СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/47 A61K47/20 A61P25/16 

Изобретение относится к медицине и заключается в способе использования гидроксипроизводного гидрохинолина для коррекции оксидативного статуса при экспериментальной болезни Паркинсона (БП).

БП оказывает значительное влияние на общество и является распространенным заболеванием: в 2016 году в мире насчитывалось около 6,1 миллиона человек с данной патологией. По причинам, которые еще не до конца понятны, распространенность этого заболевания быстро росла в последние два десятилетия [Bloem B.R., Okun M.S., Klein С.Parkinson's disease. Lancet. 2021; 397: 2284-303].

Известно, что у пациентов с БП наблюдается потеря нейронов в substantia nigra par compacta, locus ceruleus и других отделов головного мозга. Среди ключевых механизмов патогенеза БП в настоящее время выделяют агрегацию α-синуклеина, дисфункцию митохондрий, нарушение протеостаза, нейровоспаление и окислительный стресс [Jankovic J., Tan Е.К. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808].

Окислительный стресс является одним из основных факторов нейродегенерации при БП. В ходе патогенеза активные формы кислорода (АФК) образуются в результате работы электрон-транспортной цепи митохондрий, метаболизма дофамина и других окислительно-восстановительных реакций. Катаболизм дофамина обеспечивает моноаминоксидаза, которая в качестве побочного продукта образует Н₂О₂. Кроме того, окисление дофамина может происходить спонтанно в присутствии железа с образованием 6-гидроксидофамина, который впоследствии превращается в присутствии кислорода в реактивную электрофильную молекулу - р-хинон. Дофамин также может быть окислен до хинона дофамина, проявляющего токсическое действие посредством реакции с сульфгидрильными группами цистеина. Таким образом, в дофаминергических нейронах в результате ферментативного и неферментативного метаболизма дофамина АФК образуются в достаточно большом количестве. Следовательно, данные нейроны более чувствительны к различным стрессовым факторам по сравнению с нейронами других отделов мозга. В нормальных дофаминергических нейронах уровень АФК строго контролируется компонентами антиокислительной защиты. Однако, у пациентов с БП, как правило, наблюдается угнетение антиоксидантной системы. В условиях повышенного содержания АФК значительно ухудшается функционирование протеасом, что способствует агрегации окисленных или иным образом поврежденных белков в клетке и прогрессированию БП [Dorszewska J., Kowalska М., Prendecki М., Piekut Т., Kozlowska J., Kozubski W. Oxidative stress factors in Parkinson's disease. Neural Regen Res. 2021; 16(7): 1383-1391].

Известно, что терапия БП включает фармакологические (с применением препаратов леводопы, назначаемых сочетанно с другими лекарствами или отдельно) и нефармакологические подходы (физические упражнения и физическая, трудовая и речевая терапия) [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Фармакологическое лечение двигательных симптомов БП в основном направлено на коррекцию действия дофамина. При этом, более 40% лиц, получающих пероральные агонисты дофамина, испытывают расстройства контроля социального поведения. Лица, прекращающие прием агонистов дофамина, испытывают симптомы отмены в 15-20% случаев [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Симптоматическое лечение немоторных симптомов БП аналогично лечению этих симптомов в общей популяции. Прием антихолинергических препаратов, таких как тригексифенидил и бензтропин, может быть связан с различными побочными эффектами, включая когнитивные нарушения, спутанность сознания, галлюцинации, нечеткость зрения, сухость во рту, запор и задержка мочи [Jankovic J., Tan Е.К. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. Бензодиазепины способствуют улучшению сна или снижению тревоги, но могут ухудшить когнитивные функции [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560].

Несмотря на то, что в настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании этиопатогенеза БП и его симптоматическом лечении, до сих пор не существует эффективных нейропротективных или модифицирующих болезнь методов терапии, которые могли бы замедлить прогрессирование заболевания [Armstrong M.J., Okun M.S. Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review. JAMA. 2020; 323(6): 548-560; Jankovic J., Tan E.K. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020; 91(8): 795-808]. В связи с этим, активно проводятся исследования потенциальных протекторов, способных замедлить развитие БП, в том числе посредством торможения окислительного стресса [Chang К-Н., Chen С-М. The Role of Oxidative Stress in Parkinson's Disease. Antioxidants. 2020; 9(7):597].

