Способ микрокапсуляции спирулины Российский патент 2023 года по МПК A61K9/50 A61K35/748 A61K47/36 B01J13/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может использоваться для микрокапсуляции препарата спирулины.

Микроводоросль спирулина (Spirulina Platensis) в настоящее время нашла широкое применение в народном хозяйстве. Ее используют в медицине, животноводстве, ветеринарии, пищевой промышленности. Это связано с тем, что спирулина является источником ряда микронутриентов и биологически активных веществ с высокой степенью биодоступности. В частности, спирулина содержит белок, аминокислоты, фикоцианин, витамины, микро- и макроэлементы. Включение спирулины в рацион человека и животных повышает обмен веществ и естественную резистентность. Выпускают спирулину в виде порошков и таблеток, как отдельно, так и в комплексе с различными компонентами.

С целью повышения биодоступности спирулину подвергают микрокапсулированию, для чего применяют различные способы. Так, известен способ получения нанокапсул спирулины в каррагинане, характеризующийся тем, что в качестве ядра нанокапсул используют спирулину, а в качестве оболочки - каррагинан. Для выполнения способа порошок спирулины медленно добавляют в суспензию каррагинана в бензоле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с. Затем смесь перемешивают при 1000 об/мин и приливают хлороформ. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. При этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:3, или 1:5 (Патент РФ №2650966, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.).

Известен способ получения нанокапсул спирулины в агар-агаре, характеризующийся тем, что в качестве оболочки нанокапсул используется агар-агар, а в качестве ядра - спирулина. При выполнении данного способа порошок спирулины медленно добавляют в суспензию агар-агара в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с. Затем полученную смесь перемешивают при 1000 об/мин, приливают бутилхлорид, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. При этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:3, или 1:5 (Патент РФ №2652272, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.).

Известен способ получения нанокапсул спирулины в конжаковой камеди. Способ характеризуется тем, что для оболочки нанокапсул используется конжаковая камедь, а ядром капсул является спирулина. Для осуществления способа порошок спирулины медленно добавляют в суспензию конжаковой камеди в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с. Затем перемешивают при 1000 об/мин, приливают гексан и полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. При этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:3, или 1:5 (Патент РФ №2657748, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.).

Известен способ получения нанокапсул спирулины в гуаровой камеди, принцип которого заключается в том, что в качестве оболочки нанокапсул используется гуаровая камедь, а в качестве ядра - порошок спирулины. При этом спирулину добавляют в суспензию гуаровой камеди в бензоле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с, затем перемешивают при 1000 об/мин и приливают 1,2-дихлорэтан. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:2, или 1:3 (Патент РФ №2669356, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.).

Известен способ получения нанокапсул спирулины в высоко- или низкоэтерифицированном яблочном или цитрусовом пектине, характеризующийся тем, что в качестве оболочки нанокапсул используют пектин, а в качестве ядра - спирулину. Для осуществления способа порошок спирулины медленно добавляют в суспензию пектина в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с. Затем перемешивают при 1000 об/мин, приливают бутилхлорид и полученную суспензию отфильтровывают при комнатной температуре. При этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:3 (Патент РФ, №26724062, авт. А.А. Кролевец и др. - 2018 г.).

Недостатком указанных выше способов является то, что при капсулировании спирулины используются высокотоксичные и огнеопасные вещества (бутанол, дихлорэтан, бензол, бутилхлорид, гексан), работа с которыми требует соблюдения техники безопасности.

Наиболее близким по техническому решению является способ нанокапсулирования спирулины в альгинате натрия (Патент РФ №2648816, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.), который характеризуется тем, что в качестве ядра нанокапсул используют спирулину, а в качестве оболочки - альгинат натрия. Для выполнения способа порошок спирулины медленно добавляют в суспензию альгината натрия в бутаноле в присутствии поверхностно-активного вещества Е472с. Затем смесь перемешивают при 1000 об/мин, приливают 1,2-дихлорэтан и полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. При этом массовое соотношение ядро:оболочка в нанокапсулах составляет 1:1, или 1:3, или 1:5, размеры нанокапсул колеблются в пределах 12,5-912,5 нм (Патент РФ №2648816, авт. А.А. Кролевец. - 2018 г.).

Недостатком способа, взятого за прототип, является то, что размеры полученных нанокапсул варьируют в больших пределах, что оказывает отрицательное влияние на биологические свойства конечного продукта. При этом нанокапсулы имеют низкую устойчивость к желудочной соляной кислоте и подвергаются эффекту «слеживания» при хранении, а использование в технологическом процессе бутанола и 1,2-дихлорэтана, являющихся токсичными и огнеопасными веществами, требует соблюдения техники безопасности.

Технической задачей изобретения является получение микрокапсул стабильного размера и с высокими показателями ценных биологических свойств, повышение безопасности процесса микрокапсулирования путем исключения из него токсичных и огнеопасных веществ, а также повышение прочности микрокапсул к желудочной соляной кислоте и внешним факторам при хранении.

