МАКРОНОСИТЕЛЬ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/07 C12N5/775 

[0001] Настоящее изобретение относится к макроносителю для выращивания биологических клеток. Настоящее изобретение также относится к системе для выращивания биологических клеток, а также способу выращивания биологических клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Для промышленного производства вакцин, ферментов, гормонов и цитокинов необходимы клетки, производимые в значительных масштабах. Кроме того, недавний прогресс терапии стволовыми клетками и других способов терапии с использованием клеток зачастую требует производства масштабируемого количества клеток.

[0003] Клетки можно выращивать в биореакторе, в котором их выращивают на суспендированных микроносителях в среде для культивирования. Микроносители действуют в качестве поддерживающих субстратов, в которых клетки заякориваются во время культивирования. Микроносители являются относительно небольшими, и, как правило, их размер находится в диапазоне от 125 до 250 мкм. Таким образом, их легко суспендировать в средах для культивирования, и они имеют относительно высокое соотношение площади поверхности и объема для обеспечения прикрепления и роста клеток. После стадии культивирования для выделения заякоренные клетки необходимо отделять от бусин микроносителя.

[0004] Существует широкий спектр способов выделения клеток из микроносителей. Например, клетки можно выделять посредством ферментативного расщепления, например, с использованием трипсина, аккутазы или коллагеназы. Однако, хотя такие способы могут быть эффективными для отделения клеток от микроносителей, такая обработка иногда может отрицательно влиять на физиологию получаемых клеток. Она также может отрицательно влиять на качество и жизнеспособность выделяемых клеток.

[0005] Термочувствительные полимеры являются полимерами, демонстрирующими значительное изменение свойств при небольшом изменении температуры. Примером такого полимера является поли-N-изопропилакриламид (PNIPAAm). В зависимости от температуры, PNIPAAm может менять гидрофильную конформацию случайного клубка на гидрофобную, свернутую глобулярную конформацию. Как правило, биологические клетки притягиваются к гидрофобной поверхности и отталкиваются от гидрофильной поверхности. Таким образом, полимер можно использовать для получения поверхности, принимающей клетки, например, при температуре выше пороговой температуры, и поверхности, высвобождающей клетки при снижении температуры. В связи с этим, клетки могут заякориваться в полимере при температуре выше пороговой температуры до того момента, когда потребуется отделение и выделение, затем температуру снижают и открепляют клетки. В отличие от ферментативной обработки, с помощью этого способа открепления можно снижать риск нарушения физиологии клетки. В Cell Transplantation, Vol. 19, pp. 1123-1132, 2010, описано, что термочувствительный полимер PNIPAAm конъюгируют с бусинами микроносителя, имеющими диаметр от 170 до 380 мкм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0006] Исключительно в качестве примера аспекты настоящего изобретения схематически представлены на сопутствующих чертежах, где:

[0007] Фигура 1 представляет собой схему прививки термочувствительного полимера на поверхности PCL и зависящий от температуры эффект прикрепления клеток к привитой поверхности и открепления от нее;

[0008] На фигурах 2a и 2b показаны спектры FTIR и XPS, на которых показана конъюгация PNIPAAm-NH₂ с поверхностью бусин PCL;

[0009] На фигуре 3 показана пролиферация клеток на поверхностях макроносителя;

[0010] На фигурах 4a и 4b показаны данные об откреплении и жизнеспособности клеток, открепляемых от поверхностей макроносителя (т.е. сравнение соотношения открепления клеток и жизнеспособности клеток при трипсинизации и снижении температуры);

[0011] На фигуре 5 показано сравнение пролиферации выделенных клеток для разных прикрепленных клеток при снижении температуры и трипсинизации;

[0012] На фигуре 6 показан анализ вестерн-блоттинга белков, собранных из клеток, выращенных на планшетах для культивирования тканей и термочувствительных макроносителях; клетки открепляли с помощью трипсина-ЭДТА и снижения температуры;

[0013] Фигура 7 представляет собой диаграмму, включающую серию изображений, на которых показано получение гранул PCL;

[0014] На фигуре 8 показаны изображения SEM бусин PCL, полученных способом, описанным в примере 2, и изображения SEM бусин PCL, являющихся коммерчески доступными;

[0015] На фигуре 9 показаны изображения SEM бусин PCL и серия гистограмм, на которых показано распределение размеров бусин;

[0016] На фигуре 10 показаны спектры FTIR и XPS бусин PCL, полученных способом, описанным в примере 2, и бусин PCL, являющихся коммерчески доступными;

[0017] На фигуре 11 показаны изображения SEM и спектры EDS пористых бусин PCL и макроносителей PCL-PNIPAAm;

[0018] На фигуре 12 показано изображение SEM поры на поверхности макроносителя PCL-PNIPAAm;

[0019] Фигура 13 представляет собой серию изображений, на которых показана пролиферация клеток MSC, высеянных на макроносители PCL и PCL-PNIPAAm, наблюдаемая посредством флуоресцентной микроскопии при небольшом увеличении;

[0020] Фигура 14 представляет собой серию изображений, на которых показана пролиферация клеток MSC, высеянных на макроносители PCL и PCL-PNIPAAm, наблюдаемая посредством флуоресцентной микроскопии при большом увеличении;

[0021] На каждой из фигур 15 и 16 показаны гистограммы, на которых проиллюстрирована пролиферация клеток на поверхностях различных макроносителей в течение нескольких дней; и

[0022] На фигуре 17 показаны изображения MSC, открепленных от PCL-PNIPAAm.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0023] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к макроносителю для выращивания биологических клеток. Макроноситель содержит частицы субстрата, покрытые термочувствительным полимером, способным служить в качестве макроносителя с принимающей клетки поверхностью и отвечать на изменение температуры высвобождением клеток из макроносителя, где по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер частиц по меньшей мере 1 мм.

[0024] В другом аспекте настоящее изобретение относится к системе для выращивания биологических клеток. Система содержит биореактор и макроноситель, представленный в настоящем описании.

[0025] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выращивания биологических клеток. Способ включает приведение биологических клеток в контакт с макроносителем по настоящему изобретению в среде для культивирования клеток; подвергание макроносителя воздействию температуры, при которой термочувствительный полимер представляет собой принимающую клетки поверхность, и выращивание клеток на макроносителе; и последующее изменение температуры макроносителя для высвобождения любых выращенных клеток из макроносителя.

[0026] Предпочтительно, значительная доля частиц субстрата имеет размер по меньшей мере 1 мм. В отличие от микроносителей, используемых в биореакторных системах предшествующего уровня техники, размер которых, как правило, составляет от 125 до 250 мкм, с помощью большего размера частиц можно предоставлять биологическим клеткам "более плоскую" поверхность, к которой они могут прикрепляться. Полагают, что эта более плоская поверхность приводит к тому, что прикрепленные клетки менее подвержены скручивающему сжатию или являются менее скрученными и подвержены меньшему напряжению сдвига или механическому стрессу во время перемешивания в биореакторе. В результате, клетки можно подвергать воздействию более мягкой, однородной и оптимальной для выращивания среды. Таким образом, можно повышать качество (например, жизнеспособность и состояние) получаемых клеток. Кроме того, т.к. макроносители по настоящему изобретению покрывают термочувствительным полимером, клетки могут высвобождаться из макроносителя при изменении температура окружающей среды. Это позволяет выделять клетки без необходимости, например, ферментативной обработки, которая может повышать риск повреждения клеток.

[0027] Больший размер частиц также может облегчать сбор и отделение клеток от макроносителя по сравнению с микроносителем. Считают, что клетке будет требоваться больше энергии для открепления от микроносителя по сравнению с макроносителем по причине различий в радиусах и кривизне поверхности носителей.

