Способ микрокапсулирования пробиотика ветоспорина Российский патент 2024 года по МПК A61K9/50 B01J13/00 A61K35/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной медицины и может быть использовано для получения микрокапсулированных пробиотических препаратов.

В настоящее время известен способ получения микрокапсул бактерий, который предусматривает приготовление дисперсии лиофилизированной биомассы в расплаве С₁₂-С₂₄ жирной кислоты при температуре от 40°С до 75°С и при соотношении от 50 до 90 мас. % жирной кислоты с последующей подачей полученной смеси на вращающийся диск инкапсулятора, работающего в пределах 2000-4000 об/мин (Патент РФ №2096452. - 1997, авт. В.М. Ратерфорд и др.). Недостатком данного способа является длительность процесса и применение специального дорогостоящего оборудования.

Известен способ получения микрокапсулированных форм лактобактерий с использованием сополимера акриловой и метакриловой кислот, заключающийся в том, что лиофилизированную культуру микроорганизмов диспергируют в водной суспензии сополимера. Полученную суспензию впрыскивают в жидкий сверхлегкий парафин, минеральные масла, легкие растительные масла, содержащие 0,1-0,5% стеарата алюминия и 3-7% ПЭГ-400 (полиэтиленгликоля), гомогенизируют до образования эмульсии с частицами желаемого размера и оставляют при постоянном нагревании и перемешивании 100-300 об/мин до формирования микрокапсул (Патент РФ № 2171672, - 2000 г., авт. В.А. Быков и др.). Недостатком указанного способа является многоэтапность и длительность процесса.

Известен способ получения микрокапсул, содержащих живые микроорганизмы, на основе поливинилпирролидона, отличающихся тем, что лиофилизированную культуру микроорганизмов диспергируют в 30-50%-ном водном растворе поливинилпирролидона в соотношении 1:10-1:15 по массе при перемешивании до образования живой устойчивой взвеси, добавляют 10-30% - ный водный раствор танина, смесь перемешивают до формирования микрокапсул (Патент РФ № 2220716, - 2004. авт. Д.В. Сомов и др.). Недостатком данного способа является сложность и многоэтапность технологического процесса.

Известен способ инкапсуляции интестевита, характеризующийся тем, что 100 мг пробиотика интестевита растворяют в 1 мл диоксана или диметилсульфоксида, или диметилформамида, диспергируют полученную смесь в раствор натрий карбоксиметилцеллюлозы в ацетоне, содержащий 300 мл указанного полимера, в присутствии 0,01 г препарата Е472с при перемешивании, и доливают 1 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат (Патент РФ № 2544169. - 2015, авт. О.Б. Сеин и др.).

Известен способ инкапсуляции лактобифадола в оболочку из карбоксиметилцеллюлозы, характеризующийся тем, что пробиотик лактобифадол растворяют в диоксане или диметилсульфоксиде, или диметилформамиде. Затем добавляют полученный раствор лактобифадола к раствору натрий карбоксиметилцеллюлозы в серном эфире в присутствии препарата Е472с при перемешивании 1000 об/сек. При этом лактобифадол и натрий карбок-симетилцеллюлозу берут в массовом соотношении 1:3, затем добавляют 1 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат (Патент РФ № 2545742. - 2015, авт. А.А. Кролевец и др.).

Известен способ инкапсуляции лактобифадола, который заключается в том, что пробиотик лактобифадол диспергируют в суспензию альгината натрия в гексане в присутствии препарата Е472с при перемешивании 1000 об/сек. Далее доливают четыреххлористый углерод, полученную суспензию нанокапсул отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом соотношение ядро/оболочка в нанокапсулах составляет 1:3, или 1:5, или 5:1 (Патент РФ № 2570379. - 2015, авт. А. А. Кролевец, О.Б. Сеин и др.).

Известен способ получения нанокапсул пробиотиков, заключающийся в том, что в качестве оболочки используют: альгинат натрия, который осаждают из суспензии в бензоле в присутствии сложного эфира глицерина с одной-двумя молекулами пищевых жирных кислот и с одной-двумя молекулами лимонной кислоты путем добавления гексана в качестве осадителя, при этом массовое соотношение пробиотика альгинат натрия составляет 1:3, 1:5 или 5:1 (Патент РФ № 2595830. - 2016, авт. А.А. Кролевец, О.Б. Сеин и др.).

