СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА Российский патент 2000 года по МПК A61F2/10 C12N5/00 

Настоящее изобретение относится к медицине, а более конкретно к хирургии, и может быть использовано для восстановления кожного покрова у пострадавших с обширными ожогами III-a и III-б степени и другими видами ран.

К настоящему времени разработаны различные способы восстановления кожного покрова у обожженных путем пересадки выращенных in vitro кератиноцитов. Общими для всех известных способов являются следующие этапы: выделение из кожи кератиноцитов, культивирование их и последующая трансплантация на рану пострадавшего. Для выращивания кератиноцитов необходимо использовать ростовую среду сложного состава, в которую добавляют, помимо сыворотки, ряд ростовых добавок (эпидермальный фактор роста, холерный токсин, экстракт гипофиза крупного рогатого скота и другие добавки). Эффективность культивирования кератиноцитов повышается в случае использования фидерного слоя фибробластов, кондиционирующих ростовую среду биологически активными соединениями (см. Терских В.В., Васильева А.В. - Эпидермальные кератиноциты человека и животных. - М.: Наука, 1995, с. 103).

Так, известен способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных, включающий получение кератиноцитов из биоптата кожи обожженного посредством обработки последней коллагеназой, культивирование клеток на подложке во флаконах с плоским дном. После достижения конфлюентности культуры клеток (примерно на 7-е сутки) осуществляют пересев клеток, для чего клеточный пласт обрабатывают смесью трипсина и этилендиаминтетрацетата (ЭДТА) и пересевают в новые флаконы в виде суспензии, и далее выращивают вторичную культуру кератиноцитов. На 14-е сутки, после достижения конфлюентности пассируемой культуры клеток ее подвергают воздействию раствора трипсина, что приводит к образованию суспензии из единичных клеток - кератиноцитов, которые собирают центрифугированием и затем ресуспендируют в стерильной пробирке в бессывороточной среде. Суспензию выдерживают в термостате при температуре 37,0^oC с содержанием в атмосфере 5% CO₂ в течение 20 минут. Затем суспензию клеток кератиноцитов наносят на раневую поверхность, сверху рану покрывают стерильным неадгезивным покрытием (см. Khalfan H., Aziz Hamza A., Saeed Tat al. - Novel method of skin substitution in plastic surgery. // Burns - 1989, v. 15, p. 335-337).

Недостатком известного способа восстановления кожного покрова являются: высокая сложность и трудоемкость технологии, сравнительно низкая эффективность и высокая стоимость лечения. В связи с тем, что выращивание кератиноцитов осуществляют в культуральных флаконах с плоским дном, площадь формирующегося клеточного пласта ограничена размерами используемой посуды и для увеличения количества клеток необходимо осуществлять их пересев, в результате клетки повреждаются, жизнеспособность их снижается. Процедура выращивания и подготовки клеточной культуры к пластике ран многоэтапна и сложна, требует использования специального оборудования, больших количеств дорогостоящих реактивов, сред, сывороток и посуды. Длительность процедур выделения и выращивания кератиноцитов (10-14 суток), сложность распределения взвеси кератиноцитов по поверхности раны также ограничивает область применения известного способа.

Известен способ восстановления кожного покрова, включающий выращивание в искусственных условиях многослойных пластов кератиноцитов на поверхности культурального флакона, при этом для клеточного пласта ростовую среду добавляют в фермент диплазу и пересадку клеточной культуры на раневую поверхность осуществляют на поверхности парафинизированной марли (см. Green H., Kehinde O. , Thomas J. - Growth of cultured human epidermal cells into multiple epitelia suitable for grafting. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1979. - Vol. 76. - P. 5665-5668).

