ЛЮМИНЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ОБМЕНА ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В СТЕНКЕ ЖЕЛЕЗИСТОГО ЖЕЛУДКА ПТИЦ ПРИ КЛЕБСИЕЛЛЕЗЕ Российский патент 2012 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения степени изменения внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка при лечении птиц, больных клебсиеллезом, и проведения научно-исследовательской работы.

В настоящее время в птицеводческих хозяйствах все чаще регистрируется острая желудочно-кишечная форма клебсиеллеза, который наносит значительный экономический ущерб, обусловленный массовым падежом птицы в ранние сроки заболевания до достижения воспалительным процессом уровня клинической манифестации и характерной патоморфологической картины. В основном это связано с развитием патологических метаболических изменений в клетках, сопровождающихся нарушением обмена органических веществ, в том числе нарушением соотношения нуклеиновых кислот и белков во внутренних органах, и в первую очередь в стенке железистого желудка, при этом состояние внутриклеточного обмена органических веществ зависит от степени выраженности данных нарушений.

Известен патологоанатомический способ оценки изменений, развивающихся в стенке железистого желудка при клебсиеллезе, включающий визуальный осмотр с установлением их характера (О.П.Ольховик. Клебсиеллез бройлеров. - Канд. дисс. вет. наук. - Краснодар, 2009, с.76). Данный способ применяют для оценки патоморфологической картины в виде серозно-геморрагического воспаления слизистой оболочки железистого желудка, характерного для клебсиеллеза в период разгара заболевания.

Недостатком данного способа является возможность применения его для установления клебсиеллеза только в период клинической манифестации (разгара) заболевания и невозможность использования способа для оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в ранние сроки заболевания до появления выраженных клинических и патоморфологических признаков.

Прототипом предлагаемого изобретения является люминесцентно-микроскопический способ оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ с помощью определения соотношения нуклеиновых кислот и белков в гистологических срезах биологических объектов (В.Н.Карнаухов. Люминесцентный спектральный анализ клетки. - М.: Наука, теоретическая и прикладная биофизика. - 1978, с.90-93). Способ включает люминесцентный спектральный анализ гистологических срезов, окрашенных специфической метахроматической люминесцентной меткой-красителем «Steins all» с регистрацией в спектре люминесценции двух полос излучения при длинах волн 490 и 615 нм, характерных для ДНК и РНК (нуклеиновых кислот) и белков ткани головного мозга крысы.

Недостатками такого способа являются невозможность:

- применения его для изучения ткани железистого желудка птиц, так как установленные в спектре люминесценции полосы излучения при длинах волн 490 и 615 нм характерны для нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и белков ткани головного мозга крысы, и не отражают индивидуальные особенности люминесценции ткани железистого желудка птиц;

- определения количественного содержания в ткани железистого желудка птиц органических веществ (нуклеиновых кислот и белков);

- исключения влияния аутолиза, развивающегося посмертно в биологических объектах, что в совокупности делает невозможным оценку состояния внутриклеточного обмена органических веществ в исследуемой ткани в ранние сроки клебсиеллеза.

Технической задачей изобретения является повышение точности диагностики состояния внутриклеточного обмена органических веществ (нуклеиновых кислот и белков) в стенке железистого желудка птиц при клебсиеллезе посредством учета индивидуальных особенностей люминесценции исследуемой ткани, определения количественного содержания в ней органических веществ и исключения влияния аутолиза.

Техническая задача достигается люминесцентно-микроскопическим способом оценки состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка птиц при клепсиеллезе, включающим люминесцентный спектральный анализ окрашенных с использованием специфической метахроматической люминесцентной метки-красителя «Steins all» гистологических срезов, в котором согласно изобретению проводят исследование гистологических срезов стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют три участка с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и проводят его цифровую обработку: регистрируют величину интенсивности люминесценции полосы излучения при длине волны, характерной для нуклеиновых кислот зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 484 нм, и при длине волны, характерной для белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 620 нм, определяют количественное содержание нуклеиновых кислот и белков в условных единицах по отношению полученных значений к эталону, в качестве которого используют величину интенсивности люминесценции уранового стекла при длине волны 540 нм, устанавливают наибольшее количество нуклеиновых кислот и белков из трех полученных по каждому из них результатов и рассчитывают по нему коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле:

где λ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Х_mах - наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Y_max - наибольшее количество белков в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки,

по которому, в свою очередь, устанавливают показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков обследуемой птицы по формуле:

С=λ₁-λ₂,

где С - показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в железистом желудке обследуемой птицы;

λ₁ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки здоровой птицы;

λ₂ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки обследуемой птицы,

и при значениях показателя более 1,25 устанавливают тяжелую степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, при значениях показателя 1,25-0,85 - среднюю степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, а при значениях показателя менее 0,85 - внутриклеточный обмен нуклеиновых кислот и белков в пределах нормы.