[0028] На микроносителях клетки склонны слипаться и расти вместе, если их культивируют в биореакторе. Во многих клинических, биотехнологических условиях и условиях тканевой инженерии необходимо получать отдельные клетки, и получение комков клеток может представлять собой проблему. Если клетки культивируют на макроносителях в биореакторе, они, в основном, не агрегируют. Клетки, прикрепленные к макроносителю, также меньше подвержены повреждениям в биореакторе по сравнению с клетками, прикрепленными к микроносителю.

[0029] Как указано выше, по меньшей мере 50% частицы субстрата имеют размер по меньшей мере 1 мм. В некоторых примерах по меньшей мере 70%, предпочтительно - по меньшей мере 80 или 90% частиц субстрата имеют размер по меньшей мере 1 мм. Обеспечивая большой размер значительной доли частиц субстрата, можно воспользоваться преимуществом "более плоской" поверхности носителя. Как описано выше, это позволяет культивировать клетки в более мягких условиях, снижая напряжение сдвига, воздействию которого они подвергаются во время выращивания в биореакторе. В свою очередь, это может приводить, например, к лучшему состоянию и жизнеспособности клеток.

[0030] Предпочтительно, частицы субстрата имеют относительно узкое распределение по размеру. Например, частицы субстрата могут быть достаточно крупными, чтобы иметь желаемую поверхность для прикрепления и выращивания клеток, но в то же время достаточно небольшими для суспендирования в среде для культивирования в биореакторе. Например, по меньшей мере 50% частиц субстрата могут иметь размер от 1 мм до 10 мм. В других примерах по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер от 2 мм до 6 мм. В других примерах по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер от 3 мм до 5 мм. В других примерах по меньшей мере 70% частиц субстрата имеют размер от 1 мм до 10 мм. В других примерах по меньшей мере 70% частиц субстрата имеют размер от 2 мм до 6 мм. В других примерах по меньшей мере 70% частиц субстрата имеют размер от 3 мм до 5 мм. В других примерах по меньшей мере 80% или 90% частиц субстрата имеют размер от 1 мм до 10 мм. В других примерах по меньшей мере 80% или 90% частиц субстрата имеют размер от 2 мм до 6 мм. В других примерах по меньшей мере 80% или 90% частиц субстрата имеют размер от 3 мм до 5 мм. В предпочтительном варианте осуществления от 95 до 100% частиц субстрата имеют размер от 1 до 10 мм, предпочтительно - от 2 до 6 мм, и более предпочтительно - от 3 до 5 мм.

[0031] В макроносителе по настоящему изобретению можно использовать любые подходящие частицы субстрата. Например, частица субстрата может иметь любую подходящую форму, включая, например, по существу, сферическую, эллипсоидную, овоидную или кольцевую форму. В одном из примеров частица субстрата может иметь форму бусины. Бусина может иметь любую подходящую форму, например, по существу, сферическую, эллипсоидную, овоидную или кольцевую. Если частицы субстрата являются несферическими, термин "размер" может относиться к наибольшему линейному измерению частицы субстрата. Например, если частицы субстрата являются эллипсоидными, термин "размер частиц" может относиться к длине основной оси эллипсоида. Предпочтительным может являться, чтобы частицы субстрата являлись, по существу, сферическими.

[0032] Частицу субстрата можно получать из любого подходящего материала. Предпочтительно, материал является биосовместимым материалом, например, биосовместимым полимером. В некоторых примерах материал является биосовместимым в соответствии с ISO 10993. Подходящие материалы включают полисахарид, белок, стекло, полистирол, полиэфир, полиолефин, диоксид кремния, силикон, полиакриламид и полиакрилат. Подходящие полисахариды включают декстран (например, диэтиламиноэтанол (DEAE) - декстран), хитозан и альгинат. Подходящим белком может являться коллаген. Примером подходящего полиакрилата является поли(2-гидроксиэтилметакрилат). Предпочтительно, частица субстрата содержит полиэфир.

[0033] В предпочтительном варианте осуществления частица субстрата содержит полиэфир, выбранный из группы, состоящей из полимолочной кислоты ("PLA"), полигликолевой кислоты ("PGA"), поликапролактона ("PCL"), полибутиролактона ("PBL"), поливалеролактона ("PVL"), полигидроксибутирата ("PHB"), поли(3-гидроксивалерата), полиэтиленсукцината ("PESu") и полибутиленсукцината ("PBSu"). В более предпочтительном варианте осуществления полиэфир является PCL.

[0034] В макроносителе по настоящему изобретению можно использовать любой подходящий термочувствительный полимер. Термочувствительный полимер является полимером, проявляющим значительное изменение свойств при небольшом изменении температуры. В настоящем изобретении термочувствительный полимер, используемый для покрывания частиц субстрата, может снабжать макроноситель принимающей клетки поверхностью, к которой могут прикрепляться клетки. Однако термочувствительный полимер отвечает на изменение температуры высвобождением клеток из макроносителя.

[0035] В некоторых примерах термочувствительный полимер является полимером, изменяющим свою морфологию после изменения температуры. Термочувствительный полимер может состоять из гидрофобных и гидрофильных частей, изменяющих свою ориентацию при изменении температуры, таким образом, чтобы экспонировать свою гидрофобную поверхность или гидрофильную поверхность во внешнюю среду. Например, в одном из вариантов осуществления термочувствительный полимер в ответ на изменение температуры меняет гидрофильную конформацию случайного клубка на гидрофобную, свернутую глобулярную конформацию. Гидрофобную поверхность можно использовать, например, для иммобилизации или прикрепления клеток. С другой стороны, гидрофильная поверхность может отталкивать прикрепленные клетки, позволяя им высвобождаться с поверхности полимера.

[0036] В некоторых примерах пороговая температура равна температуре, подходящей для культивирования, выращивания или дифференцировки клеток, или ниже ее. В другом примере пороговая температура превышает температуру, подходящую для открепления клеток, а также поддержания их качества и жизнеспособности клетки. В другом примере различия диапазона температур между термочувствительным полимером, обеспечивающим принимающую клетки поверхность и отталкивающую клетки поверхность, оптимизируют так, чтобы максимизировать прикрепление клеток для культивирования, выращивания или дифференцировки, а также максимизировать открепление клеток после завершения стадии культивирования, выращивания или дифференцировки. В другом примере различия между температурой, при которой клетки прикрепляются, и температурой, при которой клетки открепляются, необходимо минимизировать для снижения вероятности холодового шока или низкотемпературного стресса выращиваемых клеток.

[0037] В некоторых примерах термочувствительный полимер снабжает макроноситель принимающей клетки (например, гидрофобной) поверхностью при температуре выше пороговой температуры и высвобождает клетки (например, представляя гидрофильную поверхность) из макроносителя при температуре ниже пороговой температуры. Таким образом, макроноситель можно поддерживать при температуре выше пороговой температуры (например, в биореакторе), чтобы сделать возможным прикрепление клеток и облегчить выращивание. Затем температуру можно снижать ниже пороговой температуры для высвобождения выращиваемых клеток из макроносителя. Это может сделать возможным удобное выделение клеток.

[0038] В некоторых примерах пороговая температура может являться температурой от 20°C до 40°C. В некоторых примерах пороговая температура является температурой от 30°C до 40°C. В некоторых примерах пороговая температура является температурой от 30°C до 37°C. В некоторых примерах пороговая температура составляет приблизительно 32°C.

[0039] В некоторых примерах макроноситель можно поддерживать при температуре выше пороговой температуры, облегчающей или позволяющей оптимизировать выращивание и рост клеток, чтобы сделать возможным прикрепление и выращивание клеток на макроносителе. Эта температура может составлять, например, приблизительно от 34 до 39°C, предпочтительно - приблизительно 37°C. Затем макроноситель можно охлаждать, например, до температуры ниже пороговой температуры термочувствительного полимера для высвобождения клеток. Этот макроноситель можно охлаждать до температуры ниже 33°C, например, ниже 32°C. В некоторых примерах для высвобождения выращиваемых клеток макроноситель можно охлаждать до 30°C.