Известному способу восстановления кожного покрова присущи серьезные недостатки. Он весьма сложен в осуществлении, так как состоит из большого числа этапов. На первом из них осуществляют подготовку фидерного слоя фибробластов линии 3Т3, выделяющих ряд биологически активных веществ в среду, с последующим их облучением радиацией или обработкой митомицином. Поверх слоя фибробластов засевают кератиноциты, которые периодически пересевают через каждые 5-7 дней. На каждом этапе выращивания возможно инфицирование клеточной культуры микроорганизмами. Известный способ отличает и его высокая стоимость, которая складывается из затрат на большое количество одноразовой культуральной посуды, изготавливаемой из специальных видов пластика, а также из стоимости сред, сыворотки, ростовых факторов, ферментов. Известный способ не позволяет быстро восстанавливать кожный покров на больших площадях, культивирование клеток обычно занимает 3-4 недели. Пласт, пригодный для трансплантации, должен содержать не менее 8-12 слоев клеток, необходимо добиваться "синхронизации" работы хирургов и биологов, т.е. к моменту пересадки должны быть подготовлены раны и клеточные пласты. Эффективность пересадки "недозрелых" и "переросших" пластов низкая. В случае недостаточной подготовки раны к пластике приживление вообще не наступает. Другим недостатком известного способа является то, что в процессе открепления пласта от поверхности культурального флакона, происходящего под действием фермента диспазы, происходит повреждение клеточных связей ("десмосом"), а также самих клеток, преимущественно базального слоя. Следует отметить также техническую сложность процедуры закрепления многослойного пласта клеток на поверхности парафинированной марли, при которой нередко происходит повреждение клеточного пласта, его разрыв и неполное снятие, что в конечном итоге также ведет к снижению эффективности трансплантации.

Известен способ постановления кожного покрова у тяжелообожженных, включающий выделение и культивирование кератиноцитов на коллагеновых микроносителях в течение 1-7 дней, после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами наносят на раневую поверхность (см. патент РФ N 2010028 по кл. C 12 N 5/00, опубликован 30.04.94 г.).

Известный способ позволяет повысить эффективность культивирования кератиноцитов, однако для его реализации специальное оборудование (роллерные и другие биотехнические системы) и определенные виды микроносителей типа "Цитолар" или "Цитопол". Кроме того, при трансплантации выращенных кератиноцитов трудно достичь равномерного распределения микроносителей с прикрепленными к их поверхности клетками по раневой поверхности.

Известен способ восстановления кожного покрова, включающий получение так называемого "дермального эквивалента", представляющего собой коллагеновый гель с включенными в его состав живыми фибробластами, на поверхности которого выращивают кератиноциты и затем такой "живой эквивалент кожи" пересаживают на раневую поверхность (см. Bell E., Sher S., Hull B. et al. - The reconstitution of living skin // J. Invest. Dermatol. - 1983. - Vol. 81, N 1. - supp. - P. 2 - 10).

Известный способ восстановления кожного покрова путем пересадки "живого эквивалента кожи" является наиболее сложным и многоэтапным, к тому же при получении "дермального эквивалента" в результате функционирования фибробластов его площадь значительно уменьшается (иногда в 5 раз), что не позволяет получать большие по площади клеточные трансплантаты. В результате известный способ имеет ограниченное применение.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому техническому решению является способ восстановления кожного покрова, принятый за прототип, включающий выделение кератиноцитов, селективное формирование межклеточного матрикса, а затем культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке в виде пластины толщиной 4-6 мм с размерами пор 10 - 30 мкм с последующей пересадкой находящейся на пористой пластине выросшей клеточной культуры кератиноцитов на раневую поверхность наложением пластины в положении клеток, обращенных в раневой поверхности (см. патент РФ N 2014359 по кл. C 12 N 5/00, опубликован 15.06.94 г.).

Известный способ-прототип позволяет стимулировать пролиферацию, миграцию и функционирование кератиноцитов, при этом пористая структура полимерной пластины позволяет включать и длительно удерживать в порах растворы разнообразных цитокинов.

Однако известному способу-прототипу присущи и серьезные недостатки. Известный способ-прототип являются сложным и многоэтапным, а следовательно, и длительным, так как предусматривает предварительное формирование на полимерной пластине биооактивной поверхности из межклеточного матрикса. В случае неплоской раневой поверхности невозможно обеспечить плотное прилегание к ней всей поверхности пластины со слоем кератиноцитов, в результате чего не обеспечивается равномерное распределение клеток по раневой поверхности. Из-за непрозрачности пористой полимерной пластины отсутствует возможность визуального контроля за состоянием раны. Все это снижает эффективность применения способа-прототипа.

