Трифенилфосфониевые производные тетрапептида, обладающие антиоксидантной активностью Российский патент 2023 года по МПК C07K5/107 A61K38/07 A61P39/06 

Изобретение относится к химии пептидных соединений, а именно, к химически модифицированным пептидам, обладающим антиоксидантной активностью, общей формулы:

,

где n=1-3, R - NH₂, OH.

Изобретение может быть использовано в различных областях медицины, ветеринарии и фармацевтики для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся патологическим повышением уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках, например, дегенеративных заболеваний, включая процессы преждевременного старения. Термин АФК включает реакционноспособные кислородсодержащие соединения, существующие, как правило, в форме радикалов и/или ионов и вызывающие химическое повреждение биологических молекул.

Из исследованного заявителем уровня техники известно, что природные пептиды могут обладать различными видами биологической активности [M. Yoshikawa. Bioactive peptides derived from natural proteins with respect to diversity of their receptors and physiological effects. Peptides. 2015. V.72. P.208-25]. Важным проявлением пептидов является антиоксидантная активность, которая позволяет ингибировать уровень АФК в клетках при его патологическом повышении, то есть, при окислительном стрессе [R. Kohen, A. Nyska. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol. Pathol. 2002. Vol.30(6). P.620-50]. Пептиды являются кандидатами в эффективные и безопасные препараты для антиоксидантной терапии. Однако, большинство природных пептидов и их аналогов обладают плохими фармакокинетическими свойствами, а именно, быстрой деградацией (вследствие расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами) и плохой проникающей способностью через липофильные барьеры тканей и клеток (вследствие преимущественно гидрофильной природы), что уменьшает эффективную концентрацию пептидов и ограничивает их терапевтическое применение [P. Vlieghe, V. Lisowski, J. Martinez, M. Khrestchatisky. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug. Discov. Today. 2010. Vol.15(1-2). P.40-56].

Известно изобретение «Разновидность антиоксидантного пептида из казеина и его применение» по патенту CN105254714B, сущностью которого является смесь антиоксидантных пептидов, богатая основными аминокислотами, полученными из казеина, отличающаяся тем, что смесь антиоксидантных пептидов представляет собой KEMPFPK, RGPFPIIV, VYPFPGPIHN, TEDELQDKIHP, KAVPYPQRDMPIQ, VYPFPGPIHNSLPQ, QPHQPLPPTVMFPPQ, HQPHQPLPPTVMFPPQ, MHQPHQPLPPTVMFPPQ, KNQDKTEIPT, последовательности MHQPHQPLPPT, HQPHQPLPPTVM, NLHLPLPL, LHLPLPL и MPFPK.

Недостатками изобретения CN105254714B являются то, что используемые в изобретении пептиды имеют немодифицированную природную структуру, характеризующуюся быстрой деградацией и плохой проникающей способностью в ткани и клетки, что уменьшает эффективную концентрацию и терапевтическую (антиоксидантную) активность.

Заявителем выявлены технические решения, позволяющие улучшить фармакокинетические свойства, т.е. повысить стабильность и проникающую способность, в том числе, антиоксидантных пептидов посредством их химической модификации. Эти решения включают, например, использование дополнительных химических групп и компонентов, нетипичных аминокислот и их аналогов (например, D-изоформ аминокислот вместо типичных L-изоформ), циклизацию пептидной последовательности и другие [L. Gentilucci, R. De Marco, L. Cerisoli. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide bonds, and cyclization. Curr. Pharm. Des. 2010. Vol.16(28). P.3185-203].

