Способ получения микрокапсулированных половых феромонов быка Российский патент 2024 года по МПК A61K9/50 A61K35/12 A61K35/22 A61K35/48 B01J13/02 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, в частности, к способам получения биологически активных препаратов для стимуляции половой функции у самок сельскохозяйственных животных.

В настоящее время существуют различные способы микрокапсулирования пахучих веществ с целью длительного сохранения запаха. Например, известен способ получения желатиновых микрокапсул с душистым веществом путем диспергирования его в водном растворе желатина и электролитического выделения желатина на поверхности душистого вещества. При этом с целью повышения устойчивости микрокапсул и сокращения процесса микрокапсулирования отверждение оболочки проводят смешиванием суспензии микрокапсул с неароматизированным синтетическим моющим средством в массовом соотношении 1:10-250 (Авторское св. СССР № 1777947. - 1992 г. Авт. М.М. Заверач и др.).

Известен способ получения капсул ароматического масла и способ ароматизации пищевых продуктов, сущность которого заключается в образовании эмульсии ароматического масла в водном растворе полимера с образованием полимерных оболочек с последующей обработкой их сушильным агентом и распылительной сушкой (Патент РФ № 2089076. - 1997 г. Авт. Дэниэл Дж. Уэмплер и др.).

Известен способ микрокапсулирования вкусоароматических веществ и вкусоароматический порошок, полученный по этому способу, который включает следующие основные операции: смешивание мальтодекстрина или смеси мальтодекстрина с различным декстрозным эквивалентом с гуммиарабиком и/или липофильным крахмалом, диспергирование смеси в воде, введение вкусоароматических веществ с получением капсулирующей эмульсии, гомогенизацию полученной эмульсии с получением микроэмульсии, распылительную сушку микроэмульсии с получением тонкодисперсного вкусоароматического порошка (Патент РФ № 2194424. - 2002 г. Авт. Андреенков В.А. и др.)

Известен способ микрокапсулирования вкусоароматических веществ и вкусоароматический порошок, полученный по этому способу. Способ включает смешивание мальтодекстрана или смесь мальтодекстрана с различным декстрозным эквивалентом с гуммиарабиком и/или липофильным крахмалом, диспергирование смеси в воде, введение вкусоароматических веществ с получением капсулирующей эмульсии, гомогенизацию полученной эмульсии с получением микроэмульсии, распылительную сушку микроэмульсии с получением тонкодисперсного вкусоароматического порошка. При этом диспергирование смеси проводят при комнатной температуре в течение 10-15 мин, термостатирование при 60-80°С в течение 7-15 мин и при 40-60°С в течение 7-20 мин. В качестве вкусоароматических веществ используют эфирные масла и/или олеорезины пряноароматических растений, которые предварительно нагревают до 50-70°С. Введение вкусоароматических веществ в смесь проводят с помощью перистальтического насоса и скорости перемешивания гомогенезатора 6000-8000 об/мин. Затем эмульсию гомогенизируют при скорости вращения блендера 20000-30000 об/мин. Распылительную сушку микроэмульсии проводят при скорости вращения диска ато-майзера 25000-35000 об/мин при температуре на входе 150-190°С и на выходе 70-95°С распылительной камеры. В результате получают микрокапсулированный вкусоароматический порошок (Патент РФ 2194424. - 2002 г. авт. Андреенков В.А. и др.).

Известен способ микрокапсулирования вкусоароматических веществ и вкусоароматический продукт, полученный этим способом, в котором приготавливают капсулирующий компонент из сухого обезжиренного молока. Для этого молоко диспергируют в воде при температуре 20-40°С, фильтруют и термостатируют при температуре 45-75°С.Затем в полученную смесь вводят смесь вкусоароматических веществ. В заключение проводят распылительную сушку при скорости подачи гомогенизированной микроэмульсии 90-100 мл/мин. Полученный продукт представляет собой порошок дисперсностью 20-70 мкм и имеющий характерный запах (Патент РФ № 2305473. - 2007 г. Авт. Австриевских А.Н. и др.).

Известен способ получения микрокапсул ароматизатора «кофе», обладающих супрамолекулярными свойствами, характеризующийся тем, что ароматизатор «кофе», используемый в качестве ядра микрокапсул, растворяют в этаноле. Затем полученную смесь диспергируют в суспензии натрикар-боксиметилцеллюлозы, используемой в качестве оболочки микрокапсул, в ацетоне в присутствии поверхностно активного вещества Е 472 с. Сформировавшиеся микрокапсулы отфильтровывают и сушат при комнатной температуре (Патент РФ № 2533215. - 2014 г. Авт. Кролевец А.А.).