Задачей заявляемого изобретения являлась разработка такого способа восстановления кожного покрова, который был бы более простым по выполнению, обеспечивал повышение эффективности лечения при одновременном снижении стоимости его осуществления, а также позволял осуществлять визуальный контроль за регенерацией кожного покрова на раневой поверхности.

Поставленная задача решается тем, что в способе восстановления кожного покрова, включающем выделение и культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке с последующей пересадкой их на раневую поверхность, кератиноциты культивируют на подложке из оптически прозрачного полимера со сквозными порами диаметром D, равным (0,01 - 3,0) мкм, и плотностью пор N, равной (10³-10⁹)1/см², до формирования монослоя кератиноцитов. Кератиноциты можно культивировать в присутствии фибробластов линии 3Т3, размещенных на противоположной стороне подложки. Подложка может быть выполнена из полиэтилентерефталата, полиимида, карбоксиметилцеллюлозы и других подобных по своим физико-механическим, а также биоафинным свойствам химически инертных полимерных материалов. Указанные выше подложки обеспечивают высокую степень адгезии клеток к их поверхности и способствуют их дальнейшей пролиферации. При этом подложка имеет одинаковый электростатический заряд обеих ее поверхностей. Размеры в количестве сквозных пор (диаметр D от 0,01 мкм до 3,0 мкм, плотность распределения пор N от 10³ 1/см² до 10⁹ 1/см²) делают возможным проникновение водорастворимых веществ через подложку, в то же время клетки через такие поры не проникают. Подложка может иметь толщину от 3 до 100 мкм. Подложка толщиной менее 3 мкм имеет недостаточную механическую прочность. Использовать подложку толщиной более 100 мкм нецелесообразно из-за недостаточной эластичности подложки. Разделение кератиноцитов и фибробластов полимерной пористой подложкой, через которую диффундируют продуцируемые фибробластами компоненты внеклеточного матрикса и цитокины, необходимые для стимуляции роста кератиноцитов, делают возможным не облучать фибробласты радиацией (сублетально) или не обрабатывать их митомицином.

Авторам из научно-технической, в том числе патентной литературы не известна совокупность признаков заявляемого технического решения, что, по мнению авторов, свидетельствует о соответствии заявляемого способа критерию "новизна".

Отличительные признаки заявляемого технического решения обеспечивают достижение нового технического результата - повышение эффективности способа восстановления кожного покрова и существенное снижение стоимости при одновременной возможности визуального контроля за регенерацией тканей, что соответствует критерию "изобретательский уровень".

Заявляемый способ восстановления кожного покрова осуществляют следующим образом.

