Штамм Bifidobacterium animalis subsp. lactis, используемый для получения ферментированных и неферментированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище (варианты) Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K35/745 A23C9/12 C12R1/01 

Изобретение относится к штаммам Bifidobacterium animalis subsp. lactis и может быть использовано в биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности при производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин (Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с. 300) [1], (Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с. 295) [2].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Заявляемые штаммы принадлежатт к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Вид Bifidobacterium animalis имеет два подвида Bifidobacterium animalis animalis и Bifidobacterium animalis lactis.

Bifidobacterium animalis subsp.lactis входит в группу классических пробиотиков - микроорганизмов кишечного происхождения, регулярный прием которых оказывает благоприятное действие на жизнедеятельность отдельных тканей, органов и общее здоровье человека.

Известны штаммы Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, выведенные впервые и помещенные в коллекцию культур датской компанией Chr. Hansen в 1983 году.

Известен чувствительный к тетрациклину пробиотик Bifidobacterium animalis subsp. lactis штамма BB - 12® и применение такого нового штамма для приготовления пищевого или кормового продукта или лекарственной формы, содержащей жизнеспособные указанные микроорганизмы (международная заявка WO 2008058854, МПК А23С 9/123; A23L 1/30, опубл. 22.05.2008 г.).

На основе выше описанных Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB -12® получен штамм CHCC5445 с инвентарным номером DSM15954 и разработан способ производства кисломолочного продукта с высокой пробиотической ценностью путем инокуляции молока указанным штаммом и стимулирующей рост бифидобактерий добавкой, содержащей источник марганца (Европейский патент № ЕР 2380446, МПК А23С 9/123; А23С 9/13; A23L 1/30, опубл. 06.04.2011 г.).

Известен пробиотический продукт, содержащий активный ингредиент Bifidobacterium animalis subsp. lactis для уменьшения болей в животе у женщин в постменопаузе. Bifidobacterium animalis subsp. lactis депонирован как DSM 15954. Bifidobacterium animalis subsp.lactis, назначают в капсулах и вводят в количестве, соответствующем не менее 10⁹ КОЕ в течение по меньшей мере 2 недель (Европейский патент ЕР 2990045, МПК A23L 2/84; А61К 35/745, опубл. 02.03.2016 г.).

Известно применение компаниями ЖЕРВЭ ДАНОН (Франция) и ТАФТС ЮНИВЕРСИТИ (США) Bifidobacterium animalis подвида lactis штамма CNCM 1-2494 для снижения набора веса тела, вызванного пищей, и улучшения вызванной пищей инсулинорезистентности у субъекта (заявка РФ №2015129066, МПК C12N 1/00, опубл. 23.01.2017 г.). Указанный штамм содержится в композиции, вводимой перорально, которая представляет собой пищевой ферментированный молочный продукт или биологически активную пищевую добавку.

Кроме того, известно, что Bifidobacterium animalis subsp.lactis (штамм DN 173 010) входят в состав заквасочной микрофлоры для кисломолочных продуктов компании Данон, БАД к пище «Бифиформ Бэби, «Нормобакт» (https://ru.wikipedia.org/wiki/Bifidobacterium_animalis).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм окситолерантных акклиматизированных Bifidobacterium animalis subsp. lactis BZ11 и способ его ферментации с высокой плотностью для производства продуктов питания или лекарств, богатых высокоактивными бифидобактериями, для удовлетворения жизненных потребностей людей (патент Китая № CN 106167775 В, МПК C12N 1/20, опубл. 30.11.2016 г.). Способ включает два этапа: (1) акклиматизация Bifidobacterium animalis subsp. лактис BZ11; (2) ферментация высокой плотности. Ферментация с высокой плотностью использует оптимизированную среду, содержащую морковный сок и сок капусты, для культивирования окситолерантного акклиматизированного штамма BZ11 в 5-литровом ферментационном резервуаре. Технологические условия контролируются следующим образом: количество инокулята 10%, постоянный рН=6 ферментационной жидкости и ферментационный способ периодического питания с мембранной фильтрацией. В соответствии с методом ферментации после культивирования в течение 72 часов количество жизнеспособных микроорганизмов может достигать 2,29×10¹⁰ КОЕ/мл, что соответствует количеству жизнеспособных микроорганизмов, необходимому для добавления пищевых продуктов или лекарств людьми.

