Способ моделирования сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной онкологии и фтизиатрии, и может быть использовано для моделирования сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза.

Одной из актуальных проблем современной медицины является сочетание туберкулеза с онкологическими заболеваниями. Связано это в первую очередь с неуклонным ростом в последние годы числа больных со злокачественными новообразованиями на фоне сохраняющейся напряженной ситуации по туберкулезу. В структуре онкологической заболеваемости населения одно из ведущих мест занимает рак легкого. По данным литературы, рак легкого у больных туберкулезом легких встречается в 4,5-7 раз чаще, чем в остальной популяции населения [1, 2]. В соответствии с действующими клиническими рекомендациями любая активная инфекция является общим противопоказанием для назначения противоопухолевого лечения. Таким образом, отсутствие рациональных схем терапии и возможности их разработки в клинике [3] создает необходимость в моделировании сочетанной патологии рака и туберкулеза в эксперименте. Модель позволит изучить патогенетическую взаимосвязь туберкулеза и рака и разработать оптимальные алгоритмы лечения микст патологии на основе исследования механизмов формирования и развития коморбидного статуса у лабораторных животных.

По данным литературы, для определения противоопухолевой и антиметастатической активности препаратов, применяемых в схемах лечения рака легкого, известно использование эпидермоидной легочной карциномы Льюиса, трансплантация которой, как правило, выполняется мышам линии C57BL/6 [4]. Кроме того, используя эту же линию инбредных мышей, можно добиться развития генерализованного туберкулеза [5]. Однако, до настоящего времени исследователями, не предпринимались попытки синхронизации инфекционного и опухолевого процесса в одной биологической модели. Видимо, по этой причине в проанализированной нами литературе не найдено прототипов модели микст патологии рака и туберкулеза.

Задачей предлагаемого изобретения является создание экспериментальной высоко воспроизводимой модели сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза, наиболее точно отражающей клиническое течение каждого из заболеваний.

Поставленная задача решается тем, что лабораторным животным (мыши линии C57BL/6) производят одномоментную инокуляцию суспензии штаммов Mycobacterium tuberculosis (референсный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv или клинический штамм Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью) в латеральную вену хвоста (в дозе 10⁶ микробных клеток в 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида) и трансплантацию 10% опухолевой взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида эпидермоидной карциномы легкого Льюиса в правую бедренную мышцу в объеме 0,2 мл. Контроль за развитием патологии осуществляют на 14 и 21 сутки.

Техническим результатом предлагаемого способа является высокая воспроизводимость модели в соответствии с патогномоничными признаками карциномы легкого и туберкулеза, простота исполнения, незначительные материальные затраты.

Сущность изобретения поясняется графическим материалом, где: Фиг 1. Методика инокуляции микобактериальной суспензии Mycobacteriumtuberculosis в латеральную хвостовую вену мыши линии C57BL/6 в дозе 10⁶ микробных клеток (в 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида) Фиг. 2 Методика внутримышечной трансплантации 0,2 мл 10% опухолевой взвези в 0.9% растворе натрия хлорида эпидермоидной карциномы легкого Льюиса в мышцу правого бедра мыши линии C57BL/6

Фиг. 3 Компьютерная томограмма легких мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv

Фиг. 4 Компьютерная томограмма бедра мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv

Фиг. 5 Микропрепарат ткани легкого мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv, с участком продуктивной специфической пневмонии (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 6 Микропрепарат ткани легкого мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv, с участком эпидермоидной карциномы легкого Льюиса (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 7 Микропрепарат мягких тканей бедра мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv, с опухолевым узлом (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 8 Микропрепарат бедренной кости мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной референсным штаммом Mycobacteriumtuberculosis H37Rv, с инвазией опухоли в костную пластинку (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 9 Компьютерная томограмма легких мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacteriumtuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду)

Фиг. 10 Компьютерная томограмма бедра мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacteriumtuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду)