Техническая задача достигается тем, что количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где Х - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 484 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Техническая задача достигается тем, что количество белков в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

,

где Y - количество белков в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_в - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 620 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Отличием изобретения от прототипа является то, что проводят исследование гистологических срезов стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют три участка с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и проводят его цифровую обработку: регистрируют величину интенсивности люминесценции полосы излучения при длине волны, характерной для нуклеиновых кислот зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 484 им, и при длине волны, характерной для белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 620 нм, определяют количественное содержание нуклеиновых кислот и белков в условных единицах по отношению полученных значений к эталону, в качестве которого используют величину интенсивности люминесценции уранового стекла при длине волны 540 нм, устанавливают наибольшее количество нуклеиновых кислот и белков из трех полученных по каждому из них результатов и рассчитывают по нему коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле:

где λ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

X_max - наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Y_max - наибольшее количество белков в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки,

по которому, в свою очередь, устанавливают показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков обследуемой птицы по формуле:

C=λ₁-λ₂,

где С - показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в железистом желудке обследуемой птицы;

λ₁ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки здоровой птицы;

λ₂ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки обследуемой птицы,

и при значениях показателя более 1,25 устанавливают тяжелую степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, при значениях показателя 1,25-0,85 - среднюю степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, а при значениях показателя менее 0,85 - внутриклеточный обмен нуклеиновых кислот и белков в пределах нормы.

Отличием изобретения от прототипа является то, что количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где Х - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 484 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Отличием изобретения от прототипа является то, что количество белков в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где Y - количество белков в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_в - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 620 им;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 им, используемая в качестве эталона.

На фигуре 1 показана кривая спектра люминесценции зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки гистологического среза стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы. На фигуре 2 показана кривая спектра люминесценции зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки гистологического среза стенки железистого желудка обследуемой птицы. На фигурах 1 и 2: I - величина интенсивности люминесценции, I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество нуклеиновых кислот, I_в - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество белков.

Способ осуществляют следующим образом. Для оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка обследуемой птицы следует установить коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки в гистологическом срезе стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы соответствующей породы и возрастной категории, который используют в дальнейшей работе. Для этого в гистологическом срезе стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы, окрашенном специфической метахроматической люминесцентной меткой-красителем «Steins all», определяют зону эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при помощи, например, микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К, в которой методом визуальной микроскопии находят три участка с наибольшей степенью интенсивности люминесценции. В каждом участке получают спектр люминесценции и проводят его цифровую обработку. Количество органических веществ, выявляемых с помощью люминесцентно-микроскопического метода, определяется величиной интенсивности люминесценции (I) полосы излучения в спектре люминесценции гистологического среза, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки-красителя, при длине волны, соответствующей максимальной величине интенсивности люминесценции примененного красителя. В полученном спектре люминесценции исследуемого участка определяют две полосы излучения, имеющие максимальную величину интенсивности люминесценции используемого для выявления нуклеиновых кислот и белков метахроматического красителя «Steins all», которые регистрируются при длинах волн, равных 484 и 620 нм. Поэтому количество нуклеиновых кислот и белков определяют по величине интенсивности люминесценции полос излучения при указанных длинах волн. Данные индивидуальные особенности люминесценции ткани железистого желудка птиц установлены авторами изобретения при исследовании спектра люминесценции зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки гистологического среза его стенки. Вместе с тем величина интенсивности люминесценции зависит не только от количества содержащихся в исследуемом участке нуклеиновых кислот и белков, но и от параметров режима работы, при котором регистрируют спектры люминесценции. Поэтому для получения сопоставимых результатов количественного содержания нуклеиновых кислот и белков оно должно быть выражено в условных единицах, что достигается с помощью эталона, в качестве которого используют величину интенсивности люминесценции при длине волны 540 нм промышленно изготавливаемого и имеющего постоянный спектр люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм.

Количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где Х - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 484 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 им, используемая в качестве эталона.

Количество белков в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где Y - количество белков в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_в - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 620 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Развитие аутолитического процесса уменьшает интенсивность люминесценции и, соответственно, снижает показатель количественного содержания органических веществ при прочих равных условиях. Для исключения влияния аутолиза на изменение количественного содержания нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки принимают во внимание наибольшее значение из трех полученных по каждому из них результатов, по которому и рассчитывают коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка контрольной здоровой птицы. Поэтому коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в каждой зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

где λ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Х_mах - наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Y_max - наибольшее количество белков в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Полученный коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки контрольной здоровой птицы используют для оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка обследуемой птицы.

Аналогичным способом получают спектр люминесценции гистологического среза стенки железистого желудка обследуемой птицы, который окрашивают с использованием специфической метахроматической люминесцентной метки-красителя «Steins all». Спектр люминесценции подвергают цифровой обработке следующим образом.

Рассчитывают количество нуклеиновых кислот в условных единицах в трех исследуемых участках зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, каждое из которых устанавливают по формуле при помощи следующих величин (где «Х_O» подставляют в формулу вместо «X», «I_no» - вместо «I_n»):

Х_o - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_no - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 484 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Устанавливают наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах из трех участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки Х_omax.

Рассчитывают количество белков в условных единицах в трех исследуемых участках зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, каждое из которых рассчитывают по формуле при помощи следующих величин (где «Y_o» подставляют в формулу вместо «Y», «I_во» - вместо «I_в»):

где Y_o - количество белков в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_во - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 620 нм;

I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

Устанавливают наибольшее количество белков в условных единицах из трех участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки Y_omax.

Рассчитывают коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле (где «λ₁» подставляют вместо «λ», «Х_omax» вместо «X_max», «Y_omax» вместо «Y_max») при помощи следующих величин:

где λ₁ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Х_omax - наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

Y_omax - наибольшее количество белков в условных единицах в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

По полученным коэффициентам соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки контрольной здоровой и обследуемой птиц определяют степень нарушения внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке обследуемой птицы по формуле:

С=λ₁-λ₂,

где С - показатель степени изменения внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке обследуемой птицы;

λ₁ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки здоровой птицы;

λ₂ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки обследуемой птицы.

Исходя из вышеизложенного, предлагаем следующую классификацию состояния внутриклеточного обмена органических веществ (нуклеиновых кислот и белков) в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки стенки железистого желудка при клебсиеллезе птиц по степени его нарушения (таблица 1).

Таблица 1 Классификация состояния внутриклеточного обмена органических веществ (нуклеиновых кислот и белков) в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки стенки железистого желудка при клебсиеллезе птиц Состояние внутриклеточного обмена органических веществ Показатель степени нарушения тяжелая степень нарушения >1,25 средняя степень нарушения 1,25-0,85 в пределах нормы <0,85

Данный способ позволяет надежно определить степень нарушения внутриклеточного обмена органических веществ (нуклеиновых кислот и белков) в стенке железистого желудка птиц с учетом индивидуальных особенностей люминесценции ткани, количественного содержания в ней органических веществ и исключения влияния аутолитических процессов. При этом обязательным является условие, согласно которому гистологические срезы должны быть получены при одинаковых условиях их изготовления, а все спектры люминесценции зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм - при одинаковых параметрах режима работы.

Предложенный способ проиллюстрирован на следующем экспериментально-клиническом примере: при проведении опыта использовали группу (80 голов) цыплят породы Хайсекс коричневый, заражение которых проводили per os (в ротовую полость) на вторые сутки жизни смывами культуры Klebsiella pneumoniae, при этом использовали полевой штамм. Для определения степени нарушения внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка обследуемой птицы отбирали по одному цыпленку из группы зараженных птиц и проводили люминесцентно-микроскопическое исследование по следующей схеме: до начала лечения при появлении первых клинических признаков заболевания на третьи сутки после заражения; и в процессе лечения, начиная с третьих суток, через каждые сутки в течение четырех суток (таблица 2). При определении степени нарушения внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка обследуемой птицы учитывали коэффициенты соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки контрольной птицы данной породы Хайсекс коричневый и возрастной категории.

