Способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N1/30 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, патологической физиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для визуализации очагов повреждения миокарда при экспериментальном ушибе сердца у крыс.

Из существующих аналогов известны следующие способы визуализации ишемического повреждения сердца:

Известен способ визуализации с использованием нитросинего тетразолия, описанный в ряде аналогов макроскопической оценки ишемического повреждения миокарда. ("Методические рекомендации. И.В. Иркин, В.Д. Мишалов, Б.В. Михайличенко, В.В. Войченко". http://www.sudmed.ru/index.php?showtopic= 17571&st=30)

Недостатком данного способа является большой объем нитросинего тетразолия и сложный состав раствора (0,2 % раствор яблочной кислоты - 100 мл; 1 % раствор нитро-синего тетразолия - 100 мл ; буфер рН 8,5 - 100 мл; дистиллированная вода 100 мл; при приготовлении раствора необходимо контролировать рН 8-9). Растворы буфера сохраняют каждый отдельно в холодильнике и смешивают перед использованием. По причине значительного разведения рабочего раствора нитросинего тетразолия исследуемые образцы миокарда необходимо выдерживать при температуре 37°C в течение 3 часов. Кроме того, высокая стоимость нитросинего тетразолия, в больших количествах используемого при выполнении данной методики, делает ее дорогостоящей. Более того, в течение 3 часов экспозиции при температуре 37°C в образцах происходят изменения, которые могут привести к искажению результатов световой микроскопии, а также при гистологических и иммуно-гистохимических исследованиях

Известен способ визуализации ишемического повреждения с использованием теллурита калия. Полоску ткани миокарда, в которой предполагается наличие ишемического повреждения, помещают в чашку Петри, заливают 1-2% раствором реактива и оставляют на 30-40 минут в термостате при температуре 37°С. Жизнеспособный миокард окрашивается в темно-коричневый цвет, зона ишемии не окрашивается.

Недостатком данного способа является использование теллурита калия, который чрезмерно и неравномерно "дубит" ткань миокарда, за счёт чего срез сердца значительно деформируется, что в дальнейшем не позволяет производить сканирование срезов.

Известен способ визуализации с использованием трифенилтетразолия хлорида. Данная методика предполагает использование 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида для определения участков ишемического повреждения миокарда. Срезы сердца помещаются в 1% раствор трифенилтетразолия хлорида, после чего выдерживаются в термостате при температуре 37°С в течение 30-40 мин. Неповрежденные участки миокарда окрашиваются в красный цвет, а зоны альтерации остаются неокрашенными. Недостатком данного решения является отсутствие четкой границы между зоной повреждения и интактным миокардом, что затрудняет дальнейшую обработку исследуемого материала в мультимедийной графической программе. Для повышения четкости границ при проведении методики дополнительно добавляют краситель синий Эванса, вследствие этого данный способ является трудоемким и затратным.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа макроскопической визуализации очагов/очага повреждения в миокарде при моделировании ушиба сердца с последующим сканированием срезов для документирования результатов и расчета объема поврежденного миокарда в мультимедийной графической программе.

Техническим результатом является макроскопическая паноптическая идентификация в сердце после экспериментального ушиба нескольких зон: 1) зона повреждения; 2) «переходная зона» - граница между зоной повреждения и неповреждённым миокардом; 3) неповреждённый миокард. Выявление названных зон в миокарде даст возможность осуществить корректный забор образцов миокарда, соответствующих конкретной зоне (повреждения, переходной, неповреждённому миокарду) для изготовления парафиновых блоков и приготовления гистологических срезов. Выявление морфологических изменений позволит получить характеристику каждой зоны миокарда на экспериментальной модели ушиба сердца.