[0040] Для покрывания макроносителя можно использовать ряд термочувствительных полимеров, таких как полимер, выбранный из группы, состоящей из поли(N-изопропилакриламида) ("PNIPAAm"), поли(бутилметакрилата) ("PBMA"), поли(D, L-лактида) ("PDDLA"), поли(N, N-диэтилакриламида) ("PDEAAm"), поли(N-винилкапролактама) ("PNVCL"), поли[2-(диметиламино)этилметакрилата] ("PDMAEMA"), поли(этиленоксид-b-пропиленоксид-b-этиленоксида) ("PEO-PPO-PEO"), поли(этиленгликоль-b-(DL-молочная кислота-гликолевая кислота)-b-этиленгликоля) ("PEG-PLGA-PEG"), поли(метил-2-пропионамидоакрилата) ("PMPA"), поли([DL-молочная кислота-гликолевая кислота]-b-этиленгликоль-b-[DL-молочная кислота-гликолевой кислоты]) ("PLGA-PEG-PLGA"). В примере термочувствительным полимером является PNIPAAm. В зависимости от температуры PNIPAAm может менять гидрофильную конформацию случайного клубка на гидрофобную, свернутую глобулярную конформацию.

[0041] Термочувствительный полимер можно наносить на частицы субстрата в виде покрытия любым подходящим способом. Частицы субстрата можно по меньшей мере частично покрывать термочувствительным полимером.

[0042] В некоторых примерах термочувствительный полимер можно ковалентно присоединять к частице субстрата. Термочувствительный полимер можно соответствующим образом функционализировать с использованием группы, способной образовывать ковалентную связь с соответствующим образом функционализированной частицей субстрата. В некоторых примерах, термочувствительный полимер можно функционализировать с использованием нескольких типов функциональных групп. В некоторых примерах частицу субстрата можно функционализировать с использованием нескольких типов функциональных групп. В некоторых примерах несколько термочувствительных полимеров присоединяют к одной частице субстрата. В некоторых примерах термочувствительный полимер функционализируют с использованием аминогруппы, а частицу субстрата функционализируют с использованием кислотной группы, таким образом, позволяя образовываться амидной связи в качестве ковалентной связи. В другом примере термочувствительный полимер можно функционализировать с использованием кислотной группы, а частицу субстрата можно функционализировать с использованием аминогруппы, таким образом, позволяя образовываться обратной амидной связи в качестве ковалентной связи. В некоторых примерах термочувствительным полимером является PNIPAAm, функционализированный с использованием аминогруппы, и частица субстрата представляет собой PCL, функционализированный с использованием кислотной группы. В объем изобретения входят другие комплементарные группы на PCL и PNIPAAm, способные образовывать амидные связи, такие как, например, сложные эфиры, ацилгалиды и ангидриды, так же как и комплементарные группы, способные образовывать иные ковалентные связи, чем амидные связи. Специалисту в этой области будут очевидны альтернативные комплементарные функциональные группы для сочетания частицы субстрата с термочувствительным полимером в качестве средств для иного ковалентного соединения этих веществ, чем амидная связь. Примеры таких соединительных групп включают гидроксил, тиол, галоген, сульфонил, альдегид, эпоксигруппу и т.п.

[0043] Как правило, частица субстрата не содержит термочувствительный полимер. Таким образом, частицу субстрата нельзя получать из термочувствительного полимера.

[0044] Частицы субстрата могут являться твердыми или пористыми. Если используют пористые частицы, кислород в среде для культивирования может диффундировать через частицы в направлении любых клеток, прикрепленных к поверхности частиц. Пористые частицы могут иметь более низкую плотность, чем непористые частицы, сделанные из того же материала и занимающие тот же объем. Если частицы субстрата имеют относительно низкую плотность, получаемые макроносители могут плавать в биореакторе или легко могут перемешиваться или циркулировать внутри биореактора.

[0045] Частицы субстрата могут иметь относительную плотность относительно воды менее 1 (т.е. при атмосферном давлении и температуре 20°C), такую как <0,85, в частности, <0,70.

[0046] Объемная плотность частиц субстрата, как правило, меньше чем истинной плотности твердого материала, из которого получают частицы субстрата. В рамках изобретения термин "объемная плотность" относится к массе одной или более частиц субстрата, разделенной на общий объем, который они занимают. Измерение объемной плотности включает объем твердого материала, из которого получают частицы, и любые поры, открыты ли они или закрыты. В рамках изобретения термин "истинная плотность" относится к плотности твердого материала, из которого получают частицы. Таким образом, при измерении истинной плотности исключают объем любых открытых или закрытых пор.

[0047] Частицы субстрата могут иметь соотношение объемной плотности и истинной плотности <0,80:1, например, <0,70:1, в частности, <0,60:1. Во избежание неопределенности, измерения объемной плотности и истинной плотности следует проводить при атмосферном давлении и температуре 20°C.

[0048] Поверхности частиц субстрата могут быть пористыми. Пористые поверхности частиц субстрата могут сохраняться после покрывания термочувствительным полимером.

[0049] Макроноситель по настоящему изобретению может иметь поверхность, такую как принимающая клетки поверхность, являющуюся пористой.

[0050] Поры на поверхности макроносителя могут абсорбировать и удерживать питательные вещества и среду, необходимые для роста клеток. Непосредственная близость питательных веществ и среды может облегчать быстрое выращивание клеток таким образом, что можно получать значительное количество клеток высокого качества за меньшее время. Например, при использовании макроносителей, имеющих пористую поверхность, можно достигать стационарной фазы роста клеток быстрее, чем в случае макроносителей, имеющих непористую и плотную поверхность.

[0051] По сравнению с макроносителями, имеющими непористую поверхность, поверхность пористых макроносителей является относительно шероховатой. Эта относительно шероховатая поверхность может способствовать пролиферации клеток, т.к. клетки лучше прикрепляются к шероховатым поверхностям, чем к гладким поверхностям.

[0052] Если поверхность макроносителя, такая как принимающая клетки поверхность, является пористой, то поры могут иметь размер ≤20 мкм, такой как ≤10 мкм, в частности, ≤5 мкм. Как правило, поры имеют размер меньше размера выращиваемой клетки. Размер пор можно определять посредством SEM.

[0053] Макроноситель по настоящему изобретению можно использовать для выращивания любой биологической клетки. Другими словами, клетки могут являться любыми клетками, способными прикрепляться и расти на поверхности макроносителя. Примеры включают линии клеток млекопитающих, а также гибридные линии клеток и клетки опухолевого происхождения. Предпочтительно, клетки являются клетками млекопитающих. Можно культивировать клетки млекопитающих следующих типов: например, клетки костного мозга, карциномы, конъюнктивы, роговицы, эндотелия, эпителия, фибробласты, клетки фибросаркомы, сердца, гепатомы, печени, легких, макрофаги, клетки меланомы, мышц, нейробластомы, остеосаркомы, яичника, поджелудочной железы, гипофиза, рабдомиосаркомы, синовиальной жидкости, щитовидной железы и т.п.

