Способ прогнозирования продуктивности птицы по составу микробиома и активности ферментов желудочно-кишечного тракта Российский патент 2023 года по МПК A23K10/30 G01N1/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к птицеводству, и позволяет в раннем возрасте проводить оценку продуктивных качеств цыплят-бройлеров. Целью изобретения является разработка способа прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров на основании определения связи микробиома и активности ферментов ЖКТ с продуктивными качествами.

Известен способ расчета соотношения нуклеиновых кислот и белков в эпителиальных клетках, определенных с помощью люминесцентно-микроскопического анализа гистосрезов слизистой оболочки железистого желудка, позволяет оценить состояние внутриклеточного обмена веществ у птиц при клебсиеллезе. Достоинство способа - характеризует степень изменений внутриклеточного обмена веществ в клетках железистого желудка птиц при клебсиеллезе [1]. Недостатки способа: а) разработан для патологии; б) нельзя использовать для прижизненной оценки.

Известен способ оценки продуктивности молодняка крупного рогатого скота в подсосный период по индексу липидного обмена, рассчитанного на основании концентрации фосфолипидов, свободного холестерина и свободных жирных кислот. При значении индекса 2,7-3,6 усл. ед. животных относят к высокопродуктивным [2]. Недостатки способа: а) разработан для молодняка крупного рогатого скота; б) не отражает роль белкового метаболизма в процессах роста животных.

Наиболее близким аналогом изобретения, выбранным в качестве прототипа, является способ прогнозирования продуктивности цыплят-бройлеров [3]. Согласно ему, прогнозирование продуктивности цыплят-бройлеров осуществляется на основе определения соотношения между активностью белкового и липидного обмена веществ, определяющего скорость роста птицы и уровень продуктивности, что позволяет прогнозировать уровень прироста массы тела бройлерных цыплят по биохимическим показателям крови.

Недостаток: а) нельзя использовать для прижизненной оценки; б) характеризует зависимость продуктивности цыплят-бройлеров от показателей белкового и липидного обмена, но не отражает взаимосвязь с обменом углеводов, содержанием химических элементов и состоянием микробиома желудочно-кишечного тракта.

В результате сопоставительного анализа заявляемого решения с прототипом можно сделать вывод, что заявляемый способ прогнозирования продуктивности цыплят-бройлеров позволяет объективно оценить уровень абсолютных приростов массы тела цыплят по соотношению между показателями содержания конкретных химических элементов в маховых перьях (Mg, I) и долей Lactobacillus в ЖКТ совместно с активностью амилазы в помете птицы, потому что основан на установлении взаимосвязи между химическими элементами и показателями микробиома и ферментативной активностью ЖКТ, что определяет параметры роста и развития сельскохозяйственной птицы. Чем ниже показатели индекса продуктивности, тем более активно происходят процессы усвоения питательных элементов в кишечнике цыплят-бройлеров. Так как неизвестны другие технические решения, основанные на вычислении индекса продуктивности цыплят-бройлеров, рассчитанного по взаимосвязи между химическими элементами и показателями микробиома и ферментативной активностью ЖКТ, предлагаемый способ соответствует критерию «новизна».

Признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа:

1. Способ предназначен для прижизненной оценки показателей продуктивности цыплят-бройлеров.

2. Позволяет оценить активность показателей работы ЖКТ птицы, что напрямую влияет на усвоение питательных веществ и увеличение массы тела.

Анализ известных технических решений в области птицеводства свидетельствует об отсутствии в них признаков, сходных с отличительными признаками в заявляемом способе. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень», так как для специалиста оно явным образом не следует из уровня техники.

Способ был реализован следующим образом.

Экспериментальная часть работ проводилась в условиях вивария Федерального научного центра биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, г.Оренбург.Исследования выполнялись на цыплятах-бройлерах кросса Арбор Айрекс (n=60). Продолжительность эксперимента 35 суток. Кормление и поение птицы осуществлялось групповым методом согласно рекомендациям ВНИИТИП.

