СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА Российский патент 2025 года по МПК A61K31/122 A61K9/08 A61P25/16 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лекарственному средству для лечения болезни Паркинсона на основе О-гликозидного производного 1,4-нафтохинона - 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона.

Болезнь Паркинсона является широко распространенным социально-значимым возрастным и медленно прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием и характеризуется прогрессирующей гибелью дофаминергических нейронов в нигростриарной системе головного мозга, что приводит к нарушениям в первую очередь двигательных функций, а также к когнитивным нарушениям и вегетативной дисфункции.

Этиологию болезни Паркинсона связывают с геномными, эпигенетическими и средовыми факторами, которые приводят к конформационным изменениям белков и отложению в цитоплазме нейронов белковых агрегатов (тельца Леви), нарушению дифференцировки дофаминэргических нейронов и регуляции их функции, а также к окислительному стрессу, что в конечном итоге вызывает гибель нейронов. В механизмах нейродегерации дофаминэргических нейронов черной субстанции, протекающей посредством высвобождения провоспалительных агентов, выявлено прямое участие активированной микроглии. В свою очередь воспаление микроглии, индуцированное действием бактериального липополисахарида (ЛПС), приводит к гиперпродукции интерлейкинов IL-1β, IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли TNF-α; активации индуцибельной синтазы оксида азота (iNOs); повышению уровня активных форм кислорода (ROS) и оксида азота (NO), которые нарушают нормальное функционирование и жизнедеятельность нейронов [Ho M.S. et al. Neuroglia in neurodegenerative diseases // Springer: Singapore, 2019, 1175, pp. 335-353; Badanjak K. et al. The Contribution of Microglia to Neuroinflammation in Parkinson’s Disease // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, (9), рр. 4676].

На сегодняшний день для лечения болезни Паркинсона активно применяются средства, в состав которых входит предшественник дофамина L-ДОФА (леводопа, карбидопа, наком). Эти средства используются как заместительная терапия, поскольку данное заболевание связано с уменьшением уровня дофамина в головном мозге. Применяются также средства, снижающие стимулирующее действие кортикальных глутаматных рецепторов (мидантан), либо агонисты дофаминовых (периферических) рецепторов (ропинирол), ингибиторы МАО-В (селегин) и центральные холиноблокирующие средства.

Основным средством для лечения болезни Паркинсона, эффективно снимающим симптомы болезни, является леводопа. Противопаркинсоническое действие леводопы обусловлено ее превращением в дофамин непосредственно в ЦНС, что приводит к восполнению дефицита дофамина в ЦНС. Препараты содержащие леводопу, хотя и являются на сегодня наиболее эффективными средствами лечения болезни Паркинсона, обладают определёнными недостатками, такими как избирательная эффективность. Так при первичном назначении препараты леводопы эффективно помогают 1/3 пациентов, менее эффективно помогают другой трети больных, а для остальных пациентов препарат неэффективен. Приём препаратов леводопы сопровождается многочисленными побочными эффектами: анорексия, рвота, тахикардия, дискинезия, психические нарушения, помимо этого, при длительном применении препарата эффективность леводопы может снижаться, вплоть до полной потери активности.

Перспективным классом низкомолекулярных химических соединений для поиска средств лечения болезни Паркинсона представляются 1,4-нафтохиноны, являющиеся важными метаболитами растений и животных. Так, предложены для лечения болезни Паркинсона природный 2,3,6-триметил-1,4-нафтохинон и синтетический 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон, которые эффективно ингибируют фермент моноаминоксидазу, ответственную за развитее болезни Паркинсона [Mostert S. et al. Evaluation of Natural and Synthetic 1,4-naphthoquinones as Inhibitors of Monoamine Oxidase // Chem. Biol. Drug. Des. 2016, 87, рр. 737-746].

В работе [Lee S.R. et al. Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Pigment Echinochrome A from Sea Urchin Scaphechinus mirabilis // Mar. Drugs. 2014, 12, рр. 3560-3573] предположено, что 6-этил-2,3,5,7,8-пентагидрокси-1,4-нафтохинон (эхинохром А) может быть использован в лечении болезни Паркинсона за счёт способности ингибировать фермент ацетихолинестеразу, участвующий в развитии нейродегенеравных процессов.