Фиг. 11 Микропрепарат ткани легкого мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacteriumtuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду), с участком продуктивной специфической пневмонии (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 12 Микропрепарат ткани легкого мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacteriumtuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду), с участком эпидермоидной карциномы легкого Льюиса (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 13 Микропрепарат мягких тканей бедра мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacteriumtuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду), с опухолевым узлом (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Фиг. 14 Микропрепарат бедренной кости мыши с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированной клиническим штаммом Mycobacterium tuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду), с инвазией опухоли в костную пластинку (увеличение Х200, окраска гематоксилин и эозин)

Исследования проводились в лаборатории экспериментального туберкулеза и инновационных технологий ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России и научной лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России.

В качестве экспериментальной модели использовали 48 мышей (не считая контрольной группы) линии C57BL/6 в возрасте двух месяцев. Использование мелких лабораторных животных (мышей) дало возможность: 1) воспроизводимости модели в соответствии с патогномоничными признаками рака и туберкулеза; 2) постановки эксперимента на достаточно большом количестве модельных животных, что обеспечивает получение достоверных результатов; 3) экономии финансовых расходов на приобретение и содержание модельных животных.

Для воспроизведения опухолевого процесса использовалась эпидермоидная карцинома легкого Льюиса (из банка опухолевых штаммов научной лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России). Животным (мышам) трансплантируется опухоль посредством внутримышечного введения 10% опухолевой взвези в 0,9% раствора натрия хлорида в объеме 0,2 мл.

Для моделирования туберкулеза использовались два штамма Mycobacterium tuberculosis: 1) референсный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv (из коллекции федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации); 2) клинический штамм Mycobacterium tuberculosis 5582 с множественной лекарственной устойчивостью (изониазид, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин) и различными сочетаниями мутаций в генах rpoB (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду) из коллекции федерального государственного бюджетного учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федераци. Микобактериальную суспензию трехнедельных штаммов второй генерации инокулировали модельным животным в латеральную хвостовую вену в дозе 10⁶ микробных клеток в 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Контроль за развитием и течением сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза у лабораторных животных:

- клинические методы исследования: ежедневная оценка общего состояния животных (удовлетворительное / неудовлетворительное) и контроль размера и объема опухоли в месте трансплантации, динамика массы тела животных (кг) один раз в 7 дней;

- прижизненная КТ (компьютерную томографию) 6 животным из каждой группы, выбранным в случайном порядке на 14, 21 и 28 сутки от начала эксперимента. Исследование проводили на компьютерном томографе Canon (Япония) на высокоразрешающем алгоритме. Оценивали патологические изменения в легочной ткани, в мягких и костных тканях бедра; - визуальная оценка пораженности внутренних органов (проводилась после вскрытия животных);

- бактериологическое исследование на 14, 21 и 28 сутки от начала эксперимента путем дозированного посева гомогенатов легких (0,1 г) на плотную яичную среду Левенштейна-Йенсена (BectonDickinson, США) методом серийных разведений. Количество выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) микобактерий учитывали через 4 недели инкубации посевов при +37°С с последующим пересчетом на массу легких;

- гистологическое исследование (на 14, 21 и 28 сутки от начала эксперимента) образцов легочной ткани, костной ткани бедра и опухоли фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН=7,2) в течение 24 часов. Последующую обработку проводили в станции «TermoscientificSTP120" по стандартной методике с изготовлением парафиновых блоков и срезов толщиной 4 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином; по Цилю-Нельсену. Микроскопическое исследование срезов выполняли на микроскопе NikonCi-S с видеоцифровой обработкой.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoftlnc, USA). В случае отклонения от нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка) рассчитывали медиану (Me), первый и третий квартили (Q1-Q3). Оценивали достоверность различий метрических величин (критерий Вилкоксона), их корреляционную зависимость между собой (критерий Спирмена) и с количественными признаками (критерий Крускала-Уоллеса).