[0054] Например, на макроносителях по настоящему изобретению можно выращивать следующие типы клеток: клетки крупного рогатого скота (клетки эндотелия, почек, мышц), собак (MDCK), кур (клетки эмбрионов, фибробласты, клетки мышц, миобласты), рыб (RTG-2, AS, CHSE-214), морской свинки (GPK), хомяка (BHK, BHK21, BHK21 C13, CHO, CHO-K1, CHO-рекомбинатные)), человека (клетки аденокарциномы, амниотические клетки, клетки рака мочевого пузыря, рака молочной железы, эндотелия, фибробласты, FS, FS-4, HeLa, HEL 299, IMR, K-562, KB, клетки почек, лимфобластоидные клетки, лимфоциты, MCF-7, моноциты, MRC-5, клетки остеосаркомы, поджелудочной железы), обезьян (BSC-1, CV-1, клетки почек, LLC-MK, Vero), мыши (фибробласты, L-929, макрофаги, мезенхимальные клетки), свиньи (клетки эндотелия, яичек, щитовидной железы), крысы (клетки эпителия, миобласты, клетки поджелудочной железы, гипофиза) и индейки (клетки гипофиза). Кроме того, клетки, культивируемые на макроносителях, можно использовать в качестве субстратов для производства вакцин, векторов, природных и рекомбинантных белков, моноклональных антител и других биологических продуктов.

[0055] В другом примере настоящее изобретение относится к композиции множества клеток, прикрепленных к макроносителю. Некоторыми примерами являются мезенхимальные стволовые клетки ("MSC"), дермальные фибробласты человека ("HDF"), эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) и клетки нейробластомы Sy5y.

[0056] В другом примере настоящее изобретение относится к системе для биохимической инженерии, где пролиферировавшие клетки остаются прикрепленными к макроносителю для дальнейшего культивирования для получения различных последующих продуктов до высвобождения клеток. Такие последующие продукты, помимо прочего использования в биологическом производстве, могут включать, например, продукты для клеточной терапии из полученных биологическими способами стволовых клеток, для получения рекомбинантных белков, антител и вирусов и для амплификации гена. Условия для систем культивирования фибробластов для синтеза внеклеточного матрикса и коллагена можно использовать в системе макроносителя с прикрепленными фибробластами по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Материалы и способы

Материалы

[0057] Все материалы приобретали в Sigma-Aldrich (UK) и использовали в том виде, в котором получали. Материалы представляли собой: гранулы поликапролактона (PCL, Mn 80000), гидроксид натрия (NaOH), гидрохлорид 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC), сульфо-N-гидроксисукцинимид (сульфо-NHS), морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и поли(N-изопропилакриламид) с концевыми аминогруппами со средней Mn 2500 (T) (PNIPAAm-NH₂). Деионизированную воду (DI воду), используемую в этом исследовании, получали с помощью системы очистки для получения сверхчистой воды (Elix®, Millipore).

Получение PCL-PNIPAAm

[0058] Гранулы PCL погружали в раствор 1 M NaOH на 1 час с постоянным встряхиванием для получения карбоксилатных ионов PCL-COO^-, затем их несколько раз промывали автоклавированной деионизированной водой (DI). Макроносители PCL-PNIPAAm синтезировали посредством конъюгации гранул PCL-COO^- с PNIPAAm-NH₂ посредством реакции амидирования. Гранулы PCL-COO^- активировали с помощью гидрохлорида 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC, 0,12 M) и сульфо-N-гидроксисукцинимида (сульфо-NHS, 0,06 M) в буферном растворе 0,05 M морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES, 0,05 M) (pH 6) в течение 3 часов при комнатной температуре. К раствору активированного PCL-COO^- добавляли PNIPAAm-NH₂ и осторожно встряхивали при 4°C в течение ночи. Раствор, содержащий макроносители PCL-PNIPAAm, центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 10 мин, пять раз промывали деионизированной дистиллированной водой и лиофилизировали в течение 2 дней.

[0059] Схема реакции приведена ниже:

Характеризация и измерения

[0060] Спектры, полученные посредством Фурье-спектроскопии в инфракрасной области (FTIR), регистрировали с использованием спектрометра для FTIR (Bruker, Tensor 27), оборудованного модулем для спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (ATR, Pike). Перед получением спектров образцов получали фоновый спектр посредством измерения ответа спектрометра без образца.

[0061] Спектры PCL и PCL-PNIPAAm, полученные посредством рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS), получали при базовом давлении 1×10^-9 торр и изменяемой апертуре 3-10 мм и анализировали данные с использованием программного обеспечения для сглаживания пиков CasaXPS.

Культивирование клеток на термочувствительных макроносителях

[0062] Дермальные фибробласты человека (HDF, ThermoFisher Scientific) культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, 4,5 мг/л глюкозы; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), дополненной 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Gibco BRL) и 1% (об./об.) пенициллина-стрептомицина (PS; Gibco BRL), и зеленый флуоресцентный белок (GFP) клонировали в мезенхимальные стволовые клетки (MSC, любезно предоставленные Department of Paediatrics and Adolescent Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong). Перед использованием подготавливали силиконизированные (обработанные Sigmacote®) стеклянные бутыли для предотвращения адгезии клеток к стенкам бутыли. Макроносители PCL и PCL-PNIPAAm промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) в течение 15 мин и инкубировали в DMEM при 37°C в течение ночи.

Оценка жизнеспособности, цитотоксичности и пролиферации клеток

[0063] Жизнеспособность, цитотоксичность и пролиферацию клеток определяли посредством анализа CCK-8 (Sigma). Для измерения эффективности прикрепления клеток к макроносителям в течение 24 часов культивирования осторожно удаляли несодержащий макроноситель супернатант и определяли количество клеток в супернатанте с использованием гемоцитометра. Вычисляли количество клеток, прикрепленных к макроносителям, вычитая количество клеток в супернатанте из общего количества клеток при инокуляции. Выход прикрепления вычисляли следующим образом:

Выход прикрепления (%) = (количество клеток, прикрепленных к макроносителям/общее количество клеток при инокуляции)×100.

Открепление клеток от макроносителей

[0064] Через 1 день культивирования в суспензии температуру среды для культивирования снижали с 37°C до 30°C с использованием инкубатора, и HDF, культивируемые на двух типах макроносителей, инкубировали в течение 40 мин при 30°C. Количество открепленных клеток в несодержащем макроноситель супернатанте подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Соотношение открепления клеток = [количество открепленных клеток]/[общее количество прикрепленных клеток на макроносителях перед откреплением]×100.

Экспрессия белков внеклеточного матрикса (ECM)

[0065] Экспрессию белков ECM HDF анализировали посредством вестерн-блоттинга. Для детекции фибронектина, ламинина и коллагена I на открепленных клетках использовали антитела против фибронектина (1:200, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA), ламинина (1:200, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) и коллагена I (1:50, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA).

[0066] Для анализа вестерн-блоттинга HDF промывали и собирали в лизирующий буфер (RIPA, Millipore, Milford, MA, USA), перемешивали вихревым способом на льду 5 раз в течение 20 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об./мин. и 4°C. В качестве белков для анализа использовали антитела против фибронектина, ламинина и коллагена типа I. В качестве контроля "домашнего хозяйства" использовали антитело против бета-актина. Иммунные комплексы визуализировали с использованием усиленного хемилюминесцентной меткой реагента.

Статистический анализ

[0067] Все количественные данные выражали как среднее ± SD. Статистический анализ осуществляли посредством двухстороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием критерия достоверно значимой разности Тьюки. Все анализы осуществляли с использованием GraphPad Prism 6, при этом значения p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Характеризация макроносителей PCL с привитым PNIPAAm

[0068] На фигуре 1 показана схема прививки термочувствительного полимера на поверхности PCL и зависящий от температуры эффект прикрепления клеток к привитой поверхности и открепления от нее. Снижение температуры до 30°C вызывает открепление клеток благодаря гидрофильной конформации PNIPAAm. При 37°C PNIPAAm находится в глобулярной конформации, что снабжает макроноситель PCL гидрофобной поверхностью. Когда температуру снижают до 30°C, изменение конформации в конформацию случайного клубка делает поверхность гидрофильной по своей природе. Гидрофобная поверхность привлекает клетки, а гидрофильная поверхность отталкивает клетки.