К недостаткам выше приведенных аналогов и прототипа является длительные сроки культивирования используемых штаммов Bifidobacterium animalis subsp. lactis, что снижает их технологичность.

Техническим результатом заявляемого технического решения является повышение технологичности заявляемых вариантов штамма за счет сокращения в 4 раза времени культивирования биомассы пробиотических продуктов и расширение спектра используемых отечественных штаммов Bifidobacterium animalis subsp. lactis для приготовления на их основе пробиотических продуктов и БАДов.

Указанный технический результат достигается получением первого варианта штамма Bifidobacterium animalis subsp. lactis ВБА1, используемого для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, депонированный в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», имеющий регистрационный номер ВКПМ № Ас-2185 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 фрагмента генома.

Указанный технический результат достигается также получением второго варианта штамма Bifidobacterium animalis subsp. lactis ВБА2, используемого для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, депонированный в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», имеющий регистрационный номер ВКПМ №Ас-2186 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 фрагмента генома.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 фрагмента генома штамма Bifidobacterium animals ВБА1. На фиг. 2 представлена нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 фрагмента генома штамма Bifidobacterium animals ВБА2.

Этапы выделения заявляемых штаммов ВБА1 и ВБА2

Заявитель (АО «Вектор-БиАльгам») осуществляет постоянный мониторинг кисломолочных продуктов с пробиотическим эффектом разных производителей для определения количества и качества бифидобактерий в этих продуктах для сравнения с собственными пробиотическими продуктами. При этом в 2022 г. нами обнаружены и выделены посторонние быстрорастущие бифидобактерий из жидкого (питьевого) кисломолочного продукта биойогурт, в котором в качестве активных ингредиентов содержатся живые бактерии В. Bifidum и В. longum.

Количественное содержание бифидобактерий в процессе мониторинга определяли стандартным образом по ГОСТ Р56139-2014 «Продукты функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов», методом предельных разведений. Десятикратные разведения продукта засевали в предварительно регенерированную бифидум - среду, культивировали при 37°С в течение 72 ч.

При просмотре посевов в процессе культивирования обнаружили характерные колонии бифидобактерий в бифидум - среде уже к 10-12 ч культивирования. При этом для штаммов В. bifidum (АС 1779, 791БАГ) и В. longum (AC 1665) аналогичный рост наблюдается только к концу времени культивирования (20÷24) ч.

Далее высевали эти выделенные быстрорастущие штаммы на бифидум - среду из разведений, где выросло не более 3-х колоний. Культивировали при температуре 37°С в течение 10 ч до появления характерных колоний.

Результаты исследований выявленных быстрорастущих колоний бифидобактерий:

1. Изучение морфологии клеток с помощью микроскопии в бинокулярном микроскопе под масляной иммерсией. Готовили два вида препаратов для микроскопии (ув. 1300):

- окраска по Граму;

- окраска раствором метиленовым синим.

2. Рост в молочной среде с ростовыми добавками:

- определение активности кислотообразования;

- определение количества бифидобактерий, КОЕ/см³.

3. Контроль микробной культуры на наличие посторонней микрофлоры, для чего культуру в количестве 0,1 мл высевали на агаризованные среды:

- посев на ΜΠΑ для определения общего числа микроорганизмов посторонней микрофлоры, инкубация в течение 2-х суток при температуре 37°С;

- посев на Сабуро агар для определения количества дрожжей и плесеней, инкубация в течение 5-ти суток при температуре 28°С;

- посев на среду Эндо для определения энтеробактерий, инкубация в течение 2-х суток при температуре 37°С.