Таблица 2 Степень нарушения внутриклеточного обмена органических веществ и коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы породы Хайсекс коричневый Сроки исследования Коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков Показатель степени нарушения До лечения 5,45 1,63 3-и сутки с начала лечения 5,12 1,48 4-е сутки с начала лечения 3,46 1,27 5-е сутки с начала лечения 2,35 0,93 6-е сутки с начала лечения 1,98 0,84

Из таблицы видно, что до лечения коэффициент отношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки стенки железистого желудка птиц был высоким, соответственно и показатель степени нарушения внутриклеточного обмена органических веществ в этой зоне согласно предложенной классификации был высоким (>1,25). Предлагаемый люминесцентно-микроскопический способ позволил выявить нарушения внутриклеточного обмена органических веществ (нуклеиновых кислот и белков) в стенке железистого желудка в ранние сроки клебсиеллеза и своевременно начать лечение больных птиц. За период лечения внутриклеточные обменные процессы постепенно восстанавливались, коэффициент отношения нуклеиновых кислот и белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки снижался и, как следствие, уменьшался показатель степени нарушения внутриклеточного обмена органических веществ, который к 6-м суткам лечения составил 0,84, что согласно предложенной классификации свидетельствует о восстановлении внутриклеточного обмена органических веществ до нормы (<0,85).

Таким образом, предложенный люминесцентно-микроскопический способ оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в стенке железистого желудка птиц при клебсиеллезе позволяет повысить точность диагностики нарушения внутриклеточного обмена органических веществ посредством учета индивидуальных особенностей люминесценции исследуемой ткани, определения количественного содержания в ней органических веществ и исключения влияния аутолиза.

Изобретение относится к области ветеринарии. Представленный способ включает люминесцентный спектральный анализ окрашенных с использованием специфической метахроматической люминесцентной метки-красителя «Steins all» гистологических срезов, проведение исследования гистологических срезов стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, далее на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют три участка с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и проводят его цифровую обработку, по коэффициенту соотношения нуклеиновых кислот и белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки устанавливают показатель степени нарушения внутриклеточного обмена. Представленный способ позволяет повысить точность диагностики состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка птиц при клебсиеллезе. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

1. Люминесцентно-микроскопический способ оценки состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка птиц при клебсиеллезе, включающий люминесцентный спектральный анализ окрашенных с использованием специфической метахроматической люминесцентной метки-красителя «Steins all» гистологических срезов, отличающийся тем, что проводят исследование гистологических срезов стенки железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют три участка с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и проводят его цифровую обработку: регистрируют величину интенсивности люминесценции полосы излучения при длине волны, характерной для нуклеиновых кислот зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 484 нм, и при длине волны, характерной для белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 620 нм, определяют количественное содержание нуклеиновых кислот и белков в условных единицах по отношению полученных значений к эталону, в качестве которого используют величину интенсивности люминесценции уранового стекла при длине волны 540 нм, устанавливают наибольшее количество нуклеиновых кислот и белков из трех полученных по каждому из них результатов и рассчитывают по нему коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле:
,
где λ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
X_max - наибольшее количество нуклеиновых кислот в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
Y_max - наибольшее количество белков в условных единицах из трех исследуемых участков зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки,
по которому, в свою очередь, устанавливают показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков обследуемой птицы по формуле: C=λ₁-λ₂,
где С - показатель степени нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков в железистом желудке обследуемой птицы;
λ₁ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки здоровой птицы;
λ₂ - коэффициент соотношения нуклеиновых кислот и белков в зоне эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки обследуемой птицы,
и при значениях показателя более 1,25 устанавливают тяжелую степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, при значениях показателя 1,25-0,85 - среднюю степень нарушения внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот и белков, а при значениях показателя менее 0,85 - внутриклеточный обмен органических веществ в пределах нормы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:
,
где Х - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 484 нм;
I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество белков в условных единицах в каждом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:
,
где Y - количество белков в условных единицах в исследуемом участке зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
I_в - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителиальных клеток глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 620 нм;
I_э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 540 нм, используемая в качестве эталона.