Указанный технический результат достигается тем, что предложен

способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца, в котором: крысу наркотизируют, моделируют ушиб сердца, после чего орган извлекают, изготавливают срезы, окрашивают их раствором нитросинего тетразолия, согласно решения, раствор нитросинего тетразолия предварительно получен растворением в фосфатном буферном растворе при pH=7,4 в концентрации 6 ммоль/л, в процессе окрашивания срезы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 15 мин, далее срезы переворачивают, окрашивают обратную сторону среза, снова выдерживая в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин, после окрашивания в растворе нитросинего тетразолия для повышения контрастности окраски срезы помещают в 10% раствор формалина на 30 минут после чего поврежденные участки миокарда имеют серо-белый цвет, а неповрежденный миокард - сине-черный цвет, затем срезы помещают между двух предметных стёкол, верхнюю и нижнюю поверхности срезов сканируют в цвете при разрешении не менее 4800 пикселей, используя полученные изображения срезов, сначала рассчитывают общую площадь миокарда в каждом срезе и площадь зон механического повреждения миокарда в каждом срезе, а затем рассчитывают соотношение суммы площадей зон механического повреждения во всех срезах к сумме площадей всего миокарда в каждом срезе, перед окрашиванием предварительно каждый срез помещают его нижней поверхностью в фосфатный буферный раствора при pH=7,4, .расчет общей площади миокарда в каждом срезе и площадь зоны механического повреждения миокарда в каждом срез и расчет соотношения суммы площадей зон механического повреждения во всех срезах к сумме площадей всего миокарда в каждом срезе проводят с использованием графической программы обработки изображений.

После моделирования ушиба сердца с использованием оригинального устройства [Долгих В.Т., Корпачева О.В., Ершов А.В., авторы; Омская государственная медицинская академия, патентообладатель Устройство моделирования ушиба сердца у мелких лабораторных животных (патент РФ №37427) извлекали сердца крыс в срок, предусмотренный дизайном исследования посттравматического периода, после чего изготавливали срезы органа. Плоскость срезов проходила перпендикулярно к мысленно проведенной линии от основания сердца к верхушке. Для получения ровного среза с целью предотвращения смещения стенок левого и правого желудочков и межжелудочковой перегородки относительно друг друга, сердце на 5 мин погружали в физиологический раствор хлорида натрия, охлажденный до +4°C, что обеспечивало достаточное уплотнение ткани и позволяло производить ровные срезы, и в то же время не приводило к метаболическим изменениям в клетках, приводящим к нарушению их структуры. Толщина срезов составляла 2-3 мм. При изготовлении срезов использовали лезвия для микротома Patho Cutter-R ERMA Microtome Blades (Япония). Для того, чтобы в дальнейшем отличить переднюю поверхность сердца от задней (нижней), на обращенную к позвоночнику поверхность среза наносили насечку глубиной примерно 0,5 мм. Каждый срез помещали его нижней поверхностью в небольшое количество фосфатного буферного раствора (pH 7,4), предварительно нанесенного на предметное стекло. На верхнюю поверхность среза микропипеткой наносили раствор нитросинего тетразолия в концентрации 6 ммоль/л таким образом, чтобы покрыть всю его верхнюю поверхность. Для приготовления раствора НСТ в концентрации 6 ммоль/л нитросиний тетразолий растворяли ex tempore в фосфатном буферном растворе.

Затем помещали исследуемые срезы в водяную баню, в термостат (t 37°C, экспозиция 15 мин), что не позволяло испаряться воде с поверхности препарата и сохраняло исходную концентрацию растворов, в которые погружен срез. Затем срезы переворачивали, наносили на другую поверхность среза микропипеткой раствор нитросинего тетразолия и снова выдерживали препарат в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После инкубации срезов в растворе нитросинего тетразолия поврежденные участки миокарда имели серо-белый цвет, а неповрежденный миокард - сине-черный цвет. Для повышения контрастности окраски срезы помещали в 10% раствор формалина на 30 минут.

Для расчета объема повреждения, возникшего вследствие тупой травмы сердца, верхняя и нижняя поверхности срезов сканировались в цвете при максимальном разрешении (4800 dpi) на сканере HP Scanjet G3110. Для получения изображения оптимального качества при сканировании срезы помещались между двух предметных стёкол, расстояние между стёклами соответствовало толщине срезов и регулировалось специальными вкладышами для предотвращения чрезмерного поддавливания образца крышкой сканера. Для расчёта объема повреждённого миокарда использовалась мультимедийная система анализа цветных изображений. Вычисляли процентное соотношение объема зоны механического повреждения к общему объему всего миокарда.