Решение технической задачи достигается тем, что 5,0 г сухого концентрата спирулины вносят в 50 мл дистиллированной воды и перемешивают на магнитной мешалке до однородного состояния. Полученную суспензию смешивают с равным количеством 5%-ного раствора альгината натрия. Затем смесь с использованием устройства нашей конструкции (Патент РФ №204989. - 2021 г. Устройство для микрокапсулирования жидких веществ. Авт. Сеин О.Б. и др.) через капельницы вносят в 0,2 М раствор кальция хлорида при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 400-500 об/мин до формирования микрокапсул. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают дистиллированной водой и помещают в 0,5%-ный раствор хитозана на 30-60 мин. После выдержки микрокапсул в хитозане их отделяют от раствора фильтрованием и высушивают при 30-35°С. Полученный препарат включает микрокапсулы, которые представляют собой сферические образования желто-серого цвета размером 80-110 мкм.

Выбранный для оболочки нанокапсул альгинат натрия представляет собой полисахаридный полимер, хорошо растворимый в воде с первоначальным образованием коллоидного раствора (гель). При этом альгинат натрия не растворяется в спиртах, органических растворителях, кислых растворах с рН менее 3, обладает выраженной термостабильностью. В пищевой промышленности альгинат натрия используется под маркировкой Е401 в качестве стабилизатора и загустителя. В фармацевтике альгинат натрия применяют для изготовления таблеток, свечей, мазей. Он обладает противовоспалительным, ранозаживляющим и кровоостанавливающим действием. Альгинат натрия относится к классическим материалам для изготовления оболочек микрокапсул. Однако при попадании в кислую среду желудка альгинатные оболочки «набухают», приобретают «трещины», что понижает их защитные свойства. В этой связи дополнительная обработка сформировавшихся микрокапсул 0,5% раствором хитозана повышает их устойчивость, это связано с образованием оболочки полиэлектролитного комплекса на поверхности микрокапсул.

Важной отличительной особенностью предлагаемого способа является использование в технологическом процессе устройства для микрокапсулирования жидких веществ разработанной нами конструкции (Патент РФ №204989. - 2021 г., авт. Сеин О.Б. и др.), включающего корпус в виде шприца-дозатора и капельниц, которые вмонтированы в капельницедержатель, выполненный в виде полихлорвиниловой трубки, имеющей форму кольца, соединяющегося с помощью тройника и трубки со шприцем-дозатором, обеспечивающего подачу микрокапсулируемого вещества в капельницедержатель.

Перед использованием устройства капельницедержатель фиксируют в стакане гомогенизатора и подают в него вещество для микрокапсуляции. Наличие одинаковых капельниц обеспечивает одновременное образование одинаковых капель, что, в отличие от прототипа, позволяет формировать микрокапсулы, размеры которых находятся в более узких границах.

Результатом предлагаемого способа является получение микрокапсул спирулины в альгинате натрия, имеющих более стабильные размеры, устойчивых к желудочной соляной кислоте и обладающих высокими показателями ценных биологических свойств, без использования в технологическом процессе токсических и огнеопасных веществ.

Пример получения микрокапсул спирулины с использованием разработанного способа.

5,0 г порошкообразной спирулины вносили в 50,0 мл дистиллированной воды и перемешивали на магнитной мешалке до однородного состояния. Полученную суспензию смешивали с равным количеством 5%-ного раствора альгината натрия. В стакане гомогенизатора фиксировали устройство для микрокапсулирования жидких веществ и подавали в него полученную смесь. Затем смесь с использованием устройства для микрокапсулирования жидких веществ, включающего корпус в виде шприца-дозатора и капельниц, которые вмонтированы в капельницедержатель, изготовленный из полихлорвиниловой трубки в форме кольца, соединяющегося с помощью тройника и трубки со шприцем-дозатором, обеспечивающим подачу микрокапсулируемого вещества в капельницедержатель, через капельницы вносили его в 0,2 М раствор кальция хлорида при постоянном перемешивании со скоростью вращения магнитной мешалки 500 об/мин до формирования микрокапсул. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяли на фильтре Шотта, промывали дистиллированной водой и помещали в 0,5%-ный раствор хитозана на 30 мин. После выдержки микрокапсул в хитозане их отделяли от раствора фильтрованием и высушивали при 30-35°С. Полученные микрокапсулы представляли собой сферические образования желто-серого цвета размером 80-110 мкм.

Пример сравнительной оценки разработанного микрокапсулированного препарата спирулины и препарата-прототипа на лабораторных животных (кроликах).

Апробацию разработанного препарата проводили на кроликах 4-месячного возраста породы советская шиншилла в условиях вивария Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Для этого было сформировано с соблюдением принципа аналогов три группы кроликов по 7 голов в каждой.

Кролики 1 (контрольной) группы получали основной рацион. Кроликам 2 (опытной) группы скармливали 0,20 г/гол препарата-прототипа. Кроликам 3 (опытной) группы скармливали 0,20 г/гол изготовленного препарата микрокапсулированной спирулины. Препараты скармливали индивидуально в виде болюсов из хлебного мякиша один раз в день в течение 20 дней подряд.