При обнаружении посторонней микрофлоры образец браковался и процедура выделения чистой культуры повторялась для того, чтобы случайно не попали другие микроорганизмы, в том числе бифидобактерий с невидимым ростом.

Особое внимание уделяли скорости роста и количественному содержанию бифидобактерий на молочной среде с ростовыми добавками. В результате описанных выше исследований нами были обнаружены 2 культуры бифидобактерий, имеющих авторское наименование ВБА1 и ВБА2, с высокими ростовыми характеристиками, которые были переданы на идентификацию в Биоресурсный центр ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» для их последующего депонирования.

А. Результаты идентификации штамма ВБА1. Вид: Bifidobacterium animalis

Этапы работ

I. Рассев культуры заказчика до отдельной колонии и получение биомассы для анализа 16S РНК.

I. Выделение ДНК.

II. Выбор праймеров и режимы ПЦР.

Консервативные праймеры для наработки 16S rDNA -

8f - aga gtt tga tcc tgg ctc ag

926r - ccg tca att cct ttr agt tt

с режимами реакции:

1. 95°С - 3 мин.

2. 35 циклов

95°С - 30 сек. 57°С - 30 сек.

72°С - 1 мин 30 сек.

3. 72°С - 5 мин.

III. Секвенирование 16S rDNA, сравнение секвенсов

Секвенирование проводится на автоматическом секвенаторе АЕ3000. Для анализа секвенсов используются специализированные филогенетические компьютерные программы.

Стабильность воспроизведения результатов. Проводится не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Условия электрофореза ПЦР исследуемых образцов.

1,0% агарозный гель, электрофорез при напряженности электрического поля 5 В/см

а) Секвенирование вариабельных участков 16S rDNA.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) штамма Bifidobacterium animals ВБА1, представленная на фиг. 1 и в приложении.

б) Анализ результатов секвенирования

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium.

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.

Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде (табл. 1):

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%.

Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий показал, что наиболее близким к исследуемому штамму является вид Bifidobacterium animalis (99%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к виду Bifidobacterium animalis (99%). Штамм ВБА 1 депонирован в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» и имеет регистрационный номер ВКПМ №Ас-2185 (справка №2185 от 05.10.2022 г. о депонировании штамма ВБА1 прилагается)

Б. Результаты идентификации штамма ВБА2. Вид: Bifidobacterium animalis.

Этапы работ

I. Рассев культуры заказчика до отдельной колонии и получение биомассы для анализа 16S РНК

I. Выделение ДНК.

II. Выбор праймеров и режимы ПЦР.

Консервативные праймеры для наработки 16S rDNA -

8f - aga gtt tga tcc tgg ctc ag

926r - ccg tca att cct ttr agt tt

с режимами реакции:

3. 95°C - 3 мин.

4. 35 циклов 95°С - 30 сек.

57°С - 30 сек

72°С - 1 мин 30 сек.

3. 72°С - 5 мин.

III. Секвенирование 16S rDNA, сравнение секвенсов

Секвенирование проводится на автоматическом секвенаторе АЕ3000.

Для анализа секвенсов используются специализированные филогенетические компьютерные программы.

Стабильность воспроизведения результатов. Проводится не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Условия электрофореза ПЦР исследуемых образцов.

1,0% агарозный гель, электрофорез при напряженности электрического поля 5 В/см

b) Секвенирование вариабельных участков 16S rDNA.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 2), представленная на фиг. 2 и в приложении.

б) Аназиз результатов секвенирования

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium.

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде (табл. 2).

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%.

Анализ филогенетического родства, построенный с использованием типовых штаммов близкородственных бактерий показал, что наиболее близким к исследуемому штамму является вид Bifidobacterium animalis (98%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм наиболее близок к виду Bifidobacterium animalis (98%). Штамм ВБА2 депонирован в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» и имеющий регистрационный номер ВКПМ № Ас-2186 (справка №2186 от 05.10.2022 г. о депонировании штамма ВБА2 прилагается).