Известен способ получения частиц, инкапсулированных жирорастворимой полимерной оболочкой ароматизаторов, обладающих супрамолекулярными свойствами. Согласно способу ароматизатор «паприка», используемый в качестве ядра микрокапсул, растворяют в бутаноле. Затем полученную смесь диспергируют в растворе жирорастворимого полимера, используемого в качестве оболочки микрокапсул, в изопропаноле в присутствии 0,01 г препарата Е472 с. Осаждают микрокапсулы бутанолом и водой, после чего их отфильтровывают и сушат при комнатной температуре (Патент РФ №2533279. - 2014 г. Авт. Кролевец А.А.).

Существует способ получения инкапсулированного ароматизатора «яблоко», обладающего супрамолекулярными свойствами. Способ характеризуется тем, что ароматизатор «яблоко» растворяют в бутаноле и диспергируют полученную смесь в раствор каррагинана в изопропаноле в присутствии препарата Е472 с при перемешивании 1300 об/с. Сформировавшиеся микрокапсулы из раствора в изопропаноле осаждают путем добавления в качестве нерастворителя бутанола и воды. Полученные микрокапсулы сушат при комнатной температуре (Патент РФ 2548716. - 2015 г. Авт. Кролевец А.А.)

Известен способ получения микрокапсул, с использованием которого можно микрокапсулировать душистые вещества, что позволяет решить задачу длительного сохранения запаха. При этом процесс микрокапсулирования проводят в несколько этапов. На первом этапе проводят модификацию водного раствора желатина. Затем в полученный раствор желатина вводят стабилизирующую добавку. После этого в полученном водном растворе проводят эмульгирование гидрофобного вещества при интенсивном перемешивании. В результате получают эмульсию, которая состоит из капель жидкости, стабилизированных структурированными слоями модифицированного желатина. Затем в полученную эмульсию вводят электролитную соль, снижающую растворимость желатина и высаливающую его на поверхности капсул. Далее проводят быстрое охлаждение раствора и промывание образовавшихся микрокапсул. Заключительной операцией формирования микрокапсул является отвердение (дубление) их оболочек (База патентов Казахстана. Патент № 29893 - 2015 г. Авт. Николаева Е.С.и др.).

Общим недостатком способов, представленных в авторском свидетельстве СССР № 1777947, в патентах РФ № 2089076, № 2533215, № 2533279, № 2548716, № 2567341, в патенте № 29893 (Казахстан) является наличие в конечном продукте большого количества микрокапсул разного размера, что отрицательно сказывается на биологических свойствах микрокапсулированного препарата.

Наиболее близким по техническому решению является способ получения инкапсулированного ароматизатора «фейхоа», обладающего супрамолекулярными свойствами (Патент РФ 2567341. - 2015 г. Авт. Кролевец А.А.), характеризующийся тем, что ароматизатор растворяют в бутаноле и диспергируют полученную смесь в альгинат натрия в изопропаноле в присутствии препарата Е472с (сложный эфир глицерина с одной-двумя молекулами пищевых жирных кислот и одной-двумя молекулами лимонной кислоты, причем лимонная кислота, как трёхосновная, может быть этерифицирована другими глицеридами и как оксикислота - другими жирными кислотами) при перемешивании 1300 об/мин. Далее приливают бутанол и воду. Полученные микрокапсулы отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Выход готовых микрокапсул составляет 99%.

Недостатком способа-прототипа является то, что при его использовании размеры полученных микрокапсул колеблются в широких границах и микрокапсулы подвергаются эффекту «слеживания» в процессе хранения. При этом в способе-прототипе используются изопропанол и бутанол, являющиеся токсичными и огнеопасными веществами.

Технической задачей изобретения является усиление биологически активных свойств препарата за счет получения микрокапсул более стабильного размера, исключения из технического процесса ядовитых и огнеопасных веществ, а также повышения устойчивости микрокапсул к внешним фактором при хранении (предупреждение эффекта «слеживания»).

Решение технической задачи достигается тем, что 100 г препарата натуральных половых феромонов быка смешивают с равным количеством 5%-ного альгината натрия в магнитной мешалке. Затем полученную смесь с использованием устройства авторской конструкции (Устройство для микрокапсулирования веществ в жидком состоянии. Патент РФ 211590. - 2021 г. Авт. Сеин О.Б. и др.) капельно диспергируют с высоты 20-25 см в 100-150 мл 0,2М раствор кальция хлорида. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-120 об/мин в течение 20-35 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта под вакуумом и помещают их в 0,5%-ный раствор хитозана на 50-60 мин. После выдержки в хитозане микрокапсулы извлекают и высушивают при 30-35°С.Полученные микрокапсулы представляют собой частицы сферической формы белого цвета с желтоватым оттенком размером 75-90 мм. Выход микрокапсул составляет 87,8%.