На первом этапе отбирают и транспортируют кусочки кожи для последующего культивирования кератиноцитов. Аутологичные кератиноциты выделяют из кусочков интактной кожи. Аллогенные кератиноциты получают из кожи здоровых доноров (во время косметических операций) или плодов после осуществления по медицинским показаниям операции аборт. Культивирование клеток проводят только при условии отрицательных анализов на вирус СПИДа, герпеса, гепатита, реакции Вассермана и других трансмиссивных заболеваний. Кусочки кожи для выращивания клеток срезают в стерильных условиях различными способами (скальпелем, дерматомом, ножом Тирша или другим способом) под общей или местной анестезией. Жизнеспособность выделяемых из кусочков кожи кератиноцитов в определенной мере зависит от толщины срезаемых лоскутов кожи. Это связано с необходимостью проведения их ферментной обработки. При отборе кожных лоскутов для выращивания клеток кератиноцитов следует стремиться срезать кожные лоскуты толщиной не более 0,2-0,3 мм. Биоптаты кожи лучше всего отбирать в первые часы после травмы или непосредственно после выхода пострадавшего из состояния ожогового шока. После срезания кожные лоскуты помещают в ростовую среду (Игла, 199 или другую) и в охлажденном состоянии (при температуре не выше +4^oC) доставляют в лабораторию. На следующем этапе осуществляют выделение клеток по одному из известных вариантов для последующего их культивирования. Приведем один из известных вариантов выделения клеток. Кожу промывают в солевом растворе Хенкса, содержащем 200 U/мл гентамицина, разрезают на мелкие кусочки площадью 0,2-0,5 см². Кусочки кожи инкубируют в 0,5%-ном растворе диспазы (или смеси 0,5%-ного раствора диспазы с 0,2%-ным раствором коллагеназы), в сбалансированном солевом фосфатно-буферном растворе при температуре от 0^oC до +4^oC в течение 12-18 часов. Затем кусочки кожи переносят в фосфатный солевой буферный раствор Дульбекко и с помощью пинцета отделяют эпидермис от дермы. Эпидермис инкубируют в 0,125%-ном растворе трипсина в течение 10-15 минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин, после чего действие ферментов останавливают добавлением 5%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Полученную суспензию клеток фильтруют через нейлоновую марлю и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Затем полученную взвесь клеток высевают на чашки Петри, на дно которых помещают предварительно простерилизованные (обработкой в автоклаве, кипячением или другим известным способом) полимерные пористые подложки. Культивирование кератиноцитов проводят на полимерной пористой подложке толщиной от 3 до 100 мкм с диаметром пор D от 0,01 мкм до 3,0 мкм и плотностью распределения пор N от 10³ 1/см до 10⁹ 1/см, которую получают по известной технологии изготовления ядерных мембран - облучением пленки высокоэнергетичными тяжелыми ионами (азота, кислорода, неона, аргона, криптона, ксенона), последующим облучением ультрафиолетовым излучением и химическим травлением в водном растворе гидроокиси натрия. Так, при облучении полиэтилентерефталатной пленки толщиной 10 мкм ионами семизарядного аргона, ускоренными до энергий 43 МэВ, последующим облучением в течение 40 минут ультрафиолетовым излучением и химическим травлением в 3,5 N водном растворе NaOH при температуре 75^oC в течение 4 минут получают прозрачную подложку со сквозными цилиндрическими порами диаметром D=0,5 мкм и плотностью пор N = 107 1/см². Культивирование в зависимости от используемой ростовой среды и добавок можно проводить по ряду известных вариантов. Например, один из них осуществляют следующим образом. Для выращивания клеток используют ростовую среду FAD, состоящую из смеси сред DMEM и F12 в соотношении 3:1, с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 50 мкг/мл инсулина (Sigma), 0,4 - 0,5 мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), аденина - 1,8•10⁴М, трансферрина - 51 мкг/мл, лиотиронина - 2•10^-10 М, холерного токсина - 10^-10 М, эпидермального фактора роста (ЭФР) - 10 нг/мл. При этом культивирование кератиноцитов могут осуществлять как в присутствии фидерного слоя фибробластов 3Т3, так и без него. Чашки Петри размещают в термостате-инкубаторе при 37^oC в атмосфере углекислоты (до 5%). Смену среды производят через каждые 48 часов. Интенсивность пролиферации клеточной культуры контролируют с помощью инвертированного микроскопа. Выращивание кератиноцитов на подложке и подготовку раны к пластике осуществляют параллельно. Подготовку ран к пластике осуществляют разными способами:
- выполнением радикальных и послойных (тангенциальных) некрэктомий;
- посредством проведения местного консервативного лечения с использованием растворов антисептиков и многокомпонентных мазей на водорастворимой основе ("Левосин", "Левомеколь", "Диоксидиновая" мазь и другие).

Критериями готовности ран к пересадке является отсутствие экссудации, кровоточивости, гноя, наличие красных мелкозернистых грануляций, наличие краевой эпителизации.

Следует стремиться к тому, чтобы готовность раны к пластике и клеточной культуры к пересадке совпали во времени между собой.

Выращенный на подложке монослой кератиноцитов пересаживают на различные виды ран. Раневая поверхность должна быть хорошо васкуляризирована. Подложку поворачивают к раневой поверхности стороной, на которой находится монослой кератиноцитов, и накладывают на рану. Поверх пленки накладывают сухие марлевые повязки, которые меняют по мере необходимости. После заживления раны подложку удаляют.