Пример 1. Модель сочетанной патологии карциномы легкого и лекарственно-чувствительного туберкулеза.

24 мыши линии C57BL/6 были инфицированы референсным штаммом Mycobacterium tuberculosis H37Rv (с сохраненной лекарственной чувствительностью ко всем противотуберкулезным препаратам). Одномоментно этим же животным была трансплантирована опухоль - эпидермоидная легочная карцинома Льюиса.

На 14 сутки эксперимента у всех мышей при клиническом обследовании выявлена опухоль в месте трансплантации. Динамика объема опухолевого узла представлена в таблице 1.

Прижизненный контроль патологических изменений в легких проводился с помощью компьютерной томографии животным на 14, 21 и 28 сутки от начала эксперимента. Кроме того, были оценены патологические изменения в области трансплантации опухоли. Результаты оценки компьютерных томограмм представлены в таблице 2.

Из таблицы следует, что уже на 14 сутки эксперимента при компьютерной томографии у всех мышей визуализировалась опухоль в месте трансплантации. При этом изменения в легких обнаруживали на этом сроке только у 17% обследованных животных.

К 21 суткам инфильтративно-очаговые изменения в легких выявлялись у всех мышей. После выполнения компьютерной томографии животные выводились из эксперимента методом цервикальной дислокации. Результаты морфологических исследований образцов органов и тканей представлены в таблице 3.

На 14 сутки эксперимента у всех животных определялись и морфологические признаки туберкулеза, а на 21 сутки - признаки туберкулеза легких и рака. У всех животных в месте трансплантации опухоль развивалась и распространялась на костную пластинку бедренной кости к 14 суткам эксперимента, а к 28 суткам проникала в костномозговую полость.

Туберкулез легких, помимо морфологического исследования, был подтвержден результатами бактериологического исследования образцов легких мышей с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированных референсным штаммом Mycobacterium tuberculosis H37Rv. При этом выявлена положительная линейная корреляция микобактериальной нагрузки в легких со сроком от момента заражения. Средний показатель микобактериальной нагрузки на 14,21 и 28 сутки эксперимента составил: 114308,33±50704,91 КОЕ на массу легких, 1201666,67±380600,40 КОЕ на массу легких, 1452700,00±496209,58 КОЕ на массу легких соответственно (коэффициент корелляции Спирмена 0,815, уровень значимости р<0,001).

Медиана выживаемости мышей с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированных референсным штаммом Mycobacterium tuberculosis H37Rv, составила 28 дней (95% ДИ=25,3-30,7).

Пример 2. Модель сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.

24 мыши на нулевые сутки эксперимента были инфицированы клиническим штаммом Mycobacterium tuberculosis 5582 (с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду). Одномоментно этим же животным была трансплантирована опухоль - эпидермоидной легочная карцинома Льюиса.

На 14е сутки эксперимента у всех мышей при клиническом обследовании выявлена опухоль в месте трансплантации. Динамика объема опухолевого узла представлена в таблице 4.

Из таблицы следует, что, как и в примере 1, размеры и объем опухоли увеличивались в зависимости от продолжительности периода наблюдения. Результаты оценки компьютерных томограмм представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы, при компьютерной томографии у 83% мышей визуализировалась опухоль в месте трансплантации на 14 сутки эксперимента, а через 3 недели эксперимента - у всех животных. К 21 суткам инфильтративно-очаговые изменения выявлялись у всех мышей, как и в примере 1. После выполнения компьютерной томографии животные выводились из эксперимента методом цервикальной дислокации. Результаты морфологических исследований образцов органов и тканей представлены в таблице 6.

На 14 сутки эксперимента у всех животных определялись и морфологические признаки туберкулеза, а на 21 сутки - признаки туберкулеза легких и карциномы. В месте трансплантации опухоль развивалась и распространялась на костную пластинку бедренной кости к 14 суткам эксперимента у всех животных.