[0069] Для прививки термочувствительного полимера на поверхности бусин PCL полимеры PNIPAAm-NH₂ конъюгировали с бусинами PCL посредством амидирования между карбоксилатной молекулой на поверхности бусины PCL и концевой аминогруппой PNIPAAm-NH₂. Гранулы PCL сначала обрабатывали NaOH, что вызывало щелочной гидролиз сложноэфирных связей в PCL, приводя к образованию ионов карбоксилата. Эти карбоксильные функциональные группы на бусинах PCL можно активировать с помощью EDC и NHS для образования сукцинимидных сложных эфиров, которые, в свою очередь, спонтанно реагируют с аминогруппами на PNIPAAm-NH₂. Реакция карбоксилата с EDC приводит к образованию нестабильного реакционноспособного сложного эфира O-ацилизомочевины. Затем для стабилизации промежуточного соединения добавляют сульфо-NHS, преобразующий нестабильную O-ацилизомочевину в амино-реактивный сложный эфир NHS. Этот сложный эфир будет реагировать с концевой аминогруппой PNIPAAm-NH₂ с образованием стабильной ковалентной амидной связи между бусинами PCL и PNIPAAm-NH₂. Схема конъюгации PNIPAAm-NH₂ с PCL показана на фигуре 1.

[0070] Спектроскопию FTIR использовали для подтверждения конъюгации PNIPAAm-NH₂ с поверхностью бусин PCL. На спектре FTIR на фигуре 2a показано появление нескольких новых пиков по причине встраивания PNIPAAm-NH₂ в PCL-COOH. Широкий пик между 3550 и 3200 см^-1 относится к валентным колебаниям связи N-H модифицированных бусин PCL. Повышение пика в области 2940 см^-1 приписывают валентным колебаниям алифатических групп (-CH₂-)_n сополимера. Повышение пика в области 1647 см⁻¹ может являться признаком амидной связи I, являясь результатом валентных колебаний связи C=O и небольших валентных колебаний связи C-N PNIPAAm. Пики в области 1565 см^-1, соответствующие амидной связи II, являются результатом деформационных колебаний связи N-H и валентных колебаний связи C-N в PNIPAAm. Это позволяет предполагать, что конъюгация PNIPAAm с бусинами PCL была успешной.

[0071] С помощью XPS определяют химическую композицию нескольких верхних нанометров поверхности. Появление нового сигнала N1s с энергией связывания 400 эВ после прививки PNIPAAm на спектрах широкоугольной XPS, показанных на фигуре 2b, свидетельствовало об успешной прививке PNIPAAm на поверхности макроносителей PCL. Спектры остовного уровня N1s PCL-P подвергали аппроксимации кривой с пиком 399,4 эВ, приписываемым аминогруппе (-NH₂). Детекция N и C из связей C=O означает, что PNIPAAm-NH₂ присутствует на поверхности бусин PCL.

Оценка жизнеспособности, цитотоксичности и пролиферации клеток

[0072] Для оценки того, оказывали ли привитый материал и другие химические реакции при прививке какое-либо неблагоприятное воздействие на рост и жизнеспособность клеток, авторы настоящего изобретения использовали анализ CCK-8 на жизнеспособность в течение до 7 дней. Хотя по сравнению с контролем в случае поверхностей PCL и PCL-PNIPAAm наблюдали сниженную жизнеспособность, определяли устойчивое повышение пролиферации клеток на обеих поверхностях, как показано на фигуре 3. Результаты свидетельствуют о том, что клетки HDF и MSC выживали и пролиферировали на PCL и PCL-P (PCL-PNIPAAm) и планшете для культивирования тканей в качестве контрольных (TCP CON) поверхностей в течение 1, 3 и 7 дней (a). В день 7 наблюдали значительное повышение OD для обоих типов клеток по сравнению с днем 1 и 3, а также оба типа клеток лучше выживали на поверхностях PCL-P, чем поверхностях PCL (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ns: без значимых различий). Кроме того, наблюдали немного более высокую степень пролиферации на привитых поверхностях, чем на непривитом PCL (*p<0,05 в день 7).

[0073] В совокупности, эти результаты позволяют предполагать, что прививка PNIPAAm на поверхности PCL нбыла безопасной и, таким образом, представляет собой полезный инструмент для выделения крупномасштабных коллекций клеток.

Открепление клеток от макроносителей

[0074] Для определения эффективности открепления клеток посредством снижения температуры до 30°C авторы настоящего изобретения сравнивали клетки, выделенные в условиях сниженной температуры, с клетками в условиях трипсинизации.

[0075] На фигуре 4a показано, что клетки HDF и MSC в условиях сниженной температуры (30°C) демонстрировали значимо более высокий показатель открепления клеток от поверхностей PCL-PNIPAAm, чем от поверхностей только PCL. При трипсинизации не наблюдали значимых различий в степени открепления клеток между поверхностями, но в случае этого способа наблюдали более значительное открепление клеток от поверхностей и PCL, и PCL-PNIPAAm. На фигуре 4b показано, что наблюдали более высокий показатель жизнеспособности клеток в способе зависящего от температуры выделения клеток, чем при трипсинизации. И HDF, и MSC имели более высокую выживаемость при выделении с помощью PCL-PNIPAAm, чем при трипсинизации (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ns: без значимых различий).

[0076] На фигурах 4a и 4b показано, что более 70% клеток откреплялись от привитых PNIPAAm поверхностей PCL при простом снижении температуры. В отличие от этого, при трипсинизации наблюдали более высокий показатель открепления, чем в случае способа со снижением температуры с использованием термочувствительного полимера. Это не было неожиданным; другие исследовательские группы также сообщали о более высоких показателях открепления при ферментативном расщеплении, чем при снижении температуры. Однако, физиологическое повреждение, вызванное трипсином или другими ферментами, является основной причиной, по которой исследователи хотят избежать ферментативного расщепления в условиях клинического использования.

Пролиферация выделенных клеток после открепления от PCL-PNIPAAm

[0077] Для демонстрации выращивания и пролиферации при немедленном пассаже собранных и выделенных клеток осуществляли сравнительный анализ жизнеспособности в течение 1, 3 и 7 дней для обработанных трипсином и выделенных клеток и обработанных посредством снижения температуры и выделенных клеток (фигуры 5a и 5b). Клетки HDF (фигура 5a) и MSC (фигура 5b) выделяли с поверхностей PCL-PNIPAAm, собирали и выращивали в течение 1, 3 и 7 дней в средах для культивирования. После выделения клеток с использованием трипсина-ЭДТА или снижения температуры равные количества клеток высевали для анализа пролиферации. Исследования CCK-8 показали, что, когда типы клеток выделяли с поверхностей PCL-PNIPAAm с использованием сниженной температуры, рост клеток являлся экспоненциальным и значительным в течение периода времени. Однако при сборе посредством трипсинизации рост клеток являлся неэкспоненциальным и незначительным в течение периода времени (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; ns: без значимых различий). Результаты свидетельствуют о логарифмическом росте со значительным повышением количеств клеток в случае обоих типов клеток, собранных с поверхностей PCL-PNIPAAm посредством снижения температуры. Эти результаты четко свидетельствуют о том, что способ выделения клеток, включающий снижение температуры, являлся более эффективным, чем способ выделения трипсином-ЭДТА.