Для оценки качественного и количественного состава микробиома ЖКТ птицы проводили секвенирование. Микробное биоразнообразие помета оценивали на 14-е сут.При выделении ДНК отобранные пробу содержимого инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 300 мкл стерильного буфера для лизиса (20 мМ EDTA, 1400 мМ NaCl, 100 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 50 мкл раствора лизоцима в концентрации 100 мг/мл). К смеси добавляли 10 мкл протеиназы К («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) в концентрации 10 мг/мл и SDS до конечной концентрации 1,0% и инкубировали в течение 30 мин при 60 С.ДНК очищали смесью фенола и хлороформа (1: 1), осаждали добавлением ацетата натрия (3 М, до 10% по объему) и трех объемов абсолютного этанола при -20°С в течение 4 ч. После экстракции смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25: 24: 1) и хлороформ:изоамиловый спирт (24:1) ДНК в водной фазе осаждали 1 М ацетатом аммония (до 10% по объему) и 3-кратным объемом безводного этанола в течение ночи при -20°С. Осадок ДНК отделяли центрифугированием (12000 об/мин, 10 мин), дважды промывали 80% этанолом, сушили и растворяли в ТЕ-буфере (1 M Tris-HCl, pH 8,0 - 1 мл, 0,5 М EDTA, pH 8,0 - 200 мкл, Н2О до 100 мл; «Евроген», Россия). Чистоту экстракции оценивали по отрицательному контролю выделения (100 мкл автоклавированной деионизированной воды). Чистоту полученных препаратов ДНК проверяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле с фотометрией (NanoDrop 8000, «Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Концентрацию ДНК измеряли флуориметрическим методом (прибор Qubit 2.0 с высокой чувствительностью определения dsDNA, «Life Technologies», США.

ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы по протоколу «Illumina, Inc.» (США) с праймерами S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-21 к вариабельному участку V3-V4 гена 16S рРНК (24). NGS-се-квенирование выполняли на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором реактивов MiSeq Reagent Kit V3 PE600 («Illumina, Inc.», США) в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН). Классификацию полученных операционных таксономических единиц (ОТЕ, OTU) проводили с использованием интерактивного инструмента VAMPS и базы данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Некоторые ОТЕ выравнивали c помощью алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), используя базы данных нуклеотидных последовательностей nr/nt (National Center for Biotechnological Information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и выравненных последовательностей генов рибосомальной РНК SILVA (https://www.arb-silva.de).

Для оценки активности ферментов ЖКТ проводили исследование помета, которое выполняли после взвешивания навески (1 г), которую измельчали и путем растирания в гомогенизаторе (TissueRuptor, QIAGEN) в холодном растворе Рингера (рН 7,4) и получали гомогенат. Определение содержания амилазы в приготовленном гомогенате проводили после добавления 1% экстракта слизистой двенадцатиперстной кишки. (Вертипрахов В.Г., 1989). Активность амилазы определяли по методу Смит-Роя-Уголева (1965) в модификации Ц.Ж. Батоева, 1972).

У цыплят в 14-суточном возрасте отбирали помет на исследования. Абсолютный прирост массы тела (в г) рассчитывали в целом в соответствии с возрастом птицы.

Предварительно был проведен анализ по выявлению показателей, коррелирующих с продуктивными качествами цыплят-бройлеров. Для этого в возрасте 14 суток определяли ряд показателей, представленных в таблице 1. После проведения убоя в возрасте 42 суток оценивали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена данных показателей и интенсивности роста птицы (табл.1).

На основании полученных данных была введена формула для прогнозирования интенсивности роста на основе приведенных показателей:

L - % доли бактерий Lactobacillus по результатам высокопроизводительного секвенирования гена 16s рРНК

A - активность амилазы в помете, мг/(мл×мин)

K - коэффициент активности ферментов, ед.

при I≤14,3 цыплят-бройлеров относят к группе с высокими продуктивными качествами.

Динамика данных показателей отражает процессы, происходящие по мере роста и увеличения массы цыплят-бройлеров. Так, активность амилазы в помете должна быть невысокой, так как увеличение свидетельствует о развитии заболеваний ЖКТ и плохом усвоении питательных веществ корма на всем протяжении выращивания птицы. Доля бактерий Lactobacillus позволяет оценивать состояние ЖКТ, так как данные бактерии ферментируют широкий спектр углеводов, в том числе таких, как крахмал и инулин, продуцируют биологически активные вещества, необходимые для роста других бактерий, утилизируют вредные продукты обмена и, таким образом, поддерживают микроэкологическое равновесие в пищеварительном тракте.

Производственная проверка проведена в условиях ЗАО «Птицефабрика Оренбургская» на 100 головах цыплят-бройлеров.

Весовой рост с 7 (начало эксперимента) до 42 (конец эксперимента) суток изучали путем индивидуальных взвешиваний. Расчетным методом определяли абсолютный и среднесуточный приросты за период опыта. Обработка полученного материала производилась с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2016, Statistica 10.0 («StatSoftInc.», США), при этом уровень значимости различий по результатам сравнения выборок принимался меньшим или равным 0,05.

Результаты анализа влияния кормовых средств на продуктивные качества цыплят-бройлеров показали достоверные изменения живой массы, абсолютного и среднесуточного приростов по сравнению с контрольной группой (табл.2).