Задача, на решение которой направлено данное изобретение, заключается в снижении в тканях головного мозга интенсивности свободнорадикального окисления, которое является ключевым фактором прогрессирования БП. В данном приложении хинолин и его производные привлекают внимание благодаря своим разнообразным химическим и фармакологическим свойствам. Хинолиновая группировка встречается в различных природных соединениях, особенно в алкалоидах, и часто используется для дизайна многих синтетических соединений с разнообразными фармакологическими свойствами. Для синтезированных хинолиновых производных были показаны противораковая, антимикозная, антимикробная, противосудорожная, противовоспалительная и кардиопротекторная активность [Kumar S., Bawa S., Gupta H. Biological activities of quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2009; 9(14): 1648-1654].

Многие из новых синтезированных хинолиновых соединений представляют интерес в связи с наличием антиоксидантных свойств. Исследования показывают, что наличие таких заместителей, как CF3, ОСН3, СН3 и галогенов на хинолиновом кольце играет важную роль в проявлении антиоксидантной активности [Orhan Piiskullii М., Tekiner В., Suzen S. Recent studies of antioxidant quinoline derivatives. Mini Rev Med Chem. 2013; 13(3): 365-372].

Одним из производных хинолина является 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (гидрокси-ТГХ) - структурный аналог 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,-дигидрохинолина, для которого ранее была показана антиоксидантная и нейропротекторная активность при ишемии/реперфузии головного мозга [Kryl'skii E.D., Chupandina Е.Е., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-1,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Biochimie. 2021; 186: 130-146]. Авторами данной работы раскрывается способ снижения параметров интенсивности свободнорадикального окисления в мозге и сыворотке крови животных путем введения 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидрохинолина в физиологическом растворе в дозе 50 мг/кг массы тела в течение трех дней. Однако протекторные свойства соединения были продемонстрированы на модели ишемии/реперфузии головного мозга, а подтверждения о положительном влиянии данного вещества на моторно-координационные показатели не приводится. Кроме того, гидрокси-ТГХ по сравнению с 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,-дигидрохинолином имеет более гидрированное гетероциклическое кольцо, что увеличило число вариантов конформации молекулы и способствовало лучшему ее проникновению через биологические барьеры.

Известен способ снижения степени развития окислительного стресса при БП, заключающийся в пероральном приеме пациентами N-ацетилцистеина в дозе 6000 мг в день, на протяжении 4 недель. Прием данного соединения способствовал улучшению активности каталазы, однако содержание продуктов пероксидного окисления липидов и уровень восстановленного глутатиона не изменялись [Coles, L.D., Tuite, P.J., Oz, G., Mishra, U.R., Kartha, R.V., Sullivan, K.M., Cloyd, J.C. and Terpstra, M. (2018), Repeated-Dose Oral N-Acetylcysteine in Parkinson's Disease: Pharmacokinetics and Effect on Brain Glutathione and Oxidative Stress. The Journal of Clinical Pharmacology, 58: 158-167]. Внутрибрюшинное введение эллаговой кислоты в дозе 10 мг/кг, один раз в день, на протяжении 1 недели мышам с экспериментальной БП приводило к снижению концентрации продуктов пероксидного окисления липидов и нормализации активности ряда антиоксидантных ферментов. В то же время, полученные результаты не были подтверждены поведенческо-координационными тестами [Ardah МТ, Bharathan G, Kitada Т, Haque ME. Ellagic Acid Prevents Dopamine Neuron Degeneration from Oxidative Stress and Neuroinflammation in MPTP Model of Parkinson's Disease. Biomolecules. 2020; 10(11):1519].

Наиболее близким по совокупности признаков к заявленному изобретению является способ, заключающийся в пероральном приеме 1 мг разагилина на вес тела человека в сутки. Разагилин представляет из себя селективный ингибитор моноаминоксидазы В, благодаря чему способствует повышению уровня дофамина и снижению интенсивности образования свободных радикалов в ходе его метаболизма. Вместе с тем, данный препарат обладает обширным спектром побочных действий и может вызывать серотониновый синдром при взаимодействии с рядом лекарственных средств [Hayes М.Т. Parkinson's Disease and Parkinsonism. Am J Med. 2019;1 32(7): 802-807].