Отличительной особенностью разработанного способа является использование в качестве ядра микрокапсул натуральных половых феромонов быка, а в качестве оболочки - альгината натрия.

Половые феромоны представляют собой пахучие аттрактанты стероидной природы, выделяемые половозрелыми самцами и стимулирующие проявление у самок половых рефлексов. Используемые в качестве ядра микрокапсул половые феромоны быка были получены по ранее разработанному нами способу (Способ получения половых феромонов самцов домашних животных. Патент РФ 2623085. - 2017 г. Авт. Сеин О.Б. и др.). Сущность данного способа заключается в измельчении семенников полученных от половозрелых быков до фаршеобразного состояния с последующей гомогенизацией до однородной массы. В полученную массу вносят фермент протосубтилин и полисорбат ТВИН-80 и проводят инкубацию в термостате при температуре 37-39°С в течение 60 мин. Затем смесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин до ее разделения на две фракции. Надосадочную жидкость смешивают с мочой половозрелых самцов и перегоняют с водяным паром. Полученный препарат натуральных половых феромонов быка представляет собой прозрачную жидкость без оттенков со специфическим запахом.

Выбранный в качестве оболочки микрокапсул альгинат натрия является органическим соединением, представляющим собой соль натрия и альгининовой кислоты, которое получают из морских водорослей. Он растворяется в воде, при этом превращается вначале в коллоидный раствор, переходящий в гелеобразное состояние. Альгинат натрия хорошо образует полимерные пленки, поэтому его широко используют в процессах микрокапсулирования. При этом альгинатные оболочки нетоксичные и обладают хорошими технологическими характеристиками.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является также использование в технологическом процессе устройства авторской конструкции для микрокапсулирования веществ в жидком состоянии, включающего шприц-дозатор, капельницедержатель с восемью капельницами и баллон, в котором осуществляется процесс микрокапсулирования. В баллоне находится магнитный якорь для перемешивания содержимого в процессе микрокапсулирования. Наличие капельниц обеспечивает, в отличие от способа-прототипа, одновременное формирование восьми одинаковых капель. Выдержка сформировавшихся микрокапсул в 0,5%-ным растворе хитозана способствует образованию на их поверхности полиэлектролитной оболочки, что повышает устойчивость микрокапсул к «слеживанию» и увеличивает сроки их хранения.

Результатом разработанного способа является получение микрокапсул половых феромонов быка в альгинате натрия, имеющих стабильные размеры, улучшенные биологически активные свойства, не подвергающихся эффекту «слеживания» и обладающих длительным сроком хранения.

Пример получения микрокапсул половых феромонов быка с использованием разработанного способа.

100 г препарата натуральных половых феромонов быка смешивали с равным количеством 5%-ного альгината натрия в магнитной мешалке. Затем полученную смесь с использованием устройства авторской конструкции капельно диспергировали с высоты 20 см в 100 мл 0,2 М раствора кальция хлорида. Процесс диспергирования проводили при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 120 об/мин в течение 35 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяли на фильтре Шотта под вакуумом и помещали их в 0,5%-ный раствор хитозана на 60 мин. После выдержки в хитозане микрокапсулы извлекали и высушивали при 35°С. Полученные микрокапсулы имеют сферическую форму и белый цвет с желтоватым оттенком размером 75-90 мм. Выход микрокапсул составлял 87,8%.

Пример получения микрокапсул половых феромонов быка с использованием способа-прототипа.

100 мг половых феромонов быка диспергировали в раствор альгината натрия в изопропаноле, содержащего 300 мг указанного полимера в присутствии 0,01 г препарата Е472с при перемешивании 1300 об/мин. Далее приливали 2 мл бутанола и 1 мл воды. Полученную суспензию отфильтровывали и высушивали при комнатной температуре. Средний размер микрокапсул составлял 397 нм, выход микрокапсул-91,0%.

Сравнительная оценка биофармацевтических свойств микрокапсул половых феромонов, полученных с использованием разработанного способа и способа-прототипа.

Важным биофармацевтическим показателем изготовленных микрокапсул с использованием различных способов и компонентов является их способность сохранять структуру в различных реактивных средах в течение длительного времени. Учитывая это, нами была проведена сравнительная оценка полученного микрокасулированного препарата с препаратом-прототипом.