Известна композиция, содержащая нафтохиноновые соединения для предотвращения когнитивной дисфункции, в том числе при заболеваниях Паркинсона [пат. KR №100699945, опубл. 26.03.2007]. Она содержит 5,8-гидрокси-1,4-нафтохинон и 1,2-нафтохинон, которые воздействуют на причину болезни путём ингибирования цитотоксичности бета-амилоида за счёт снижения агрегации молекул последнего.

Схожим образом действуют 1,4-нафтохиноны, замещённые аминокислотным остатком, выбранным из гетероциклической или ароматической аминокислоты, известные из патента [пат. US №8697680, опубл. 15.04.2014]. Указанные соединения были использованы в фармацевтических композициях, эффективных в предотвращении олигомеризации амилоидных белков, включая бета-амилоид, для лечения заболеваний, связанных с амилоидогенезом, в том числе нейродегенеративных заболеваний.

Показано, что О-гликозидные производные нафтохинонов способны не только останавливать, но и обращать развитие нейродегенеративных изменений в болезни Паркинсона. Так, в исследовании [Paul A. et al. Novel Mannitol-Based Small Molecules for Inhibiting Aggregation of α-Synuclein Amyloids in Parkinson's Disease // Front. Mol. Biosci. 2019, 6] установлена роль конъюгата маннита и нафтохинон-триптофана (NQTrp) в защите от нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Агрегация амилоидогенного белка α-синуклеина (α-Syn) в токсичные олигомеры и зрелые фибриллы является основным патологическим признаком болезни Паркинсона, поэтому небольшие молекулы, ингибирующие агрегацию α-Syn, могут быть полезными терапевтическими средствами. Молекулы конъюгата in vitro ослабляли разрушающее действие α-Syn на искусственную мембрану больших однослойных везикул, что контролировали с помощью анализа утечки красителя.

В источнике информации [пат. CN №110025624, опубл. 02.04.2021] описано применение соединений нафтохинонгликозидов при приготовлении лекарственных средств для лечения старческого слабоумия, где соединением нафтохинонгликозида является 3-(3-метилбутен-3-ил)-6,7-диметокси-нафтохинон-2-O-β-D-глюкозид.

Сочетание локализации молекулярной мишени и способности стимулировать высвобождение медиаторов предполагает потенциальную роль блокаторов рецепторов в лечении патологических состояний, включая нейродегенеративные расстройства. Рецептор P2X7 представляет собой АТФ-управляемый ионный канал, экспрессирующийся в клетках, происходящих из гемопоэтической линии. Во время активации P2X7 происходит большое количество реакций, включая поток неспецифических катионов и крупных молекул через открытую пору рецептора. Помимо этого, активированный P2X7 участвует в формировании воспаления, а также процессинге и высвобождении интерлейкина-1β. Известно, что гиперактивация P2X7 в микроглии и нейронах приводит к возникновению болезни Паркинсона. В связи с этим на человеческих и мышиных рецепторах P2X7 была протестирована серия 3-галогено и 3-арил-2-гидрокси-1,4-нафтохинонов, и отобраны перспективные соединения, в разной степени участвующие в ингибировании рецепторов P2X7 [Faria R.X. et al. 1,4-Naphthoquinones potently inhibiting P2X7 receptor activity // European Journal of Medicinal Chemistry. 2018, 143, рр. 1361-1372].

Задачей настоящего изобретения стало выявление соединений для профилактики и лечения нейродегенеративных расстройств.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента средств лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности использование в качестве основы фармацевтических композиций ацетилированного O-глюкозида 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона.

Технический результат достигают применением 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона для лечения болезни Паркинсона.