Характеристика заявляемых штаммов.

Штаммы Bifidobacterium animalis subsp.lactis ВБА1 и ВБА2 обладают следующими свойствами:

Клетки штаммов представляют собой Грам+, полиморфные, бесспоровые, неподвижные тонкие, слегка изогнутые палочки с утолщениями на обоих концах. Встречаются кокковидные формы. Расположение клеток одиночное, парами, скоплениями.

Анаэробы. В полужидких питательных средах (Бифидум среда) клетки штаммов растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму комет.

На поверхности плотной среды нижеуказанного состава (Бифидум-среда) через 3-5 суток культивирования образует не пигментированные круглые выпуклые колонии диаметром 1-3 мм с ровными краями. В глубине плотных сред колонии имеют вид дисков, гречишных зерен диаметром 1-2 мм.

Состав плотной среды (Бифидум-среда): панкреатический гидролизата казеина - 30 г/л, экстракт пекарских дрожжей - 5,0 г/л, глюкоза - 7,5 г/л, лактоза - 2,5 г/л, цистеин - 0,5 г/л, натрий хлористый - 2,5 г/л, магний сернокислый 7-водный - 0,5 г/л, кислота аскорбиновая - 0,5 г/л, натрий уксуснокислый 3-водный - 0,3 г/л, агар - 1,2 г/л. рН среды - 6,8-7,3.

В жидкой Бифидум среде (агар - 0,75 г/л) время выращивания 1-3 суток. Колонии кремового цвета в виде комет.

Продукты, синтезируемые штаммами ВБА1 и ВБА2: уксусная и молочная кислоты.

Активность (продуктивность) штаммов ВБА1 и ВБА2, другие производственные показатели с использованием метода, приведенного в: «Технологическая инструкция по приготовлению и применению заквасок и бактериальных концентратов для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности. М., 2004»: сквашивают обрат при внесении 5% закваски к объему обрата в течение 20-24 час при температуре 37°С с образованием сгустка.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штаммов: лиофильно высушенная культура с использованием в качестве защитной среды сахарозо-желатозной среды хранится в течение 1 года при температуре от +2 до 10°С. В течение двух недель культура хранится в молочной среде (обрат с ростовыми добавками), полужидких и плотных средах типа Бифидум-среды. Условия хранения: при температуре от +2 до 10°С.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: культура хорошо наращивает биомассу на Бифидум-среде.

При культивировании на молочной среде с использованием ростовых добавок (лактопептон, дрожжевой экстракт) отмечаются высокие показатели титруемой кислотности, так как в среде культивирования активно накапливаются органические кислоты. Значение кислотности культуры ВБА1 составляет 104-145°Т, а кислотность культуры ВБА2 составляет 120-152°Т. Молочная смесь сквашивается к 18 часам культивирования с образованием ровного сгустка без сыворотки, запах и вкус продукта кисломолочный. Количество бифидобактерий (КОЕ/см³) при культивировании в течение 18 час культуры ВБА1 составляет 1,5×10¹⁰, культуры ВБА2 составляет 2,4×10¹⁰.

Тип питания культур - хемоорганотрофы, имеющие ферментативный тип метаболизма, разлагают различные углеводы до кислоты, без образования газа. Оптимальная температура роста составляет 37±1°С.

Заявляемые штаммы бифидобактерий участвуют в ферментативных процессах, выполняют витаминообразующую функцию (синтез витаминов группв В, витамина К, фолиевой и никотиновой кислот), улучшают показатели белкового, липидного и минерального обмена, так как усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, растворяют клетчатку, стимулируют перистальтику кишечника, способствуют нормальному очищению кишечника, а также способствуют синтезу незаменимых аминокислот, лучшему усвоению солей кальция, витамина D, обладают антианемическим, антирахитическим и антиаллергическим действием, стимулируют лимфоидный аппарат.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штаммы Bifidobacterium animalis subsp. lactis ВБА1 и ВБА2 отличаются высокой технологичностью, активно наращивают биомассу бифидобактерий на молочных средах с содержанием бифидобактерий не ниже 10¹⁰КОЕ/см³, образуют в процессе культивирования органические кислоты, обладают высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, устойчивы к повышенной кислотности. Сквашивают молоко с образованием сгустка.