В ходе проведенных исследований было установлено (таблица 1), что микрокапсулы, полученные по разработанному способу, были более устойчивыми к фосфатному буферному раствору (смесь растворов динатрия фосфата и калия дигидрофосфата с рН-6,8). После 60-минутного нахождения в данном растворе отмечалось только частичное растворение микрокапсул. В то же время микрокапсулы, изготовленные по способу-прототипу, в данных условиях разрушались полностью. Устойчивость изготовленных микрокапсул связана с их дополнительной обработкой раствором хитозана, который создавал защитную полиэлектролитную оболочку.

Оценка биологической (феромональной) активности половых феромонов быка, полученных разработанным способом и способом-прототипом.

Биологическую (феромональную) активность препаратов, полученных разработанным способом и способом-прототипом определяли с использованием поведенческого биологического теста (по проявлению «флемен-рефлекса»), разработанного академиком В.Е. Соколовым (Химическая коммуникация животных. - М.: Наука, 1986). Тестирование проводили в условиях ветеринарной клиники Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Объектом исследований являлись половозрелые телки черно-пестрой породы. Перед исследованием тестируемые препараты смешивали с фосфатным буферным раствором в соотношении 1:30 и 1:50, выдерживали 60 мин и затем с использованием пульверизатора распыляли на уровне носового зеркала животных в дозе 0,5 мл/гол.

Результаты тестирования показали (таблица 2), что у телок, обработанных разработанным препаратом, процент ключевых (положительных) ответов был достоверно (р<0,01) выше по сравнению с препаратом-прототипом. Было также отмечено, что при использовании препаратов в соотношении 1:30 процент ключевых ответов был выше по сравнению с соотношением 1:50.

Влияние хранения на органолептическую оценку и биологическую (феромональную) активность микрокапсулированных половых феромонов быка, полученных разработанным способом и способом-прототипом.

Сравнительное исследование микрокапсулированных половых феромонов, полученных разработанным способом и способом-прототипом, проводили после 12-месячного их хранения при 4°С.

Органолептическая оценка показала, что цвет препаратов после хранения не изменялся, в обоих случаях он соответствовал первоначальной оценке - «белый с желтоватым оттенком». Микрокапсулы, изготовленные по разработанному способу, имели округлую форму с хорошей сыпучестью. При этом большая часть (60-65%) микрокапсул, полученных по способу-прототипу, подвергалась эффекту «слеживания», превращаясь в комкообразную массу.

Результаты биологического тестирования показали, что после 12-месячного хранения биологическая активность тестируемых препаратов снижалась (таблица 3). При этом минимальной она была у препарата-прототипа, а максимальной - у разработанного препарата.

Таким образом, проведенные сравнительные исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет получить микрокапсулированные натуральные половые феромоны быка с более высокой биологической активностью по сравнению с препаратом-прототипом.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, а именно к способу получения микрокапсулированных половых феромонов быка с оболочкой из альгината натрия. Способ получения микрокапсулированных половых феромонов быка с оболочкой из альгината натрия, согласно которому 100 г половых феромонов смешивают с равным количеством 5%-ного альгината натрия в магнитной мешалке, затем полученную смесь с использованием устройства для микрокапсулирования веществ в жидком состоянии капельно диспергируют с высоты 20-25 см в 100-150 мл 0,2М раствора кальция хлорида, процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-120 об/мин в течение 20-35 мин, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта под вакуумом и помещают их в 0,5%-ный раствор хитозана на 50-60 мин, после выдержки в хитозане микрокапсулы извлекают и высушивают при 30-35°С. Вышеописанный способ позволяет получить микрокапсулированные половые феромоны быка с оболочкой из альгината натрия, микрокапсулы имеют стабильные размеры, улучшенные биологически активные свойства, не подвергаются эффекту «слеживания» и обладают длительным сроком хранения. 3 табл.

Способ получения микрокапсулированных половых феромонов быка с оболочкой из альгината натрия, отличающийся тем, что 100 г половых феромонов смешивают с равным количеством 5%-ного альгината натрия в магнитной мешалке, затем полученную смесь с использованием устройства для микрокапсулирования веществ в жидком состоянии капельно диспергируют с высоты 20-25 см в 100-150 мл 0,2М раствора кальция хлорида, процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-120 об/мин в течение 20-35 мин, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта под вакуумом и помещают их в 0,5%-ный раствор хитозана на 50-60 мин, после выдержки в хитозане микрокапсулы извлекают и высушивают при 30-35°С.