Сущность заявляемого изобретения заключается в использовании производного 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона с глюкозидным остатком, которое приводит к выраженной защите нейрональных и макрофагальных клеток от токсического воздействия АТФ. Более того, его использование может способствовать уменьшению образования активных форм кислорода и ослаблению нейровоспаления в тканях головного мозга мышей, которые обычно наблюдаются при инициировании и развитии болезни Паркинсона.

2-(Тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон - ацетилированный O-глюкозид 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона (лабораторный код U-443) синтезировали автокаталитической конденсацией 2,5,8-тригидрокси-3-этил-1,4-нафтохинона с 1,2-трет-бутокси ортоацетатом 3,4,6-три-О-ацетил-α-D-глюкопиранозы в соответствии с [Polonik S. et al. Synthesis, cytotoxic activity evaluation and Quantitative Structure-Activity Analysis of substituted 5,8-dihydroxy-1,4- naphthoquinones and their O- and S-glycoside derivatives tested against Neuro-2a cancer cells // Mar. Drugs. 2020, 18, 1-29]. Исходный 2,5,8-тригидрокси-3-этил-1,4-нафтохинон получали дехлорированием доступного дихлоронафтохинона обработкой железом в уксусной кислоте (Fe/AcOH) и окислением реакционной смеси воздухом в одном реакторе [Anufriev V.P. et al. The reductive dehalogenation of halo-substituted naphthazarins and quinizarins as a simple route to parent compounds // Synth. Commun. 1998, 28, рр.2149-2157]. Синтезированный нафтохинон имеет следующее строение:

Для подтверждения эффекта заявляемого средства для лечения болезни Паркинсона были использованы две клеточные культуры: клетки нейробластомы мыши Neuro-2a и клетки макрофагов мыши RAW 264.7, имитирующие нейроны головного мозга и микроглию соответственно. В качестве индуктора болезни Паркинсона использовали природный изофлаваноид ротенон, обладающий свойствами нейротоксина. Была оценена способность нафтохинона U-443 защищать нейрональные клетки и макрофаги от цитотоксического действия ротенона и ингибировать образование активных форм кислорода (АФК) в клетках при обработке нейротоксином, изучено влияние на митохондриальный мембранный потенциал (ММП) in vitro. Кроме того, было исследовано влияние 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона на спонтанную локомоцию в мышиной модели болезни Паркинсона, индуцированной ротеноном in vivo.

Ротенон стандартно применяют в качестве индуктора нейродегенеративных изменений в модели болезни Парксинсона in vitro и in vivo. Ротенон подавляет работу митохондриальной цепи переноса электронов, блокируя перенос электрона от железосерного кластера I к убихинону. В результате происходит восстановление кислорода и образование кислородсодержащих радикалов - активных форм кислорода, которые повреждают ДНК и компоненты митохондрий. Помимо действия на митохондриальное дыхание, ротенон также ингибирует сборку микротрубочек тубулина. В конечном итоге действие ротенона приводит к дисфункции и гибели нейронов, в том числе и дофаминэргических.

Заявляемое изобретение подтверждено следующими рисунками:

Фиг. 1. Определение цитопротекторного эффекта 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона (U-443) in vitro на клетках нейробластомы Neuro-2a (А) и клетках макрофагов RAW 264.7 (Б) в модели болезни Паркинсона, индуцированной действием ротенона. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). *p<0,05 по сравнению с контрольными клетками; #p<0,05 по сравнению с клетками, подвергшимися воздействию только ротенона; §p<0,05 означает статистически значимые различия между клетками, инкубированных в присутствии разных концентраций соединения U-443.

Фиг. 2. Способность нафтохинона U-443 in vitro подавлять продукцию активных форм кислорода (А) и защищать митохондреальный мембранный потенциал (ΔΨm) (Б) в клетках нейробластомы Neuro-2a в модели болезни Паркинсона, индуцированной действием ротенона in vitro. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). *p<0,05 по сравнению с контрольными клетками; #p<0,05 по сравнению с клетками, подвергшимися воздействию только ротенона; §p<0,05 означает статистически значимые различия между клетками, инкубированных в присутствии разных концентраций соединения U-443.