Представленные данные изучения штаммов Bifidobacterium animalis subsp. lactis ВБА1 и ВБА2 позволяют сделать заключение о перспективности использования штаммов данного вида в составе биологически активных добавок к пище, пищевых продуктов.

Пример. Использование заявляемых штаммов ВБА1 и ВБА2.

Активность кислотообразования предлагаемых к патентованию штаммов, а также других видов бифидобактерий, широко применяемых сегодня для производства БАД, заквасок и кисломолочных продуктов, при культивировании на молочной среде с ростовыми добавками (автолизат дрожжевой - 0,24 г/л, «лактопептон» - 2 г/л) в течение 18 часов приведена в таблице 3.

Таким образом, предлагаемые к патентованию штаммы В. animalis subsp.lactis ВБА1 и В. animalis subsp.lactis ВБА2 обладают стоп-эффектом, который очень важен при производстве пробиотических продуктов (БАД, заквасок, кисломолочных продуктов), поскольку при хранении готовые продукты, полученные с использованием данных штаммов обладают выраженным низким постокислением, в то время как таким эффектом не обладают заквасочные культуры на основе штаммов В. bifidum АС 1779 или В. longum АС 1665 или иных штаммов бифидобактерий, например, В. bifidum 791 или В. bifidum 791БАГ.

Рост титруемой кислотности на молочной среде с ростовыми добавками (автолизат дрожжевой - 0,24 г/л, «лактопептон» - 2 г/л) отмечен через 8 ч культивирования, что свидетельствует об активизации метаболических процессов в популяции бактерий. Прирост титруемой кислотности В.animalis ВБА1 и В.animalis ВБА2 на 109-120°Т за 18 ч культивирования, при этом достигается высокая концентрация бифидобактерий - свыше 10 млрд. живых клеток в 1 мл, т.е. 10¹⁰ КОЕ/см³. По сравнению со штаммами В. bifidum прирост кислотности 165°Т, В. longum - 158°Т. При этом концентрация бифидобактерий для штаммов В. bifidum составляет 4,3х10⁹ КОЕ/см³, для В. longum - 9,3×10⁹ КОЕ/см³, что 2,5-3,5 раза ниже, чем в заявляемых штаммах В.animalis ВБА1 и В.animalis ВБА2.

Показатели кислотности на различных питательных средах при культивировании в течение 18 час представлены в таблице 4.

Состав молочной среды и технология ее приготовления

Состав молочной среды на 100 кг приведен в таблице 5. Технология приготовления молочной среды. Сухое обезжиренное молоко растворить в теплой питьевой воде (45±5)°С, смесь довести до однородной суспензии путем перемешивания в течение (5-10) мин. и выдержать 20-30 мин для набухания белков молока. Затем внести ростовые добавки, растворить их перемешиванием. Молочную смесь подвергнуть высокотемпературной обработке (105°С в течение 40 минут) в ферментере.

В охлажденную до (37±1°)С молочную смесь внести 3% производственной закваски. Время культивирования 18 час при температуре (37±1)°С. Охладить при слабом перемешивании до (20±1)°С, разлить в потребительскую тару, хранить при температуре не выше (10)°С.

Полученные концентраты бактерий В.animalis ВБА1 и ВБА2 имеют следующие показатели (Табл. 6)

В.animalis ВБА1 и В.animalis ВБА сквашивают молоко с образованием нежного сгустка с приятным кисломолочным запахом и вкусом.