Технический результат, обеспечиваемый приведенной совокупностью действий, заключается в получении целостного представления об изменениях в миокарде при тупой травме сердца, т.е. в макроскопической паноптической идентификации зоны механического повреждения миокарда и участков неповрежденного миокарда. Предлагаемый метод обеспечивает получение результата в достаточно короткий срок (60-70 мин). Сканирование срезов на сканере в высоком разрешении создает стандартизированную цветопередачу, отсутствие на изображении бликов, что позволяет в дальнейшем рассчитать объем повреждения миокарда с использованием мультимедийной системы анализа цветных изображений.

Примеры конкретного выполнения окраски срезов сердца нитросиним тетразолием

Пример 1

Эксперимент выполнен на крысе самце массой 312 г. В качестве средства для наркоза на всех инвазивных этапах эксперимента использовали препарат Золетил 100 (тилетамин, золазепам) в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно. Воспроизводили ушиб сердца с помощью оригинальной установки, имитирующей удар передней поверхности грудной клетки о стойку руля. Через 12 ч после ушиба извлекали сердце крысы, промывали его в физиологическом растворе NaCl, после чего сердце на 5 мин погружали в физиологический раствор хлорида натрия, охлажденный до +4°C. После того, как происходило достаточное уплотнение ткани, изготавливали поперечные срезы толщиной 2-3 мм. Для изготовления срезов использовали лезвия для микротома Patho Cutter-R ERMA Microtome Blades (Япония). Всего получилось 6 срезов, которые были пронумерованы с №1 по №6 (№1 - верхушка сердца, №6 - основание сердца).

С целью маркировки на заднюю (обращенную к позвоночнику) поверхность срезов наносили насечку глубиной 0,5 мм. Каждый срез помещали его нижней поверхностью в небольшое количество фосфатного буферного раствора (pH 7,4), предварительно нанесенного на предметное стекло. Для приготовления раствора НСТ (6 ммоль/л) 5 мг нитросинего тетразолия растворяли ex tempore в 1 мл фосфатного буферного раствора. На верхнюю поверхность микропипеткой наносили от 100 до 300 мкл раствора НСТ таким образом, чтобы покрыть все верхние поверхности срезов.

Затем помещали изготовленные срезы в водяную баню и выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После этого срезы переворачивали, наносили на другую поверхность среза микропипеткой раствор нитросинего тетразолия и снова выдерживали препарат в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После инкубации срезов в растворе нитросинего тетразолия повреждённые участки миокарда имели серо-белый цвет, а неповрежденный миокард - сине-черный цвет. Для достижения лучшего контраста между поврежденными участками и интактным миокардом срезы помещали в 10% раствор формалина на 30 минут.

Для расчета объема повреждения, возникших вследствие механического повреждения сердца, срезы помещались между двух предметных стёкол, затем верхняя и нижняя поверхности срезов сканировались в цвете при максимальном разрешении (4800 dpi) на сканере HP Scanjet G3110. Для расчёта объема поврежденного миокарда использовалась мультимедийная система анализа цветных изображений. Вычисляли процентное соотношение объема зоны механического повреждения к общему объему всего миокарда.

Получили следующие изображения (Фиг. 1). Для расчета объема повреждения изображения вводили в программу для обработки изображений обвели зону повреждения и выполнили заливку цветом в Слое 1, в Слое 2 - обводили весь миокард, включая зону повреждения. В таблице 1 представлены результаты расчета площади поврежденного миокарда по результатам обработки изображений в зависимости от номера среза для эксперимента, описанного в примере 1.

Таким образом, общий объем повреждения составил 11,81 %.

Пример 2

Эксперимент выполнен на крысе самце массой 320 г. В качестве средства для наркоза на всех инвазивных этапах эксперимента использовали препарат Золетил 100 (тилетамин, золазепам) в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно. Воспроизводили ушиб сердца с помощью оригинальной установки, имитирующей удар передней поверхности грудной клетки о стойку руля. Через 24 ч после ушиба извлекали сердце крысы, промывали его в физиологическом растворе NaCl, после чего сердце на 5 мин погружали в физиологический раствор хлорида натрия, охлажденный до +4°C. После того, как происходило достаточное уплотнение ткани, изготавливали поперечные срезы толщиной 2-3 мм. Для изготовления срезов использовали лезвия для микротома Patho Cutter-R ERMA Microtome Blades (Япония). Всего получилось 6 срезов, которые были пронумерованы с №1 по №6 (№1 - верхушка сердца, №6 - основание сердца).