Так, цыплята-бройлеры при индексе продуктивности I≤14,3 превосходили на 42 сутки группу с индексом продуктивности I≥14,3 по живой массе, среднесуточному и абсолютному приростам за период опыта на 17,2% (р≤0,001), 21,1% (р≤0,05) и 20,7% (р≤0,05), соответственно.

Еще одним важнейшим показателем, отражающим продуктивные качества цыплят-бройлеров, являются их убойные качества (табл.3).

Цыплята-бройлеры группы при индексе продуктивности I≤14,3 превосходили группу с индексом продуктивности I≥14,3 по массе полупотрошенной тушки на 18,1% (р≤0,01), потрошеной тушки - на 16,7% (р≤0,001), выходу мякоти - на 18,5% (р≤0,01).

Таким образом, на основании проведенных исследований предложен способ прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров на основании прижизненной оценки в возрасте 14 суток связи микробиома и активности ферментов ЖКТ, позволяющий при индексе продуктивности I≤14,3 дать благоприятный прогноз по интенсивности роста и итоговой живой массе.

Источники информации:

1. Патент на изобретение RU 2469296 Люминесцентно-микроскопический способ оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка птиц клебсиеллезе / С.В. Ларионов, С.В. Акчурин: опубл. 10.12.2012, бюл. №34.

2. Патент на изобретение RU 2463784 Способ оценки мясной продуктивности молодняка крупного рогатого скота в подсосный период / М.А. Дерхо, Е.Н. Елисеенко, Н.В. Фомина: опубл. 20.10.2012, бюл. №29.

3. Патент на изобретение RU 2540435 Способ прогнозирования мясной продуктивности цыплят-бройлеров / Е.А. Колесник, М.А. Дерхо: опубл. 10.02.2015, бюл. №4.

Таблица 1 Показатель Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена интенсивности роста % Lactobacillus 0,73* % Bacillus 0,12 % Ruminococcus 0,39 % Faecalibacterium 0,35 % Alistipes 0,27 Активность амилазы в помете -0,71* Активность протеазы в помете -0,21 Активность липазы в помете -0,14 Таблица 2 Показатели Группа I≤14,3 (n=78) I≥14,3 (n=22) Живая масса, г: 7 сутки 195,8±4,49 196,3±5,13 14 суток 357,2±8,42 359,1±9,30 21 сутки 597,4±14,63 526±12,21* 28 сутки 1 084,1±22,35 867,3±17,84* 35 сутки 1 755,4±21,36 1 382,4±21,78^** 42 сутки 2 312,2±28,39 1 912,7±36,5^*** Среднесуточный прирост, г/гол/сут 70,2±35,01 55,4±27,95* Абсолютный прирост, г/гол/опыт 1955±155,4 1550±114,1* Расход корма на прирост 1 кг живой массы, кг/гол 1,48 1,57 Таблица 3 Показатели Группа I≤14,3 I≥14,3 Живая масса, г 2 312,2±28,39 1 912,7±36,5*** Полупотрошенная тушка, г 2195,4±30,1 1797,7±33,9** Потрошеная тушка, г 1553,7±22,1 1294,1±21,7*** Выход мякоти, г 1107,5±16,2 901,7±12,0** Выход мякоти,
% к живой массе 47,8 47,1 Выход мышц,
% к потрошеной тушки 71,2 69,6 Убойный выход, % 67,1 69,6

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к птицеводству, и представляет собой способ прогнозирования продуктивности птицы по составу микробиома и активности ферментов желудочно-кишечного тракта в раннем возрасте. Способ прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров на основе процентного содержания бактерий Lactobacillus и активности амилазы в помете цыплят-бройлеров отличается тем, что в качестве критерия оценки при прогнозировании продуктивных качеств используется индекс продуктивности, который рассчитывается по формуле , где K – коэффициент активности ферментов, ед.; A – активность амилазы в помете, мг/(мл×мин); L – процентное содержание бактерий Lactobacillus от общего числа по результатам высокопроизводительного секвенирования гена 16s рРНК; при I≤14,3 цыплят-бройлеров относят к группе с высокими продуктивными качествами. Изобретение можно использовать для своевременной корректировки рационов кормления, достижения эффективных приростов массы тела и повышения рентабельности птицефабрики. 3 табл.

Способ прогнозирования продуктивности цыплят-бройлеров, включающий определение активности амилазы в помете и доли Lactobacillus в бактериальном сообществе кишечника птицы; на основе взаимосвязи между данными показателями рассчитывается индекс продуктивности

,

где L – % доли бактерий Lactobacillus по результатам высокопроизводительного секвенирования гена 16s рРНК;

A – активность амилазы в помете, мг/(мл×мин);

K – коэффициент активности ферментов, ед.;

при I≤14,3 цыплят-бройлеров относят к группе с высокими продуктивными качествами.