Технический результат заключается в снижении показателей свободнорадикального окисления у крыс с экспериментальной болезнью Паркинсона под действием 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина, выражающееся в уменьшении концентрации диеновых конъюгатов в сыворотке крови и мозге в 1,7 и 1,6 раза по сравнению с группой животных, которым моделировали болезнь Паркинсона, соответственно, в восстановлении активности аконитатгидратазы до значений контрольной группы и изменении содержания лимонной кислоты в направлении значений контрольной группы; технический результат также заключается в улучшении моторно-координационных показателей, состоящем в возрастании силы хвата на 64% и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине, в 7,3 раза, сокращении времени отклеивания бирки в 2,1 раза по сравнению с группой животных, которым моделировали болезнь Паркинсона.

Технический результат достигается тем, что в способе коррекции оксидативного статуса при болезни Паркинсона в эксперименте, включающем введение вещества, обладающего нейропротекторной активностью, однократно в сутки, согласно изобретению, используют внутрибрюшинное введение на протяжении 10 дней 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина в дозе 50 мг/кг массы тела крыс в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 кг массы тела животного.

Пример

Гидрокси-ТГХ синтезировали дезалкилированием 6-этокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина при действии бромоводородной кислоты по известной методике [Иванов Ю.А., Зайченко Н.Л., Рыков С.В., Гринберг О.Я., Дубинский А.А., Пирожков С.Д., Розанцев Е.Г., Покровская И.Е., Шапиро А.Б. // Синтез окси-, ацилокси, оксо-, N-окисей оксо- и морфолиллоксопроизводныхгидрированных хинолинов и изучение их радикальных аналогов методом ЭПР / Изв. АН СССР, Сер. хим. - 1979. - Т. 8 - С. 1800-1807] (выход 76%, Т_пл=186-187°С; лит. выход 55%, Т_пл=184-186°С).

Для получения технического результата использовали крыс-самцов возрастом 4-6 месяцев и массой 200-250 г, содержащиеся при 12-часовом световом дне и доступе к еде и пище ad libitum. Работа выполнялась с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Моделирование БП осуществляли путем подкожного введения крысам ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы однократно в сутки в виде раствора, из расчета 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, на протяжении 10 дней. Ротенон растворяли в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида [Ablat N., Lv D., Ren R., Xiaokaiti Y., Ma X., Zhao X., Sun Y., Lei H., Xu J., Ma Y., Qi X., Ye M., Xu F., Han H., Pu X. Neuroprotective Effects of a Standardized Flavonoid Extract from Safflower against a Rotenone-Induced Rat Model of Parkinson's Disease. Molecules. 2016; 21 (9): 1107]. Животные были случайным образом разделены на 4 экспериментальные группы численностью в 12 особей. 1-ю (контрольную) группу составляли животные, которые получали 1 раз в сутки на протяжении 10 дней инъекции носителя, содержащего 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, подкожно; во 2-ю группу входили крысы, которым моделировали БП; 3-ю группу составляли крысы, которые параллельно с подкожным введением однократно в сутки, на протяжении 10 дней ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы, растворенного в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, получали однократно в сутки на протяжении 10 дней внутрибрюшинные инъекции, из расчета 0,5 мл на 0,2 кг массы тела животного, в виде водного раствора, содержащего гидрокси-ТГХ в дозе 50 мг/кг массы тела животного, 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, за один час до введения ротенона; крысам 4-й группы вместе с подкожным введением однократно в сутки, на протяжении 10 дней ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы тела крысы, растворенного в смеси, содержащей 98 об. % очищенного оливкового масла и 2 об. % диметилсульфоксида, в объеме 100 мкл инъекции на 0,1 кг массы тела животного, в течение 10 дней за один час до администрации ротенона вводили внутрибрюшинно разагилин. Препарат разагилин вводился однократно в сутки из расчета 0,5 мл на 0,2 кг массы тела животного, в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, в дозировке, указанной в инструкции к применению [https://www.vidal.ru/drugs/rasagiline-medisorb. Дата обращения: 10.03.2023], скорректированной на вес тела животных с учетом коэффициента пересчета - 0,09 мг/кг [Доклиническое изучение лекарственных средств (промышленная фармация): [учебник для студентов высших учебных заведений] / Ж. И. Аладышева, В. В. Береговых, Н. Н. Вольхин [и др.]; редакторы: А. Л. Хохлов, Н. В. Пятигорская; Российская академия наук. - Москва: Группа Ремедиум, 2021. - 395 с.: цв. ил., табл.; 25 см.; ISBN 978-5-906499-72-1].