Известно изобретение «Антиоксидантный олигопептид, модифицированный сульфоаминокислотой, и способ его получения» по патенту CN112646002A, сущностью которого является антиоксидантный олигопептид с последовательностью аминокислот Phe-Leu-Ala-Pro, полученный из природного сырья, или синтетическим путем, дополнительно модифицированный сульфоаминокислотой (например, цистеиновой кислотой (Cya), Cya-Phe-Leu-Ala-Pro)), характеризующийся большей антиоксидантной активностью, чем немодифицированный олигопептид. Недостаток изобретения CN112646002A связан с тем, что используемая для модификации гидрофильная анионная сульфоаминокислота ухудшает фармакокинетические свойства олигопептида, прежде всего, проникающую способность и, как следствие, уменьшает эффективную концентрацию и терапевтическую (антиоксидантную) активность.

Перспективным модификатором пептидов является трифенилфосфониевый (TPP) катион, который повышает проникающую способность различных биоактивных веществ в клетки и ткани благодаря своей липофильной катионной природе.

Также известно, что TPP катион обладает сродством к митохондриям, то есть он способствует накоплению веществ (TPP производных) в митохондриях. Вышеуказанное свойство представляет особенный интерес для антиоксидантной терапии, поскольку митохондрии являются одним из основных источников избыточной продукции АФК в клетках и, следовательно, являются важной мишенью для действия антиоксидантных препаратов [X. Han, R. Su, X. Huang, Y. Wang, X. Kuang, S. Zhou, H. Liu. Triphenylphosphonium-modified mitochondria-targeted paclitaxel nanocrystals for overcoming multidrug resistance. Asian J. Pharm. Sci. 2019. Vol.14(5). P.569-580]. Поэтому модификация антиоксидантных пептидов TPP группами является перспективным подходом для повышения их терапевтической активности вследствие повышения эффективной концентрации в клетках и митохондриях.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения, выбранным в качестве прототипа, совпадающим с заявленным техническим решением по составу и назначению, является производное тетрапептида Tyr-Arg-Phe-Lys, модифицированное TPP группой [R. Akhmadishina, R. Garifullin, N. Petrova, M. Kamalov, T. I. Abdullin. Triphenylphosphonium moiety modulates proteolytic stability and potentiates neuroprotective activity of antioxidant tetrapeptides in vitro. Front. Pharmacol. 2018. Vol.9. P.1-13] формулы:

Сущностью является модифицированный TPP группой тетрапептид с последовательностью аминокислот L-тирозин-D-аргинин-L-фенилаланин-L-лизин (Tyr-^DArg-Phe-Lys), который относится к классу пептидов с чередующимися ароматическими и катионными аминокислотами (производные нейропептида дерморфина), обладающих антиоксидантными свойствами [H. Szeto. Development of mitochondria-targeted aromatic-cationic peptides for neurodegenerative diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2009. Vol.1147(1). P.112-21]. TPP группа ковалентно присоединена к тетрапептиду шести-углеродным линкером, например, посредством пептидной связи -(С=О)-NH-.

Недостатком изобретения по прототипу является пониженная антиоксидантная активность в отношении клеток человека, обусловленная пониженной способностью проникать в клетки и связывать АФК и другие реакционноспособные радикальные соединения вследствие неоптимальной длины углеродного линкера, влияющей на взаимное пространственное расположение ТРР группы и антиоксидантных центров в пептиде (например, остатков тирозина).

Техническим результатом заявленного технического решения является повышение антиоксидантной активности TPP производного тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys по прототипу, выражающейся в ингибировании клеточных АФК, посредством оптимизации длины углеродного линкера и, как следствие, пространственного влияния ТРР группы на антиоксидантные центры пептида.

Сущностью заявленного технического решения являются производные синтетического тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys, модифицированного TPP группой, с общей длиной линкера между TPP и пептидным компонентом от трех до пяти атомов углерода, обладающие более эффективной антиоксидантной активностью в отношении живых клеток, прежде всего, клеток человека.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 4.

На Фиг. 1 приведены:

1а - хроматограмма заявляемого TPP производного тетрапептида;

1б - масс-спектр заявляемого TPP производного тетрапептида.

На Фиг. 2 представлена Таблица, в которой приведены данные об ингибирующем влиянии TPP производных тетрапептида на оптический сигнал окрашенного радикала ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота).