Известен способ микрокапсуляции энзимспорина, который характеризуется тем, что пробиотик энзимспорин диспергируют в суспензию альгината натрия при перемешивании 800-1000 об/мин и осаждают 50% - ным ацетоном в присутствии 0,2 М раствора хлорида кальция при постоянном перемешивании в течение 15 мин. Затем отверждённые микрокапсулы фильтруют на фильтре Шотта и высушивают при 30-35°С (Патент РФ № 2689164. - 2019, авт. Д.В. Трубников, О.Б. Сеин и др.).

Общим недостатком способов, указанных в выше перечисленных патентах РФ (№ 2544169, № 2545742, № 2570379, № 2595830, № 2689164), является использование в технологическом процессе токсических веществ (ацетон, диоксан, бензол, гексан, эфир, четыреххлористый углерод), которые снижают жизнеспособность пробиотических бактерий, подвергающихся микрокапсулированию.

Известен способ получения микрокапсулированного энзимспорина, характеризующийся тем, что в очищенную воду вносят пробиотик энзимспорин и активированный уголь, смешивают до однородного состояния и в полученную суспензию добавляют равное количество 5% - ного раствора альгината натрия. Затем полученную смесь с использованием устройства-дозатора диспергируют с высоты 20-25 см в 150-200 мл 0,2 М раствора кальция хлорида при постоянном перемешивании со скоростью 50-60 об/мин в течение 20-25 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием и помещают в 0,4-0,5% - ный раствор хитозона, в котором их выдерживают 50-60 мин. Полученные микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С (Патент РФ № 2780885. - 2022 г., авт. О.Б. Сеин и др.). Недостатком указанного способа является относительно низкое содержание жизнеспособных пробиотических бактерий в полученном препарате.

В качестве прототипа_выбран способ получения микрокапсул пробиотика ветом 1 (Патент РФ № 2781792. - 2022 г., авт. О.Б. Сеин и др.), который характеризуется тем, что в 5,0 г пробиотика ветома 1 вносят в 50,0 мл очищенной воды и перемешивают до однородного состояния в магнитной мешалке. Полученную суспензию смешивают с равным по объему количеством 4%- ного раствора альгината натрия. Затем с использование специального устройства-дозатора с высоты 20-25 см полученную смесь диспергируют в 0,2 М раствор кальция хлорида. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 50-60 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием и помещают в 0,4-0,5% - ный раствор хитозана, в котором их выдерживают 50-60 мин. После этого микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С.

Недостатком способа, взятого за прототип, является относительно низкий выход готовых микрокапсул (80-85%), что отрицательно сказывается на биологических свойствах конечного продукта.

Технической задачей изобретения является повышение биологической активности микрокапсулированного ветоспорина за счет получения микрокапсул более стабильного размера и снижения потерь пробиотических бактерий в процессе микрокапсулирования.

Решение технической задачи_достигается тем, что 100 мл пробиотика ветоспорина вносят в 100 мл 50%- ного раствора поливинилпирролидона и перемешивают в магнитной мешалке до однородной суспензии. С использованием устройства авторской конструкции (Устройство для микрокапсулирования жидких веществ. Патент РФ № 215675. - 2022 г., авт. О.Б. Сеин и др.) в полученную суспензию с высоты 20-25 см диспергируют со скоростью 2,0 мл/мин в 50-100 мл 25-30% - ного водного раствора танина. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-150 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием с использованием фильтра Шотта, промывают и сушат при 30-35°С. Микрокапсулы представляли собой сферические образования бежевого цвета размером 0,65-0,80 мм. Выход готовых микрокапсул составлял 90-96%.

Отличительной особенностью разработанного способа получения микрокапсул является использование в качестве ядра многофункционального пробиотика ветоспорина, а в качестве оболочки поливинилпирролидона. При этом применение специального устройства для микрокапсулирования жидких веществ с целью диспергирования рабочей суспензии в водный раствор танина, позволяло получать микрокапсулы более стабильного (одинакового) размера.

Используемый в способе пробиотик ветоспорин разработан и производится «НВП БашИнком» (Россия). Ветоспорин представляет собой взвесь живых бактерий природных штаммов Bacillus subtilis 12В (с антибактериальной активностью), выделенных из ризосферы пшеницы. В 1 мл препарата содержится не менее 100 млн живых бактерий и спор. Данный пробиотик обладает выраженной антагонистической активностью к бактериям и грибковым патогенным микроорганизмам и вирусам, которые выделяет до 70 видов антибиотических веществ полипептидной природы. Применение ветоспорина оказывает иммуномодулирующее действие. В частности, увеличивает продукцию эндогенного интерферона, повышает фагоцитарную активность лейкоцитов и функциональную активность макрофагов.