Фиг. 3. Влияние леводопы (L-ДОФА) на спонтанную локомоцию у мышей с ротенон-индуцированной болезнью Паркинсона. Влияние ротенона на поведение мышей в тесте «Цилиндр» в течение 19 дней (А). Влияние L-ДОФА на количество подъемов после введения ротенона в тесте «Цилиндр» (Б), среднюю скорость движения (В), пройденное расстояние (Г), общее время, проведенное в неподвижном состоянии (Д) и количество замираний (Ж) у мышей в тесте «Открытое поле». Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=6), *p< 0,05 по сравнению с контрольной группой мышей, **p<0,05 по сравнению с группой мышей, получавших ротенон.

Фиг. 4. Антипаркинсоническая активность U-443 в экспериментальной модели болезни Паркинсона in vivo у мышей, индуцированной ротеноном. Влияние U-443 на количество подъемов мышей после введения ротенона в тесте «Цилиндр» (А), среднюю скорость движения (Б), пройденное расстояние (В), общее время, проведенное в неподвижном состоянии (Г) и количество замираний (Д) в тесте «Открытое поле». Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=6), *p<0,05 по сравнению с контрольной группой мышей; #p<0,05 по сравнению с группой мышей, получавших только ротенон; §p<0,05 по сравнению между группами мышей, получавшими разные дозы соединения U-443.

Эффективность действия 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона для лечения болезни Паркинсона подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение методом MTS защитного эффекта нафтохинона U-443 in vitro на клетках нейробластомы Neuro-2a и макрофагах RAW 264.7 в модели болезни Паркинсона, индуцированной действием ротенона

Метод основан на превращении субстрата MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) жизнеспособными клетками в окрашенный продукт формазан, поглощение которого можно определить с помощью спектрофотометра. Результат измерения прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток, поскольку погибшие клетки не способны преобразовывать субстрат.

Предварительно методом MTS определяли цитотоксическую активность ротенона и подобрали действующую концентрацию нейротоксина, которая составила 10 мкМ и вызывала 40-50% гибель клеток Neuro-2a и RAW 264.7. Защитный антипаркинсонический эффект нафтохинона U-443 от действия ротенона определяли в режиме предварительной обработки клеток U-443. К клеточной суспензии за 1 час до применения ротенона добавляли нафтохинон в диапазоне концентраций 0,01-1,0 мкМ. Через 1 час клетки обрабатывали ротеноном в концентрации 10 мкМ, выдерживали в течение суток и определяли жизнеспособность клеток методом MTS.

Ротенон в концентрации 10 мкМ значительно снижал жизнеспособность клеток примерно на 40%, в то время как U-443 в концентрации 0,1 мкМ достоверно повышал жизнеспособность клеток Neuro-2a при действии нейротоксина примерно на 43,0% по сравнению с клетками обработанными ротеноном. Аналогичные результаты были получены при изучении влияния ротенона на жизнеспособность клеток RAW 264.7. В концентрации 0,1 мкМ 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон защищал макрофаги от повреждающего действия ротенона на 57,9% по сравнению с контрольными клетками. Результаты представлены на Фиг. 1А и 1Б.

Пример 2. Способность нафтохинона U-443 in vitro подавлять продукцию активных форм кислорода (АФК) и защищать митохондреальный мембранный потенциал (ММП) в клетках нейробластомы Neuro-2a в модели болезни Паркинсона, индуцированной действием ротенона

Для выявления защитного эффекта U-443 оценивали способность подавлять окислительный взрыв в нейрональных клетках, вызванный ротеноном. Для этого 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон в нецитотоксическом диапазоне концентраций 0,01-1,0 мкМ инкубировали с клетками в течение 1 ч до внесения в культуру ротенона. Затем клетки инкубировали в течение 1 часа с ротеноном в концентрации 10 мкМ. После этого спектрофлуориметрически определяли уровни АФК и ММП в клетках, используя молекулярные флуоресцентные зонды 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) и метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) соответственно. Нейротоксин вызывал заметное усиление продукции АФК и приводил к смещению значений мембранного потенциала митохондрий в нейрональных клетках. Было обнаружено, что U-443, значительно снижает образование АФК в клетках, подвергшихся воздействию ротенона. Соединение U-443 в концентрации 0,1 мкМ снижало количество АФК в клетках практически до контрольного уровня в интактных клетках (Фиг. 2А), предотвращало деполяризацию и восстанавливало ММП до исходных значений и даже несколько выше (Фиг. 2Б).