ECM на клетках, открепленных от макроносителей PCL-PNIPAAm

[0078] Картину экспрессии белков ECM на клетках, открепленных от PCL-PNIPAAm с помощью трипсина или снижения температуры, анализировали посредством иммуноблоттинга. В этом исследовании авторы настоящего изобретения высевали HDF на планшет для культивирования тканей и PCL-PNIPAAm, инкубировали в течение 7 дней, а затем собирали их посредством обработки трипсином-ЭДТА или просто посредством снижения температуры. Затем клетки подвергали иммуноокрашиванию или анализу общего белка посредством вестерн-блоттинга. Три основных структурных белка ECM, таких как фибронектин (FN), ламинин (LM) и коллаген типа I (Col I), являющиеся наиболее многочисленными и важными белками ECM, обнаруживаемыми в клетках/тканях, играют разные роли в эмбриональном развитии, регенерации тканей и ангиогенезе. Из-за своих "клееподобных" свойств эти белки, как правило, играют роль в прикреплении клеток к поверхностям. Авторы настоящего изобретения исследовали эти белки, чтобы узнать, влияет ли способ, используемый для выделения клеток, на их экспрессию.

[0079] Как показано на фигуре 6, профили экспрессии фибронектина, ламинина и коллагена I в выделенных клетках HDF (после открепления и сбора) анализировали посредством вестерн-блоттинга. Все белки собирали из клеток, выращенных на планшетах для культивирования тканей, посредством сбора всех клеток с использованием трипсина-ЭДТА (контроль-TE) или соскребания монослоя клеток скребком (контроль-скребок). Клетки также выращивали на бусинах PCL-PNIPAAm и собирали с помощью трипсина-ЭДТА (PCL-P-TE) или снижения температуры (PCL-P-снижение температуры). Антитела против ламинина, фибронектина и коллагена против 1 использовали для детекции экспрессии этих белков посредством вестерн-блоттинга после сбора этих клеток четырьмя разными способами. β-актин использовали в качестве белка "домашнего хозяйства".

[0080] Экспрессия фибронектина и ламинина в клетках, открепленных от PCL-PNIPAAm посредством снижения температуры, была выше, чем в клетках, открепленных посредством трипсинизации. Однако обнаружено, что коллаген 1 экспрессировался в клетках в равной степени, и два способа выделения не влияли не него значимо. Этот результат соответствовал данным иммуноокрашивания и, в целом, свидетельствовал о том, что трипсинизация может неблагоприятно влиять на структуру и физиологию клеток, просто вызывая деградацию некоторых из структурных белков ECM.

Пример 2

Материалы и способы

Материалы

[0081] Гранулы поликапролактона (PCL, Mn 80000), поливиниловый спирт (PVA, Mw=13-23 КДа, на 87-89% гидролизованный) и дихлорметан (DCM) приобретали в Sigma-Aldrich (UK). Деионизированную воду (DI воду), используемую в этом исследовании, получали с помощью системы очистки для получения сверхчистой воды (Elix™, Millipore).

Получение макробусин PCL

[0082] Макробусины PCL получали с использованием общеизвестного эмульсионного способа с последующим выпариванием растворителя, используемого для ожижения полимера макросфер.

[0083] Аликвоту гранул PCL растворяли в DCM для получения органических фаз с 10, 12, 15 и 18% масс./об., в то время как PVA растворяли в DI воде для получения неорганических фаз с 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 3,0% масс./об.

[0084] Шприц с иглой (содержащий 5 мл раствора PCL) подключали к насосу, используемому для получения капель раствора PCL/DCM, являющихся предшественниками отвержденных бусин. 5 мл образовавшихся капель PCL/DCM собирали в чашку Петри, содержащую 10 мл раствора PVA. Затем раствор PVA сливали. Растворителю DCM позволяли испаряться через водную фазу в течение 3 дней в вытяжном шкафу, что, таким образом, приводило к отверждению капель.

Результаты и обсуждение

[0085] Бусины PCL получали с помощью выпаривания растворителя из эмульсии "масло-в-воде". На первой стадии органическую фазу эмульгировали во внешней водной фазе. Органическая фаза представляла собой дихлорметан. Благодаря низкой температуре испарения дихлорметана макросферы образовывались быстрее, чем при использовании других растворителей, имеющих более высокую температуру испарения, таких как хлороформ. С испарением органического растворителя с поверхности капель концентрация PCL повышается и достигает критической точки, в которой концентрация полимера превышает его растворимость в органической фазе. В этой критической точке он осаждается с образованием макросфер. Способ, используемый для производства макросфер PCL, показан на фигуре 7. Гранулы PCL, полученные этим способом, также показаны на фигуре 7 (см. "Гранулы PCL-Oxford") вместе с гранулами PCL, приобретенными в Sigma-Aldrich ("Гранулы PCL-Sigma").

Эффект концентрации PCL в отношении образования бусин

[0086] Влияние концентрации PCL на образование бусин анализировали с использованием 10, 12, 15 и 18% масс./об., как показано в таблице 1.

Концентрация PCL (% масс./об.) Капля Образование бусин (после отверждения) Скорость нагнетания (мл/мин) Концентрация PVA (% масс./об.) 10 Да Нет 0,4 3 12 Да Нет 15 Да Да 18 Нет Не определено

Таблица 1. Эффект концентрации PCL в отношении образования бусин

[0087] Капли образовывались при концентрации PCL 10, 12 и 15% масс./об. и не образовывались при 18% масс./об. После стадии отверждения бусины получали только при 15% масс./об. PCL. Таким образом, концентрацию PCL 15% масс./об. выбирали в качестве оптимальной концентрации для дальнейших экспериментов.

Эффект скорости потока в отношении размера бусин

[0088] В таблице 2 представлена взаимосвязь между скоростью потока и размером бусин.

Концентрация PCL (% масс./об.) Концентрация PVA (% масс./об.) Скорость нагнетания (мл/мин) Размер бусин (мм) 15 3 0,2 <0,5 0,4 0,5-2,0 0,8 2,0-3,0 1,2 Слишком высокая скорость

Таблица 2. Эффект скорости потока в отношении размера бусин

[0089] При повышении скорости потока размер бусин повышался. При более высокой скорости потока диспергированной фазы поступает больший объем раствора PCL/DCM в случае каждой образующейся капли. Это явление приводило к получению более крупных макробусин, образовавшихся из растворов PCL/DCM одинаковой концентрации.

Эффект концентрации PVA в отношении размера бусин

[0090] PVA использовали в качестве эмульгатора. После получения макросфер, как описано выше, их промывали DI водой несколько раз для удаления PVA.

[0091] Гидроксильные группы в PVA взаимодействуют с водной фазой, в то время как полимерная цепь взаимодействует с дихлорметаном, делающим полученную эмульсию более стабильной. Изменения концентрации PVA и объема могут влиять на стабильность эмульсии, которая, в свою очередь, может влиять на размер макросфер. Как показано в таблице 3, повышение концентрации PVA приводит к снижению размера макросфер.

Концентрация PCL (% масс./об.) Скорость нагнетания (мл/мин) Концентрация PVA (% масс./об.) Размер бусин (мм) Тип бусин (в зависимости от размера) 15 0,4 0,5 2,7-3,7 Бусина 1 1,0 1,8-2,2 Бусина 2 1,5 1,2-1,5 Бусина 3 2,0 0,5-1,0 Бусина 4 3,0 0,5-1,0 Бусина 4

Таблица 3. Эффект концентрации PVA в отношении размера бусин

[0092] При повышении концентрации PVA большее количество молекул PVA покрывает поверхность капель, обеспечивая повышенную защиту капель от слипания, что приводит к получению меньших капель эмульсии. Т.к. макросферы получали из капель эмульсии после испарения растворителя, их размер зависел от размера капель эмульсии. Кроме того, вязкость водного раствора была более высокой при высоких концентрациях PVA по сравнению с более низкими концентрациями, что может являться еще одним фактором, влияющим на отделение капель в эмульсии друг от друга.

