-связанную галактуроновую кислоту.