С целью маркировки на заднюю (обращенную к позвоночнику) поверхность срезов наносили насечку глубиной 0,5 мм. Каждый срез помещали его нижней поверхностью в небольшое количество фосфатного буферного раствора (pH 7,4), предварительно нанесенного на предметное стекло. Для приготовления раствора НСТ (6 ммоль/л) 5 мг нитросинего тетразолия растворяли ex tempore в 1 мл фосфатного буферного раствора. На верхнюю поверхность микропипеткой наносили от 100 до 300 мкл раствора НСТ таким образом, чтобы покрыть все верхние поверхности срезов.

Затем помещали изготовленные срезы в водяную баню и выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После этого срезы переворачивали, наносили на другую поверхность среза микропипеткой раствор нитросинего тетразолия и снова выдерживали препарат в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После инкубации срезов в растворе нитросинего тетразолия повреждённые участки миокарда имели серо-белый цвет, а неповрежденный миокард - сине-черный цвет. Для достижения лучшего контраста между поврежденными участками и интактным миокардом срезы помещали в 10% раствор формалина на 30 минут.

Для расчета объема повреждения, возникших вследствие механического повреждения сердца, срезы помещались между двух предметных стёкол, затем верхняя и нижняя поверхности срезов сканировались в цвете при максимальном разрешении (4800 dpi) на сканере HP Scanjet G3110. Для расчёта объема поврежденного миокарда использовалась мультимедийная система анализа цветных изображений. Вычисляли процентное соотношение объема зоны механического повреждения к общему объему всего миокарда.

Получили следующие изображения (Фиг. 2). Для расчета объема повреждения изображения вводили в программу для обработки изображений обвели зону повреждения и выполнили заливку цветом в Слое 1, в Слое 2 - обводили весь миокард, включая зону повреждения. В таблице 2 представлены результаты расчета площади поврежденного миокарда по результатам обработки изображений в зависимости от номера среза для эксперимента, проведенного в примере 2.

Таким образом, общий объем повреждения составил 23,27 %.

Пример 3

Эксперимент выполнен на крысе самце массой 315 г. В качестве средства для наркоза на всех инвазивных этапах эксперимента использовали препарат Золетил 100 (тилетамин, золазепам) в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно. Крысу из контрольной группы наркотизировали дважды с интервалом в 24 ч, ушиб сердца не воспроизводили. Далее извлекали сердце, промывали его в физиологическом растворе NaCl, после чего сердце на 5 мин погружали в физиологический раствор хлорида натрия, охлажденный до +4°C. После того, как происходило достаточное уплотнение ткани, изготавливали поперечные срезы толщиной 2-3 мм. Для изготовления срезов использовали лезвия для микротома Patho Cutter-R ERMA Microtome Blades (Япония). Всего получилось 6 срезов, которые были пронумерованы с №1 по №6 (№1 - верхушка сердца, №6 - основание сердца).

С целью маркировки на заднюю (обращенную к позвоночнику) поверхность срезов наносили насечку глубиной 0,5 мм. Каждый срез помещали его нижней поверхностью в небольшое количество фосфатного буферного раствора (pH 7,4), предварительно нанесенного на предметное стекло. Для приготовления раствора НСТ (6 ммоль/л) 5 мг нитросинего тетразолия растворяли ex tempore в 1 мл фосфатного буферного раствора. На верхнюю поверхность микропипеткой наносили от 100 до 300 мкл раствора НСТ таким образом, чтобы покрыть все верхние поверхности срезов.

Затем помещали изготовленные срезы в водяную баню и выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После этого срезы переворачивали, наносили на другую поверхность среза микропипеткой раствор нитросинего тетразолия и снова выдерживали препарат в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После инкубации в растворе нитросинего тетразолия срезы приобретали сине-черный цвет, очагов без окраски не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии повреждения миокарда у крысы из группы контроля. Для фиксации препарата срезы помещали в 10% раствор формалина.