Бактериологически туберкулез легких был подтвержден у всех животных, выведенных из эксперимента. Как и в примере 1, показатель КОЕ на массу легких при бактериологическом исследовании образцов легких мышей с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированных клиническим штаммом Mycobacterium tuberculosis 5582 прямо коррелировал со временем, прошедшим от начала заражения: средний показатель КОЕ на массу легких составил 113766,67±68228,37 и 1740000,00±410791,92 соответственно на 14 и 21 сутки эксперимента (коэффициент корелляции Спирмена 0,866, уровень значимости р=0,001).

Медиана выживаемости мышей с трансплантированной карциномой легкого Льюиса, инфицированных клиническим штаммом Mycobacterium tuberculosis 5582, составила 22 дня (95%ДИ=21,4-22,6).

Таким образом, предложенный способ позволяет получить модель сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза, позволяющую изучать развитие и взаимосвязь двух патологий. Модель может быть использована как для изучения патогенетических механизмов, так и для разработки оптимальных схем комплексной терапии. Представленные примеры доказывают возможность реализации и 100% воспроизводимость экспериментальной модели сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза как при инфицировании мышей штаммом Mycobacterium tuberculosis с сохраненной лекарственной чувствительностью, так и штаммом Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Литература

1. Cicenas S., Vencevicius V. Lung cancer in patients with tuberculosis // World. J. Surg. Oncol. - 2007. - Vol. 5. - P. 22. DOI: 10.1186/1477-7819-5-22

2. Григоренко C.A. Рак легких в сочетании с туберкулезом органов дыхания: кластерный анализ клинико-морфологических особенностей заболевания и оценка факторов, влияющих на выживаемость: автореф. дис. … канд. мед. наук. - Воронеж, 2009.

3. Трякин А.А., Бесова Н.С., Волков Н.М., Гладков О.А., Карасева В.В., Сакаева Д.Д., Фадеева Н.В. Практические рекомендации по общим принципам проведения противоопухолевой лекарственной терапии // Злокачественные опухоли. - 2021. - Т. 11. - NS2-1. - C. 23-35.

4. Вершинина С.Ф., Стуков А.Н. Экспериментальные опухоли: практическое руководство. - Санкт-Петербург: Галаника; 2018.

5. Павлова М.В., Ершова Е.С., Виноградова Т.И., Сапожникова Н.В., Заболотных Н.В., Гришко А.Н. Современные тенденции в лечении лекарственно-устойчивого туберкулеза // Медицинский альянс. 2017. - N4. - с. 23-29.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии и фтизиатрии, и может быть использовано для моделирования сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза. Для этого мышам линии C57BL/6 одномоментно инокулируют в латеральную вену хвоста суспензию штамма Mycobacterium tuberculosis в дозе 10⁶ микробных клеток в 0,2 мл физиологического раствора и трансплантируют в мышцу правого бедра животного 10% взвесь в физиологическом растворе эпидермоидной карциномы легкого Льюиса в объеме 0,2 мл. Затем осуществляют контроль развития патологии на 14 и 21 сутки. Изобретение обеспечивает создание экспериментальной высоковоспроизводимой модели сочетанной патологии рака и туберкулеза, наиболее точно отражающей клиническое течение каждого из заболеваний. 2 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл., 2 пр.

1. Способ моделирования сочетанной патологии карциномы легкого и туберкулеза, заключающийся в том, что мышам линии C57BL/6 одномоментно инокулируют в латеральную вену хвоста суспензию штамма Mycobacterium tuberculosis в дозе 10⁶ микробных клеток в 0,2 мл физиологического раствора и трансплантируют в мышцу правого бедра животного 10% взвесь в физиологическом растворе эпидермоидной карциномы легкого Льюиса в объеме 0,2 мл, затем осуществляют контроль развития патологии на 14 и 21 сутки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мышам вводят микобактериальную суспензию референсного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мышам вводят микобактериальную суспензию клинического штамма Mycobacterium tuberculosis 5582 с множественной лекарственной устойчивостью.