Дозировка гидрокси-ТГХ была взята на основе предыдущих исследований, продемонстрировавших нейропротекторную эффективность структурных аналогов данного соединения [Kryl'skii E.D., Chupandina Е.Е., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Mittova V.O., Popov S.S., Verevkin A.N., Filin A.A. Neuroprotective effect of 6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline mediated via regulation of antioxidant system and inhibition of inflammation and apoptosis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Biochimie. 2021; 186: 130-146; Kryl'skii E.D., Chupandina E.E., Popova T.N., Shikhaliev K.S., Medvedeva S.M., Verevkin A.N., Popov S.S.,Mittova V.O. l-benzoyl-6-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l,2-dihydroquinoline exerts a neuroprotective effect and normalises redox homeostasis in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion. Metab Brain Dis. 2022; 37(4): 1271-1282]. Через 24 часа после последней инъекции у крыс анализировали моторные показатели, после чего умерщвляли и забирали исследуемый материал.

Для оценки моторики и координации животных применялись следующие тесты: 1) удерживая крысу, ей давали зацепиться передними лапками за скобу электронных весов. Весы оттягивали и регистрировали максимальную величину показателя [Sharma S., Kumar P., Deshmukh R. Neuroprotective potential of spermidine against rotenone induced Parkinson's disease in rats. Neurochemistry International. 2018; 116: 104-111]. 2) животное помещали в прозрачную клетку и наклеивали на голову кусочек липкой бумаги. Регистрировали время, за которое крыса воспримет раздражитель и снимет бумагу с головы [Park H.J., Lee Р.Н., Bang O.Y., Lee G., Ann Y.H. Mesenchymal stem cells therapy exerts neuroprotection in a progressive animal model of Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 2008; 107(1): 141-151]. 3) Крысы ходили по деревянной балке, подвешенной между стартовой платформой и домашней клеткой на высоте 50 см. Соскальзывание лапок оценивалось по 6-бальной системе следующим образом: 0 - крыса не смогла удержаться на перекладине; 1 - крыса не двигалась, но смогла удержаться на перекладине; 2 - крыса пыталась преодолеть перекладину, но упала; 3 - крыса преодолела перекладину, но задние конечности волочились; 4 - крыса преодолела перекладину с несколькими соскальзываниями лап (более 3); 5 -крыса преодолела перекладину с 1-3 соскальзыванием задней конечности; 6 -крыса преодолела перекладину без соскальзываний конечности [Miyanishi К., Choudhury М.Е., Watanabe М., Kubo М., Nomoto М., Yano Н., Tanaka J. Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model. Neurochem Int. 2019; 122: 38-46]. Все тесты проводили в трехкратной повторности, брали среднее значение показателей.

Для анализа концентрации диеновых конъюгатов (ДК) к исследуемому образцу добавляли гептан и изопропанол, перемешивали и осаждали центрифугированием при 3000g. Гептановую фазу супернатанта разбавляли этанолом и анализировали спектрофотометрически при 233 нм [Recknagel R.O., Ghoshal А.К. Lipoperoxidation of rat liver microsomal lipids induced by carbon tetrachloride. Nature. 1966; 210: 1162-1163]. Активность аконитатгидратазы (АГ) оценивали в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,8), содержащем 4 мМ цитрата натрия ("PanReac", Spain). Концентрацию лимонной кислоты оценивали по методу Нательсона [Афанасьев В.Г., Зайцев B.C., Вольфсон Т.И. // Лаб. дело. 1973; 4: 115-116]. Содержание белка анализировали биуретовым методом.