Характеризация и измерения

[0093] Анализ посредством растровой электронной микроскопии (SEM) и энергодисперсионной спектроскопии (EDS): морфологию поверхности макроносителей PCL и PCL-PNIPAAm анализировали посредством SEM (растровый электронный микроскоп Carl Zeiss Evo LS15 VP с детекторами SE, BSE, VPSE, EPSE) при ускоряющем напряжении 10 кВ. Перед анализом SEM образцы покрывали золотом посредством напыления. Для анализа EDS использовали рентгеновскую систему INCA X-Act (Oxford Instruments) и систему OIM XM 4 Hikari EBSD (EDAX).

[0094] Спектры, полученные посредством Фурье-спектроскопии в инфракрасной области (FTIR), регистрировали с использованием того же оборудования и способа, которые описаны в примере 1.

Распределение размера, морфология и FITR макробусин PCL

[0095] На фигуре 8 показана морфология макробусин PCL, полученных описанных выше способом (см. изображения, помеченные (A), представляющие собой бусины "PCL-Oxford") и приобретенных в Sigma (см. изображения, помеченные (B), представляющие собой бусины "PCL-Sigma"). Поверхность бусины, показанной на (A), являлась пористой, в то время как поверхность бусины, показанной на (B), являлась непористой и плотной. Поры можно получать посредством быстрого осаждения PCL, например, с использованием органического растворителя (например, DCM), имеющего низкую температуру испарения, на стадии отверждения. Поры могут абсорбировать и удерживать питательные вещества и среду на поверхности бусин. Пористая поверхность может лучше способствовать адгезии и росту клеток, чем плотная поверхность.

[0096] Как показано в таблице 3 выше, получали четыре типа бусин, описанных выше, при 15% масс./об. PCL, скорости нагнетания 0,4 мл/мин и различных концентрациях PVA в диапазоне от 0,5 до 3,0% масс./об. Бусины имели диаметры в диапазоне от 0,5 до 3,7 мм. Бусина 1 имела диаметр в диапазоне 2,7-3,7 мм, бусина 2 имела диаметр в диапазоне 1,8-2,2 мм, бусина 3 имела диаметр в диапазоне 1,2-1,5 мм, и бусина 4 имела диаметр в диапазоне 0,5-1,0 мм. Морфология и распределение размера этих бусин показаны на фигуре 9. Контролируя концентрацию PVA и скорость потока, можно контролировать размер бусин для достижения однородного размера. Средний размер бусины 1 составлял 3,09 мм, бусины 2-1,89 мм, бусины 3-1,37 мм, и бусины 4-0,83 мм.

[0097] Результаты определения спектров FITR PCL-Oxford и PCL-Sigma показаны на фигуре 10. Эти результаты свидетельствуют о том, что все пики PCL-Oxford соответствовали всем пикам PCL-Sigma, что подтверждает, что способ производства не приводил к изменению структуры PCL.

Морфология макробусин PCL и PCL-PNIPAAm

[0098] Пористые макробусины PCL (например, бусины "PCL-Oxford") покрывали PNIPAAm способом, описанным в примере 1. Морфологию поверхности PCL и полученных макробусин PCL-PNIPAAm охарактеризовывали посредством SEM, как показано на фигуре 11 (на фигуре макробусины PCL-PNIPAAm помечены как "PCL-P"). Стадия прививки PNIPAAm на пористые бусины PCL не влияла на морфологию их поверхности. Это можно видеть на фигуре 12, где показана пора поверхности макробусины PCL-PNIPAAm.

[0099] Появление пика азота на изображениях EDS (см. фигуру 11) в случае PCL-PNIPAAm (см. между пиками C и O на изображении EDS для "PCL-P) подтверждало, что полимеризацию осуществляли правильно. Наличие покрытия PNIPAAm не влияло на морфологию поверхности коммерчески доступных бусин PCL (например "PCL Sigma").

Культивирование клеток на макроносителях

[00100] Зеленый флуоресцентный белок (GFP) клонировали в мезенхимальные стволовые клетки (MSC, предоставленные Department of Paediatrics and Adolescent Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong). В кратком изложении, первичные мезенхимальные клетки (полученные из нефракционированных мононуклеарных клеток костного мозга здорового донора) культивировали в течение 2 месяцев. Клетки инфицировали VSV-G (экспрессирующим гликопротеин G вируса везикулярного стоматита), псевдотипированным ретровирусным вектором, содержащим гены hTERT и зеленого флуоресцентного белка (GFP), разделенные внутренним участком связывания рибосомы (IRES), под контролем длинного концевого повтора (LTR) вируса стволовых клеток мыши (MSCV). Затем GFP⁺ и GFP^- MSC разделяли с помощью 6-струйного сортера для активируемой флуоресценции сортировки клеток (MoFlo, Cytomation, Fort Collins, CO, USA). MSC-GFP культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, 1,0 мг/л глюкозы, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), дополненной 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, Gibco BRL) и 0,1% (об./об.) пенициллина-стрептомицина (PS, Gibco BRL).

[00101] Макробусины PCL и PCL-PNIPAAm, полученные, как описано выше, помещали в ламинарный шкаф и подвергали воздействию УФ-излучения в течение 30 минут. Затем бусины PCL и PCL-PNIPAAm погружали в 70% этанол на 3 часа, промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) в течение 10 мин и инкубировали в DMEM при 37°C в течение ночи. Плотность высевания клеток составляла 2,8×10⁵ клеток/мл.

[00102] Пролиферация клеток MSC, высеянных на PCL и PCL-PNIPAAm через 3 и 7 дней инкубации, определяемая посредством окрашивания Hoechst и зеленым флуоресцентным белком (GFP), показана на фигурах 13 и 14. На фигуре 13 показана пролиферация клеток MSC, высеянных на PCL (см. (A)) и PCL-PNIPAAm (см. (B)) через 3 и 7 дней, окрашенных Hoechst (окрашивание ядер синими точками), определяемая с помощью флуоресцентного микроскопа при небольшом увеличении. На фигуре 14 показана пролиферация клеток MSC, высеянных на PCL (см. (A)) и PCL-PNIPAAm (см. (B)) через 3 и 7 дней, окрашенных Hoechst (окрашивание ядер синими точками) и зеленым флуоресцентным белком, определяемая с помощью флуоресцентного микроскопа при большом увеличении. Черный фон, включающий крупные области синих точек, представляет собой бусины.

[00103] Количество клеток (синие точки) на PCL и PCL-PNIPAAm повышалось с повышением времени культивирования с 3 дней до 7 дней. PCL, используемый в этой работе, имел молекулярную массу 80 кДа (PCL80k). Наблюдали очень плотные и кластеризованные клетки с более высокой жизнеспособностью в день 7 и на привитых поверхностях (PCL-PNIPAAm), чем в день 3 и на непривитых поверхностях PCL. Примечательно, что обе группы клеток являлись жизнеспособными и демонстрировали нормальную физиологию и веретенообразный внешний вид. Эти результаты свидетельствуют о том, что прививка PNIPAAm на поверхности PCL была безопасной и может представлять собой полезный инструмент для выделения крупномасштабных коллекций клеток.

Пролиферация клеток

Первое исследование

[00104] Для оценки жизнеспособности и пролиферации клеток осуществляли анализ CCK-8 (Sigma) через 1, 7, 14 и 21 день инкубации. Плотность высевания клеток составляла 5×10³ клеток/мл. Для этого эксперимента в лаборатории подготавливали приблизительно 20 г бусин PCL.

[00105] В этом исследовании зависимости от времени пролиферацию MSC наблюдали с 1 по 21 день на PCL-PNIPAAm и сравнивали рост и пролиферацию с разными контролями, нанесенными на планшет для культивирования тканей (TCP), непокрытые бусины PCL и бусины PCL от Sigma. Результаты показаны на фигуре 15.