Животные контрольной и опытной групп содержались в типовых клетках в одном помещении и получали одинаковый рацион, включающий люцерно-клеверное сено и дерть ячменную.

У животных всех групп до начала эксперимента и в конце (на 20 день) брали кровь с использованием вакуумных пробирок TERUMO (Бельгия). В крови определяли общие гематологические показатели (скорость оседания эритроцитов, содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина) с применением общепринятых методик и гематологического анализатора Abacusvet. Биохимические компоненты крови исследовали с использованием наборов ДиаВетТест (Россия), Био-Ла-Тест (Чехия) и автоматического анализатора ILAB-650.

Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) исследовали с использованием культуры Staphylococcusaureus. Фагоцитарную активность крови (ФА) определяли путем реакции фагоцитоза с латексом. Содержание общих иммуноглобулинов устанавливали цинксульфатным методом. Идентификацию Т- и В- лимфоцитов проводили методами Е- и ЕАС-розеткообразования.

Результаты исследований показали, что общее состояние и аппетит у кроликов всех групп во время эксперимента находились в пределах физиологических норм. Определение общих гематологических показателей (табл. 1) свидетельствуют о том, что у кроликов, получавших микрокапсулированную спирулину (3 опытная группа), были более высокими гематокрит, содержание эритроцитов и гемоглобина по сравнению с животными 1 (контрольной) группы и фоновыми показателями. При этом различия в содержании эритроцитов и гемоглобина имели достоверный (р<0,05) характер. Что касается лейкоцитов, то у кроликов всех групп их количество в крови во время эксперимента не выходило за рамки физиологических границ.

В ходе биохимических исследований было установлено (табл. 2), что у кроликов, получавших микрокапсулированную спирулину, в крови содержалось достоверно (р<0,05) больше общего белка, альбуминов, общего кальция, неорганического фосфора и витамина А по сравнению с контрольными животными. У кроликов, получавших немикрокапсулированную спирулину, достоверное увеличение (р<0,05) регистрировалось только в содержании общего кальция, неорганического фосфора и витамина А.

Микрокапсулированная спирулина оказывала стимулирующее действие на неспецифические факторы защиты организма (табл. 3). В частности, у кроликов, получавших разработанный микрокапсулированный препарат, отмечалась более высокая бактерицидная и фагоцитарная активность крови, содержание общих иммуноглобулинов и Т-лимфоцитов по сравнению с животными контрольной и 2 опытной группы.

Результаты приведенных исследований свидетельствуют о том, что разработанный способ позволяет получить микрокапсулированный препарат, оказывающий более высокое стимулирующее действие на метаболизм и неспецифичрскую резистентность животных по сравнению с немикрокапсулированной спирулиной.

Изобретение относится к области химии и биотехнологии, а именно к способу микрокапсуляции спирулины, характеризующемуся тем, что в качестве ядра микрокапсул используют спирулину, а в качестве оболочки - альгинат натрия, отличающемуся тем, что 5,0 г порошкообразной спирулины смешивают с 50,0 мл дистиллированной воды магнитной мешалкой до однородного состояния, добавляют равное количество 5%-ного раствора альгината натрия, перемешивают и с использованием устройства для микрокапсуляции жидких веществ через капельницы вносят в 0,2 М раствор кальция хлорида при постоянном перемешивании магнитной мешалкой со скоростью ее вращения 400-500 об/мин до формирования микрокапсул, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают дистиллированной водой и выдерживают в 0,5%-ном растворе хитозана в течение 30-60 мин, затем микрокапсулы отделяют от раствора фильтрованием и высушивают при 30-35°С. Технический результат заключается в получении микрокапсул спирулины в альгинате натрия, имеющих стабильные размеры, без использования в технологическом процессе токсических и огнеопасных веществ, более высоком стимулирующем действии на метаболизм и неспецифическую резистентность животных по сравнению с немикрокапсулированной спирулиной. 3 табл., 2 пр.

Способ микрокапсуляции спирулины, характеризующийся тем, что в качестве ядра микрокапсул используют спирулину, а в качестве оболочки - альгинат натрия, отличающийся тем, что 5,0 г порошкообразной спирулины смешивают с 50,0 мл дистиллированной воды магнитной мешалкой до однородного состояния, добавляют равное количество 5%-ного раствора альгината натрия, перемешивают и с использованием устройства для микрокапсуляции жидких веществ, включающего шприц-дозатор и капельницы, которые вмонтированы в закрепленный внутри стакана гомогенизатора капельницедержатель, изготовленный из полихлорвиниловой трубки в виде кольца, соединяющегося посредством тройника и трубки со шприцем-дозатором, через капельницы вносят в 0,2 М раствор кальция хлорида при постоянном перемешивании магнитной мешалкой со скоростью ее вращения 400-500 об/мин до формирования микрокапсул, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают дистиллированной водой и выдерживают в 0,5%-ном растворе хитозана в течение 30-60 мин, затем микрокапсулы отделяют от раствора фильтрованием и высушивают при 30-35°С.