Результаты исследований обрабатывали с применением дисперсионного анализа ANOVA. Различия считали достоверными при р<0,05. Все количественные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

На фиг.1 приведена таблица, показывающая воздействие 6-гидроксй-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина на координационные показатели и параметры оксидативного статуса у крыс с экспериментальной болезнью Паркинсона, где * - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05 по сравнению с БП; ^∧ - р<0,05 по сравнению с БП+разагилин

Результаты работы показали, что у крыс с экспериментальной БП наблюдалось развитие моторно-координационных нарушений, о чем свидетельствовало увеличение времени, затрачиваемого на отклеивание бирки с головы, а также снижение силы хвата и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине (фиг.1). Кроме этого, в сыворотке крови и мозге крыс с БП наблюдалось возрастание концентрации ДК - первичных продуктов пероксидного окисления липидов, и снижение активности АГ, являющейся чувствительной мишенью для действия АФК [Матасова Л.В., Попова Т.Н. Аконитаза млекопитающих при окислительном стрессе. Биохимия. 2008; 73(9): 1189-1198]. Угнетение активности АГ сопровождалось накоплением субстрата данного фермента - лимонной кислоты, способной снижать интенсивность образования АФК путем хелатирования ионов металлов переменной валентности [Бражникова Д. А., Попова Т. Н., Крыльский Е. Д., Шульгин К. К., Матасова Л. В., Шихалиев X. С, Попов С.С. Воздействие 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидро-хинолина на интенсивность свободнорадикальных процессов и активность ферментов окислительного метаболизма при токсическом поражении печени у крыс.Биомедицинская химия. 2019; 65(4): 331-338]. Введение гидрокси-ТГХ крысам с БП приводило к возрастанию силы хвата на 64% и баллов, набранных в тесте прохода по перекладине, в 7,3 раза, по сравнению с группой животных с патологией. Время отклеивания бирки при этом сократилось в 2,1 раза. На моторно-координационные показатели гидрокси-ТГХ оказывал достоверно более существенное воздействие, чем разагилин.

Введение гидрокси-ТГХ крысам с БП приводило к уменьшению концентрации ДК в сыворотке крови и мозге в 1,7 и 1,6 раза, в то время как использование разагилина способствовало снижению данного показателя на 17 и 10% относительно животных с патологией. Наряду с этим, под действием гидрокси-ТГХ у крыс с БП наблюдалось восстановление активности АГ и изменение содержания лимонной кислоты в направлении контрольных значений. Введение разагилина приводило к увеличению активности АГ выше контрольных значений, а также снижению концентрации лимонной кислоты ниже контроля. По-видимому, наблюдаемые изменения были связаны со специфическим активирующим действием препарата на фермент.Известно, что разагилин способен влиять на экспрессию широкого ряда генов. Так, было показано, что инкубация клеток нейробластомы SH-SY5Y с разагилином приводила, помимо прочего, к увеличению мРНК генов, вовлеченных в синтез АТФ - цитохром с оксидазы, NADH-оксидоредуктазы, АТФ синтазы и АГ [Naoi М., Maruyama W., Yi Н., Akao Y., Yamaoka Y., Shamoto-Nagai M. Neuroprotection by propargylamines in Parkinson's disease: intracellular mechanism underlying the anti-apoptotic function and search for clinical markers. J Neural Transm. 2007; Suppl 72: 121-131].

Получаемый при осуществлении изобретения результат заключался в снижении показателей свободнорадикального окисления под действием гидрокси-ТГХ, что сопровождалось улучшением моторно-координационных показателей у крыс с экспериментальной БП. По отношению к тестируемым параметрам гидрокси-ТГХ оказался более эффективным, чем разагилин. Полученные данные представляют интерес для разработки новых способов коррекции нарушений обмена веществ при БП.

Изобретение относится к медицине и заключается в применении 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (гидрокси-ТГХ) для коррекции оксидативного статуса при моделировании болезни Паркинсона. Способ включает внутрибрюшинное введение гидрокси-ТГХ на протяжении 10 дней в дозе 50 мг/кг массы тела крысы в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорила натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 кг массы тела животного. Изобретение обеспечивает улучшение моторно-координационных показателей и снижение параметров интенсивности свободнорадикального окисления в мозге и сыворотке крови животных. 1 ил., 1 пр.

Способ коррекции оксидативного статуса при болезни Паркинсона в эксперименте, включающий введение вещества, обладающего нейропротекторной активностью, однократно в сутки, отличающийся тем, что используют внутрибрюшинное введение на протяжении 10 дней 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2,3,4-тетрагидрохинолина в дозе 50 мг/кг массы тела крыс в виде водного раствора, содержащего 0,9 масс. % хлорида натрия и 5 об. % диметилсульфоксида, из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 кг массы тела животного.