На Фиг. 3 представлены:

3а - микрофотографии клеток глиобластомы человека, обработанных TPP производными тетрапептида и окрашенных флуоресцентным индикатором MitoTracker Red CM-H₂XRos (красное окрашивание), выявляющим АФК в митохондриях. Ядра клеток окрашены красителем Hoechst 33342 (синее окрашивание);

3б - значения флуоресценции MitoTracker Red CM-H₂XRos в клетках (в относительных единицах).

На Фиг. 4 представлена Таблица, в которой приведены значения обнаруженных концентраций TPP производных тетрапептида в лизате клеток человека, предварительно обработанных соединениями.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Технический результат достигается получением TPP производных тетрапептидов новой структуры, а именно, TPP производных Tyr-^DArg-Phe-Lys с трех-, четырех- и пяти-углеродным линкером формулы:

,

где n = 1-3, R - NH₂, OH.

При этом линкер состоит из метиленовых групп -СН₂- с числом атомов углерода от одного до трех и двух дополнительных атомов углерода, смежных с TPP и пептидной группами, в совокупности, образуя линкер с длиной от трех до пяти атомов углерода. По сравнению с прототипом идентифицированные пептиды более эффективно транспортируются в клетки человека и более эффективно ингибируют клеточные АФК, следовательно, обладают улучшенной специфической (антиоксидантной) активностью.

Заявленные TPP производные тетрапептида синтезируют по стандартной методике твердофазного пептидного синтеза.

К аминокислотной последовательности Tyr-^DArg-Phe-Lys присоединяют посредством образования ковалентной связи ТPP группу с длиной углеродного линкера от трех до пяти атомов углерода с получением ТPP производных тетрапептида TPP~Tyr-^DArg-Phe-Lys (Пример 1), которые характеризуются усиленной антиоксидантной активностью (Примеры 2,3), а также более эффективным накоплением в клетках человека (Пример 4).

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения.

Пример 1. Получение трифенилфосфониевых производных тетрапептида

TPP производные тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys получают методом твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных химически модифицированных аминокислот, например, защищенных флуоренилметоксикарбонильной группой (Fmoc), твердофазного носителя для пришивки аминокислот, например, амидной смолы Ринка и установки для проведения синтеза, например, микроволнового синтезатора пептидов Initiator SP Wave (Biotage) [R. Akhmadishina, R. Garifullin, N. Petrova, M. Kamalov, T. I. Abdullin. Triphenylphosphonium moiety modulates proteolytic stability and potentiates neuroprotective activity of antioxidant tetrapeptides in vitro. Front. Pharmacol. 2018. Vol.9. P.1-13]. Осуществляют последовательные повторяющиеся циклы пришивки аминокислоты к носителю с использованием 2 эквивалентов Fmoc-защищенной аминокислоты (здесь и далее по отношению к функциональным группам носителя), 1.95 эквивалента активатора N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate и 3 эквивалентов диизопропилэтиламина в диметилформамиде (ДМФА). Защитную Fmoc-группу снимают обработкой носителя 20% (об./об.) раствором пиперидина в ДМФА. В качестве TPP компонента используют подходящее производное TPP, например, коммерчески доступные карбоксиалкильные производные TPP с длиной линкера от трех до пяти атомов углерода, которые пришивают к тетрапептиду в процессе синтеза. Синтезированные TPP производные тетрапептида отщепляют от носителя путем инкубации в смеси 95% трифторуксусной кислоты (ТФУ), 2.5% воды, 2.5% триизопропилсилана, собирают в дихлорметане, который удаляют на роторном испарителе, а остаток осаждают охлажденным диэтиловым эфиром, растворяют в бидистиллированной воде и высушивают.

Подтверждают структуру TPP производных тетрапептида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором, c помощью которого детектируют отношение массы ионизированных молекул к их заряду (m/z) и их молекулярную массу. ВЭЖХ-разделение проводят на гидрофобной колонке (C18) с использованием в качестве подвижной фазы смешанного растворителя ацетонитрил/вода.