Пример 1. Больная Ч., 1938 г.р., история болезни N 99827, поступила в ожоговый центр ГНИИ скорой помощи им. Ю.Ю. Джанелидзе 25.05.1998 г. Диагноз: химический ожог II-IIIа 8% нижних конечностей. Проводилось местное консервативное лечение, направленное на очищение ран от омертвевших тканей, снятие воспалительных явлений, профилактику развития инфекционных осложнений. 03.06.1998 г. на раны в области колен и голеней пересажено 320 см² аллогенных кератиноцитов, культивированных в виде монослоя на подложке из полиэтилентерефталата толщиной 10 мкм со сквозными порами диаметром D = 0,5 мкм и плотностью пор N = 10⁷ 1/см² Поверх подложки были наложены сухие марлевые повязки. 10.06.1998 г. подложку удалили. Приживление клеточной культуры составило 100%. На участках, где осуществляли пересадку, имелся восстановленный кожный покров.

На контрольных участках, где лечение проводилось с использованием мазей, заживление ран завершилось на 10-12 дней позднее.

Пример 2. Больной П. , 1974 г.р., история болезни N 30257, поступил в клинику термических поражений Военно-медицинской академии 23.03.1998 г. с диагнозом: ожог пламенем II-IIIб 8% (2%) спины и бедер. Проводилось местное консервативное лечение, антибактериальная терапия, физиотерапевтическое лечение. 10.04.1998 г. на раны площадью 320 см² в области ягодиц, имеющие "мозаичный характер" (чередование участков ожога III-а и III-б степени), трансплантировали культуру аллогенных кератиноцитов, выращенных на поверхности подложки из полиэтилентерефталата толщиной 50 мкм со сквозными порами диаметром D = 0,1 мкм и плотностью пор N = 10⁸ 1/см². Поверх подложки были наложены сухие марлевые повязки. 14.04.1998 г. осуществили смену марлевых повязок, небольшие участки пленки (S=25 см²), где скопился экссудат, были удалены. 18.04.1998 г. во время перевязки удалили подложку, под которой отмечено наличие тонкой пленки вновь образованного эпителия. Местами пересаженная клеточная культура не прижилась, вместе с тем в этих участках отмечено развитие процесса краевой эпителизации. Приживление клеточной культуры составило около 80% от пересаженной на поверхности подложки.

Способ может быть использован в медицине, а именно в хирургии, и может применяться для восстановления кожного покрова у пострадавших с обширными ожогами III-а и III-б степени и другими видами ран. Способ включает выделение и последующее культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке из оптического прозрачного полимера со сквозными порами диаметром D = 0,01-3,0 мкм и плотностью пор N = (10³-10⁹) 1/см² до формирования монослоя кератиноцитов. Кератиноциты могут культивироваться в присутствии фибробластов линии 3Т3 на противоположной стороне подложки. Подложка может быть выполнена из полиэтилентетрафталата, полиимида или карбоксиметилцеллюлозы. В качестве кератиноцитов могут культивироваться аллогенные кератиноциты. Способ повышает эффективность лечения и позволяет осуществить визуальный контроль за регенерацией кожного покрова на раневой поверхности. 5 з.п. ф-лы.

1. Способ восстановления кожного покрова, включающий выделение и последующее культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке с последующей пересадкой их на раневую поверхность, отличающийся тем, что кератиноциты культивируют на подложке из оптически прозрачного полимера со сквозными порами диаметром D = 0,01 - 3,0 мкм и плотностью пор N = (10³ - 10⁹) 1/см² до формирования монослоя кератиноцитов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кератиноциты культивируют в присутствии фибробластов линии 3Т3, размещенных на противоположной стороне подложки. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кератиноциты культивируют на подложке из полиэтилентерефталата. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кератиноциты культивируют на подложке из полиимида. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кератиноциты культивируют на подложке из карбаксиметилцеллюлозы. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют аллогенные кератиноциты.