Пример 3. Оценка спонтанной локомоции животных

На первом этапе исследования была создана индуцированная ротеноном экспериментальная модель болезни Паркинсона in vivo. Для этого мышам линии CD1 вводили раствор ротенона в оливковом масле в дозе 6 мг/кг подкожно один раз в сутки в течение 8 дней. Раствор леводопы (L-ДОФА), используемый в качестве препарата сравнения, в дозе 5 мг/кг в физиологическом растворе вводили перорально однократно в день после последней дозы ротенона. Затем через 40 минут оценивали эффект L-ДОФА в тестах «Цилиндр» (исследование мышами горизонтальной и вертикальной поверхностей стенки цилиндра) и «Открытое поле» (исследование двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мыши). Количество мышей, встающих на задние лапы в тесте «Цилиндр», фиксировали на видеокамеру и в дальнейшем подсчитывали визуально. Для регистрации (отслеживания) и последующей оценки поведения животных в тесте «Открытое поле» использовали компьютерную программу ToxTrac.

Как показано на Фиг. 3, ротенон значительно и достоверно изменял почти все показатели поведения животных. А именно, его введение уменьшало количество вставаний на задние лапы, скорость движения и общее пройденное расстояние, а также значительно увеличивало количество времени, проведенное без движения (общее время замирания) и количество случаев замирания у мышей. Супрессивный эффект ротенона, оцениваемый в тесте «Цилиндр», оставался практически неизменным в течение 10 дней после введения последней дозы ротенона (Фиг. 3А). L-ДОФА достоверно возвращала отмеченные показатели поведенческого статуса животных практически на контрольный уровень, тем самым оказывая нейропротекторное (антипаркинсоническое) действие. Этот препарат значительно увеличивал количество вставаний в тесте «Цилиндр», показатели средней скорости и общей пройденной дистанции, а также заметно снижал количество неподвижных актов и общее время замирания в тесте «Открытое поле» (Фиг. 3Б-Ж).

Далее исследовали антипаркинсоническую активность нафтохинона U-443 в экспериментальной модели болезни Паркинсона in vivo у мышей, индуцированной ротеноном. Для этого индукцию ротеноном проводили, как описано выше. Препарат U-443 в дозах 0,1; 1,0 или 10,0 мг/кг вводили, начиная через сутки после последней инъекции ротенона, внутрибрюшинно, 3 раза через день. Оценку эффективности проводили через сутки после последней инъекции U-443 в тестах «Цилиндр» и «Открытое поле». Наиболее значимые результаты по проявлению антипаркинсонической активности были получены при применении нафтохинона U-443 в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг (Фиг. 4). Введение 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона вызывало увеличение числа подъёмов животных в тесте «Цилиндр» (Фиг. 4А). Он значительно увеличил дистанцию, пройденную животными в тесте «Открытое поле», достоверно повысил среднюю скорость передвижения мышей до практически контрольных значений, а также практически во всех используемых дозах наиболее выражено снизил количество замираний и общее время нахождения в состоянии замирания в тесте «Открытое поле» (Фиг. 4Б-Д).

Изобретение относится к области медицины. Предложено применение 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона в качестве основы фармацевтических композиций для лечения болезни Паркинсона. Изобретение обеспечивает защиту нейрональных и макрофагальных клеток от токсического воздействия нейротоксина ротенона, способствует уменьшению образования активных форм кислорода и восстановлению мембранного потенциала митохондрий при развитии болезни Паркинсона. 4 ил., 3 пр.

Применение 2-(тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)-3-этил-5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона в качестве основы фармацевтических композиций для лечения болезни Паркинсона.