Результаты приведены на Фиг. 1. На примере TPP производного тетрапептида с трехуглеродным линкером показано, что синтезированный пептид генерирует индивидуальный ВЭЖХ-пик (Фиг. 1а) и масс-спектрометрический сигнал m/z (Фиг. 1б), соответствующий молекулярной массе однозарядного иона соединения. Аналогичным образом подтверждают структуру других TPP производных тетрапептида.

Пример 2. Антиоксидантная активность трифенилфосфониевых производных тетрапептида (бесклеточный тест)

Антиоксидантную активность TPP производных тетрапептида исследуют с помощью стандартного колориметрического теста, основанного на использовании окрашенного радикала АBTS (2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)), который обесцвечивается в реакции с антиоксидантом [R. Ishkaeva, I. Nizamov, D. Blokhin, E. Urakova, V. Klochkov, I. Nizamov, B. Gareev, D. Salakhieva, T. Abdullin. Dithiophosphate-induced redox conversions of reduced and oxidized glutathione. Molecules. 2021. Vol.26(10). P.2973]. Готовят в полистироловом планшете реакционную смесь, содержащую исследуемый пептид в концентрации 1 мМ и хромогенный радикал АBTS в концентрации 0.25 мМ. Смесь инкубируют при температуре 37°C в течение 10 мин и далее регистрируют оптическое поглощение раствора при λ=734 нм на микропланшетном анализаторе Infinite M200 PRO (Tecan).

Результаты показывают, что TPP производные тетрапептида с длиной линкера в 3-5 атомов углерода вызывают более сильное уменьшение оптического поглощения радикала АBTS, обусловленное его связыванием, чем TPP производное тетрапептида с длиной линкера в 6 атомов углерода (Таблица на Фиг.2). Следовательно, заявленные TPP производные тетрапептида обладают повышенной антиоксидантной (радикал-связывающей) активностью по сравнению с прототипом.

Пример 3. Антиоксидантная активность трифенилфосфониевых производных тетрапептида (анализ АФК в клетках)

Клетки человека (линия глиобластомы LN-229) культивируют в питательной среде DМЕМ в стандартных асептических условиях в СО₂-инкубаторе при 37 °С. Предварительно выращенные на поверхности клетки обрабатывают TPP производными тетрапептида с трех-углеродным и шести-углеродным линкером в течение 2 ч и окрашивают флуоресцентным индикатором MitoTracker™ Red CM-H₂Xros (100 нМ), окрашивающим АФК в митохондриях клеток. Дополнительно окрашивают ядра клеток флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (3 мкг/мл). Обработанные пептидами и окрашенные клетки визуализируют методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия). Дополнительно с использованием программы NIH ImageJ рассчитывают относительный сигнал клеточной флуоресценции MitoTracker™ Red CM-H₂Xros, величина которого прямо пропорциональна уровень АФК в митохондриях.

Исследуют антиоксидантную активность заявленного соединения (TPP производного тетрапептида с трехуглеродным линкером) и прототипа (TPP производного тетрапептида с шестиуглеродным линкером).

Результаты приведены на Фиг.3 в виде микроскопических изображений клеток, в которых красные структуры соответствуют митохондриальным АФК, а также в виде диаграммы со средним уровнем митохондриальных АФК по данным флуоресценции индикатора (MitoTracker™Red CM-H₂Xros). Контроль соответствует необработанным клеткам с исходным (повышенным) уровнем митохондриальных АФК.

Результаты показывают, что оба сравниваемых соединения понижают уровень АФК в митохондриях клеток, однако, TPP производное тетрапептида с трехуглеродным линкером обладает большей ингибирующей активностью, чем TPP производное тетрапептида с шестиуглеродным линкером (Фиг.3). Это подтверждает, что заявленные TPP производные тетрапептида по сравнению с прототипом обладают повышенной антиоксидантной активностью в отношении АФК в клетках человека.