[00106] В день 1 обнаружили, что клетки росли незначительно на всех типах поверхностей. Ко дню 7 клетки пролиферировали значимо лучше на контролях TCP, чем на покрытых PNIPAAm поверхностях PCL и коммерчески доступных бусинах PCL ("PCL-Sigma"). Не наблюдали значимых различий в пролиферации между клетками на непокрытом PCL и клетками на образцах PCL-PNIPAAm. Однако наблюдали небольшое значимое различие пролиферации клеток между (a) непокрытыми поверхностями PCL и коммерчески доступными бусинами PCL (p<0,01) и (b) образцами PCL-PNIPAAm и коммерчески доступными бусинами PCL (p<0,05).

[00107] В день 14 обнаружили, что клетки пролиферировали на всех образцах и контролях. Измеренные количества пролиферировавших клеток на непокрытом PCL, PCL-PNIPAAm и коммерчески доступных бусинах PCL были незначимыми. Ко дню 14 пролиферация клеток на TCP была немного ниже, чем на любой другой поверхности. В день 21 рост клеток на непокрытом PCL, PCL-PNIPAAm и PCL-Sigma был значимо выше по сравнению с пролиферацией клеток на TCP.

[00108] Можно видеть экспоненциальную пролиферацию MSC на всех поверхностях с течением времени. Ко дню 21, по сравнению с днями 14 и 21, обнаружили, что клетки находились в стационарной фазе, и наблюдали неэкспоненциальный профиль роста. Это являлось результатом конфлюэнтного роста MSC; не оставалось места для какого-либо нового роста клеток в культуре.

Второе исследование

[00109] Во втором исследовании использовали тот же способ, что и в первом исследовании, за исключением того, что плотность высевания клеток составляла 1×10⁴ клеток/мл, и осуществляли анализ CCK-8 (Sigma) через 1, 3 и 7 дней инкубации. Результаты показаны на фигуре 16.

[00110] В день 3 клетки, выращенные на пористых поверхностях PCL и пористых поверхностях PCL-PNIPAAm, демонстрировали схожие характеристики. Однако наблюдали значимое (p<0,0001) повышение OD в случае пористого PCL по сравнению с коммерчески доступными бусинами PCL ("PCL-Sigma"). Жизнеспособность клеток в день 7 имела тот же профиль, что и в день 3, за исключением того, что больше клеток выживало на поверхностях пористых бусин PCL, чем на поверхностях коммерчески доступных бусин. Не наблюдали значимых различий жизнеспособности клеток в случае поверхностей PCL и PCL-PNIPAAm.

[00111] Учитывая результаты, можно видеть, что клетки лучше росли на пористых бусинах PCL, чем на коммерчески доступных бусинах PCL.

Открепление клеток от PCL-PNIPAAm

[00112] Открепление MSC от поверхностей PCL-PNIPAAm анализировали посредством флуоресцентной микроскопии. Нагруженные GFP MSC выращивали на образцах поверхностей в течение ночи при 37°C. После этого исходного прикрепления температуру инкубации снижали с 37°C до 25°C по меньшей мере на 1 час. Клетки, открепленные от PCL-PNIPAAm, наблюдали и визуализировали с помощью инвертированного микроскопа (Eclipse Ti, Nilon). Зеленая флуоресценция клеток указывала на свободные клетки в культуре. На фигуре 17 показаны MSC, открепленные от PCL-PNIPAAm, при (a) небольшом увеличении и (b) большом увеличении.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлен макроноситель, который содержит частицы субстрата, покрытые термочувствительным полимером, способным снабжать макроноситель принимающей клетки поверхностью и отвечающим на изменение температуры высвобождением клеток из макроносителя. По меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер по меньшей мере 1 мм. Настоящее изобретение также относится к системе для выращивания биологических клеток и способу выращивания биологических клеток. Изобретение применяется для эффективного выращивания биологических клеток. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Макроноситель для выращивания биологических клеток, содержащий частицы субстрата, покрытые термочувствительным полимером, снабжающим макроноситель принимающей клетки поверхностью и отвечающим на изменение температуры высвобождением клетки из макроносителя, где

принимающая клетки поверхность является пористой;

частицы субстрата получены из биосовместимого материала, где материал является биосовместимым в соответствии с ISO 10993;

термочувствительный полимер выбран из группы, состоящей из поли(N-изопропилакриламида) ("PNIPAAm"), поли(бутилметакрилата) ("PBMA"), поли(D, L-лактида) ("PDDLA"), поли(N,N-диэтилакриламида) ("PDEAAm"), поли(N-винилкапролактама) ("PNVCL"), поли[2-(диметиламино)этилметакрилата] ("PDMAEMA"), поли(этиленоксид-b-пропиленоксид-b-этиленоксида) ("PEO-PPO-PEO"), поли(этиленгликоль-b-(DL-молочная кислота-гликолевая кислота)-b-этиленгликоля) ("PEG-PLGA-PEG"), поли(метил-2-пропионамидоакрилата) ("PMPA"), поли([DL-молочная кислота-гликолевая кислота]-b-этиленгликоль-b-[DL-молочная кислота-гликолевой кислоты]) ("PLGA-PEG-PLGA");

каждая частица субстрата имеет сферическую, эллипсоидную, овоидную или кольцевую форму;

по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер от по меньшей мере 1 мм,

где размер частиц представляет собой наибольший линейный измеренный размер частицы субстрата.

2. Макроноситель по п.1, где частицы субстрата являются пористыми.

3. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где биосовместимый материал выбран из полисахарида, белка, стекла, полистирола, сложного полиэфира, полиолефина, диоксида кремния, силикона, полиакриламида и полиакрилата.

4. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер от 1 до 10 мм.

5. Макроноситель по п.4, где по меньшей мере 50% частиц субстрата имеют размер от 2 до 6 мм.

6. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 70% частиц субстрата имеют размер от 1 до 10 мм.

7. Макроноситель по п.5, где по меньшей мере 70% частиц субстрата имеют размер от 2 до 6 мм.

8. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 90% частиц субстрата имеют размер от 1 до 10 мм.

9. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 90% частиц субстрата имеют размер от 2 до 6 мм.

10. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где частицы субстрата частично покрыты термочувствительным полимером.

11. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где частицы субстрата содержат поликапролактон.

12. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где термочувствительный полимер снабжает макроноситель принимающей клетки поверхностью при температуре выше пороговой температуры и высвобождает клетки из макроносителя при температуре ниже пороговой температуры.

13. Макроноситель по п.12, где пороговая температура является температурой от 20 до 40°C.

14. Макроноситель по п.1, где термочувствительный полимер может менять гидрофильное, принимающее клетки состояние на гидрофобное, высвобождающее клетки состояние в ответ на изменение температуры.

15. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, где термочувствительный полимер содержит поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm).

16. Макроноситель по п.15, где частицы субстрата содержат поликапролактон, и где поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm) соединяют с поликапролактоном через амидную связь.

17. Макроноситель по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащий биологические клетки, прикрепленные к термочувствительному полимеру.

18. Макроноситель по п.17, где биологические клетки выбраны из мезенхимальных стволовых клеток ("MSC"), дермальных фибробластов человека ("HDF"), эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и клеток нейробластомы Sy5y.

19. Система для выращивания биологических клеток, содержащая биореактор и макроноситель по любому из пп.1-18.

20. Способ выращивания биологических клеток, включающий:

a. приведение биологических клеток в контакт с макроносителем по любому из пп.1-17 в среде для культивирования клеток;

b. выращивание клеток на макроносителе посредством подвергания макроносителя воздействию температуры, при которой термочувствительный полимер представляет собой принимающую клетки поверхность; и

c. изменение температуры макроносителя для высвобождения любых выращенных клеток из макроносителя.

21. Способ по п.20, где биологические клетки приводят в контакт с макроносителем в биореакторе.

22. Способ по п.20 или 21, где макроноситель подвергают воздействию первой температуры 20-40°C для выращивания клеток, и где температуру макроносителя понижают ниже первой температуры для высвобождения выращенных клеток.