Для сканирования срезы помещались между двух предметных стёкол, затем верхняя и нижняя поверхности срезов сканировались в цвете при максимальном разрешении (4800 dpi) на сканере HP Scanjet G3110. Для обработки изображений использовалась мультимедийная графическая программа.

Получили следующие изображения (Фиг. 3). Обработку изображений производили в мультимедийной графической программе, результаты заносили в таблицу. В таблице 3 представлены результаты расчета площади поврежденного миокарда по результатам обработки изображений в зависимости от номера среза для эксперимента, проведенного в примере 3.

Таким образом, общий объем повреждения составил 0 %.

Вывод

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет получить ровные срезы сердца, макроскопически идентифицировать зону повреждения миокарда, переходную зону и участки неповрежденного миокарда после экспериментального моделирования ушиба сердца в достаточно короткий срок (60-70 мин). Сканирование срезов на сканере в высоком разрешении создает изображение среза со стандартизированной цветопередачей, отсутствием на изображении бликов, позволяя в дальнейшем рассчитать объем повреждения миокарда в мультимедийной системе анализа цветных изображений. Из срезов, помещенных в формалин, через 24 часа возможно изготовление парафиновых блоков для изготовления микропрепаратов. При этом исследователь может выбрать участок для изучения морфологических изменений (поврежденный миокард, неповреждённый миокард, переходная зона, расположенная на границе поврежденного и неповреждённого миокарда) для дальнейшего микроскопического исследования с использованием различных окрасок (например, окраски гематоксилином и эозином), и для иммуногистохимических методов исследования.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, патологической физиологии и экспериментальной медицине. Способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца заключается в следующем: крысу наркотизируют, воспроизводят ушиб сердца, после чего сердце извлекают и изготавливают срезы. Их окрашивают 6 мМ раствором нитросинего тетразолия, растворенного ex tempore в фосфатном буфере, помещают в термостат (t=37°C, экспозиция 15 мин), затем срезы переворачивают, повторно наносят раствор нитросинего тетразолия и еще выдерживают в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин. После этого поврежденные участки миокарда имеют серо-белый цвет, а неповрежденный миокард - сине-черный цвет. Далее срезы сканируют в цвете и в высоком разрешении. Способ позволяет определить локализацию зоны повреждения миокарда и рассчитать объём зоны повреждения с использованием графической программы. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

1. Способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца, в котором: крысу наркотизируют, моделируют ушиб сердца, после чего орган извлекают, изготавливают срезы, окрашивают их раствором нитросинего тетразолия, отличающийся тем, что раствор нитросинего тетразолия предварительно получен растворением в фосфатном буферном растворе при pH=7,4 в концентрации 6 ммоль/л, в процессе окрашивания срезы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 15 мин, далее срезы переворачивают, окрашивают обратную сторону среза, снова выдерживая в термостате при температуре 37°C в течение 15 мин, после окрашивания в растворе нитросинего тетразолия для повышения контрастности окраски срезы помещают в 10% раствор формалина на 30 минут после чего поврежденные участки миокарда имеют серо-белый цвет, а неповрежденный миокард – сине-черный цвет, затем срезы помещают между двух предметных стёкол, верхнюю и нижнюю поверхности срезов сканируют в цвете при разрешении не менее 4800 пикселей, используя полученные изображения срезов, сначала рассчитывают общую площадь миокарда в каждом срезе и площадь зон механического повреждения миокарда в каждом срезе, а затем рассчитывают соотношение суммы площадей зон механического повреждения во всех срезах к сумме площадей всего миокарда в каждом срезе.

2. Способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца по п.1., отличающийся тем, что перед окрашиванием предварительно каждый срез помещают его нижней поверхностью в фосфатный буферный раствора при pH=7,4.

3. Способ макроскопической паноптической визуализации очагов повреждения и расчета объема поврежденного миокарда при моделировании ушиба сердца по п.1., отличающийся тем, что расчет общей площади миокарда в каждом срезе и площадь зоны механического повреждения миокарда в каждом срезе и расчет соотношения суммы площадей зон механического повреждения во всех срезах к сумме площадей всего миокарда в каждом срезе проводят с использованием графической программы обработки изображений.