Пример 4. Клеточное накопление трифенилфосфониевых производных тетрапептида

Анализ клеточного накопления TPP производных тетрапептида проводят методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии с использованием ВЭЖХ-системы Infinity 1290 (Agilent) в сочетании с трехквадрупольным масс-спектрометром QTRAP 6500 (ABSciex). Параметры детектирования ионизированных соединений оптимизируют с использованием программного обеспечения Analyst 1.6.2. Хроматографическое разделение проводят на ВЭЖХ-колонке Discovery HS C18 (3 мкм, 5×2.1 мм, Supelco, США) с подвижными фазами, состоящими из А (99.9 % вода, 0.1 % муравьиная кислота) и Б (94.9 % ацетонитрил, 5 % вода, 0.1 % муравьиная кислота) при скорости потока 0.4 мл/мин и температуре 40 °C. Детектируют положительно заряженные ионы, полученные электрораспылением (ESI) в источнике Turbo Spray IonDrive.

Выращенные клетки глиобластомы диссоциируют с использованием раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота, промывают изотоническим раствором и супендируют с плотностью 1×10⁶ клеток в 1 мл. Суспензию клеток инкубируют в присутствии соединений в конечной концентрации 200 мкМ в СО₂-инкубатор при 37°C. Обработанные клетки промывают центрифугированием, далее лизируют в смеси метанол-вода в условиях ультразвуковой обработки. Лизат клеток центрифугируют, и отбирают надосадочный раствор для анализа соединений. Концентрации соединений в лизате клеток определяют по калибровочным графикам, полученным с использованием стандартных растворов соединений с известной концентрацией в программе MultiQuant 3.0.2 (AB Sciex, США) по площади пиков специфичных МRМ-переходов (Фиг.4) (MRM - multiple reaction monitoring (мониторинг множественных реакций) - представляет собой режим масс-спектрометрии для количественного определения целевых молекул в сложной смеси).

Результаты показывают, что TPP производное тетрапептида с трехуглеродным линкером характеризуется большей клеточной концентрацией, чем TPP производное тетрапептида с шестиуглеродным линкером (Таблица на Фиг.4). Это подтверждает, что по сравнению с прототипом заявленные TPP производные тетрапептида обладают повышенным клеточным накоплением, что, по мнению заявителя, вносит вклад в их повышенный антиоксидантный эффект на клетках.

Таким образом, изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно, созданы новые TPP производные тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys с оптимизированной длиной линкера от трех до пяти атомов углерода, обладающих повышенной антиоксидантной активностью и улучшенными транспортными свойствами.

Заявленные TPP производные тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys устраняют недостатки изобретения по прототипу.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью признаков и полученными техническими результатами.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалистов в данной области науки и техники, а в существующем уровне техники не были известны трифенилфосфониевые производные тетрапептида Tyr-^DArg-Phe-Lys заявленной структуры, обладающие антиоксидантной активностью.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как заявленное техническое решение может быть реализовано в различных химических, медицинских и фармацевтических предприятиях с применением известных веществ, материалов и технологического оборудования.

Изобретение относится к химии пептидных соединений, а именно к химически модифицированным пептидам, обладающим антиоксидантной активностью. Сущностью заявленного технического решения являются производные синтетического тетрапептида Tyr-DArg-Phe-Lys, модифицированного TPP группой, с длиной линкера от трех до пяти атомов углерода, обладающие антиоксидантной активностью в отношении живых клеток, прежде всего, клеток человека. Изобретение может быть использовано в различных областях медицины, ветеринарии и фармацевтики, например, для ингибирования уровня активным форм кислорода в клетках. 4 ил., 4 пр.

Трифенилфосфониевые производные тетрапептида Tyr-DArg-Phe-Lys, обладающие антиоксидантной активностью, общей формулы

где n=1–3, R – NH₂, OH.