Применяемый в качестве оболочки микрокапсул поливинилпирролидон относится к полимерам, состоящим из мономерных единиц N-винилпирролидона. Он хорошо растворяется в воде с последующим сгущением. Поливинилпирролидон безвреден и зарегистрирован в качестве пищевой добавки Е1201, его используют для стабилизации вязкости и пленкообразования. Применение в нашем случае поливинилпирролидона в качестве оболочки позволяет сформировать микрокапсулы устойчивые к соляной кислоте, что предотвращает гибель пробиотических бактерий в же-желудке и обеспечивает их поступление в кишечник.

Используемый в способе танин относится к водорастворимым полифенолам, обладает дубильными свойствами, которые основаны на его способности образовывать прочные связи с белками, полисахаридами и другими полимерами. Танин относится к безвредным веществам, он зарегистрирован в качестве пищевой добавки Е181. В нашем случае использование танина обеспечило дополнительную защиту микрокапсул от агрессивных факторов желудка (низкое значение рН, ферменты).

Применяемое для диспергирования рабочей суспензии устройство авторской конструкции включает баллон с крышкой, капельницедержатель и электросмеситель. При этом капельницедержатель выполнен в виде кольца из тефлоновой трубки, в которую вмонтированы 20 капельниц. Капельницедержатель соединяется со шприцем-дозатором, с помощью которого в баллон подается вещество для капсуляции. Использование данного устройства обеспечивает формирование и подачу в баллон одинаковых капель, а электросмеситель позволяет перемешивать в баллоне содержимое с заданной скоростью. В результате микрокапсулы приобретают стабильные размеры.

Результатом разработанного способа является получение микрокапсул ветоспорина в поливинилпирролидоне с выходом микрокапсул 90-96%, имеющих стабильные размеры 0,65-0,80 мм устойчивые к кислой среде желудка и включающие высокое содержание пробиотических бактерий.

Пример получения микрокапсул ветоспорина.

100 мл ветоспорина вносят в 100 мл 50%- ного раствора поливинилпирролидона и перемешивают в магнитной мешалке до однородной суспензии. С применением устройства для микрокапсулирования в полученную суспензию с высоты 20 см диспергируют со скоростью 2,0 мл/мин в 100 мл 30%-ного водного раствора танина. Диспергирование проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100 об/мин в течение 25 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием с использованием фильтра Шотта, промывают и высушивают при 35°С. Полученные микрокапсулы имеют сферическую форму и бежевый цвет. Размеры микрокапсул находились в границах 0,65-0,80 мм. Выход готовых микрокапсул составлял 90%.

Содержание пробиотических бактерий, входивших в состав препарата микрокапсулированного ветоспорина, определяли оптическим методом (по стандартам мутности) и с использованием камеры Горяева. Для анализа количества жизнеспособных клеток исследуемых микроорганизмов разрушали оболочку микрокапсул буферным раствором с рН 7,8-8,0, титровали культуру и высевали пробиотические бактерии на питательную среду.

Бактериологические исследования показали, что количество жизнеспособных бактерий в исследуемом препарате составляло 5,8⋅10⁴-6,5⋅10⁴ в 1 г, что выше по сравнению с препаратом - прототипом (5,0⋅10⁴-5,4⋅10⁴ в 1 г).

Таким образом использование заявляемого способа позволяет получить микрокапсулы с более оптимальными технологическими характеристиками и высоким содержанием пробиотического препарата.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к способу получения микрокапсул ветоспорина в поливинилпирролидоне, отличающееся тем, что пробиотик ветоспорин смешивают с равным по объему 50%-ным раствором поливинилпирролидона и с использованием устройства для микрокапсулирования жидких веществ, имеющего 20 капельниц, с высоты 20-25 см полученную смесь диспергируют со скоростью 2,0 мл/мин в 50-100 мл 25-30%-ного водного танина при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-150 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием с использованием фильтра Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С. Изобретение обеспечивает получение микрокапсул ветоспорина в поливинилпирролидоне с выходом микрокапсул 90-96%, имеющих стабильные размеры 0,65-0,80 мм устойчивые к кислой среде желудка и включающие высокое содержание пробиотических бактерий. 1 пр.

Способ получения микрокапсул ветоспорина в поливинилпирролидоне, отличающийся тем, что пробиотик ветоспорин смешивают с равным по объему 50%-ным раствором поливинилпирролидона и с использованием устройства для микрокапсулирования жидких веществ, имеющего 20 капельниц, с высоты 20-25 см полученную смесь диспергируют со скоростью 2,0 мл/мин в 50-100 мл 25-30%-ного водного танина при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 100-150 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей, сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием с использованием фильтра Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С.