Оба штамма высокотехнологичны, при внесении 3% инокулята и времени ферментации 18 час получены продукты с высоким содержанием бифидобактерий (1,5÷2,4х10¹⁰КОЕ/см³) на молочной среде с небольшим содержанием ростовых добавок (автолизат дрожжевой - 0,24 г/л, «лактопептон» - 2 г/л).

Таким образом, предлагаемые к патентованию штаммы В.animalis subsp.lactis ВБА1 и В.animalis subsp.lactis ВБА2 обладают:

- выраженным стоп-эффектом, являясь слабыми кислотообразо-вателями, что очень важно при производстве кисломолочных продуктов для детей, диетических кисломолочных продуктов;

- повышенной урожайностью культуры клеток, что в конечном итоге выражается в высокой концентрации живых активных клеток в готовом продукте, в сравнении с другими штаммами бифидобактерий, например, В. bifidum и В. longum, что так же важно при создании заквасок или производства БАД к пище;

по сравнению со штаммом-прототипом (патент Китая № CN 106167775 В, МПК C12N 1/20, опубл. 30.11.2016 г.) предлагаемые к патентованию штаммы обладают более высокой скоростью роста, чем достигают такой же концентрации бифидобактерий (2,29×10¹⁰ КОЕ/мл), но в четыре раза быстрее: китайский штамм - через 72 час ферментации (с количеством инокулята 10% при периодическом питании с мембранной фильтрацией и постоянном поддержании рН=6,0), предлагаемые штаммы - через 18 часов культивирования (количество инокулята 3%).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="Штаммы_переч_посл_23.01.2023.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-01-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022134127</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Акционерное общество

&quot;Вектор-БиАльгам&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Aktsionernoe obshchestvo

&quot;Vector-BiAlgam&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм Bifidobacterium animalis

subsp. lactis, используемый для получения ферментированных и

неферментированных пищевых продуктов и биологически активных добавок

к пище (варианты)</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>648</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..648</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Bifidobacterium

animals</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctaccgcactccagcccgcccgtacccggcgcagatccaccgttaggc

gatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagccctttacgcccaataaatccggataacgct

cgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcgaacaatccactcaaca

cggccgaaaccgtgccttgcccttgaacaaaagcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggc

gtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgt

atctcagtcccaatgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtgggccatcacc

ccgccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaagcatttcccaccccaccatgcgatg

gagcggagcatccggtattaccacccgtttccaggagctattccggtgcacagggcaggttggtcacgca

ttactcacccgttcgccactctcaccccgacagcaagctgccagggatcccgttcgacttgcatgtgtta

agcacgccgccagcgttcatcctgagccaggwtcaaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>646</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..646</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Bifidobacterium

animalis</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tacmgcactccagcccgsccgtacccggcgcagatccaccgttaggcga

tggamtttcacaccggackcgacgaaccgcctrcgagccctttacgcccaataaatccggataacgctcg

caccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcgaacaatccactcaacacg

gccgaaaccgtgccttgcccttgaacaaaagcggtttacaacccgaaggcctccatcccgcacgcggcgt

cgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtat

ctcagtcccaatgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcaacgccttggtgggccatcacccc

gccaacaagctgataggacgcgaccccatcccatgccgcaaaagcatttcccaccccaccatgcgatgga

gcggagcatccggtattaccacccgtttccaggagctattccggtgcacagggcaggttggtcacgcatt

actcacccgttcgccactctcaccccgacagcaagctgccagggatcccgttcgacttgcatgtgttaag

cacgccgccrgcgttcatcctgagccaggatcaaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к вариантам штаммов Bifidobacterium animalis subsp. lactis, и может быть использовано для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов. Получены два штамма Bifidobacterium animalis subsp. lactis, названные как ВБА1 и ВБА2, которые были депонированы в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» с регистрационными номерами ВКПМ № Ас-2185 и ВКПМ № Ас-2186, соответственно. Изобретение обеспечивает повышение технологичности вариантов штаммов за счет сокращения в 4 раза времени культивирования биомассы пробиотических продуктов, а также расширение спектра используемых отечественных штаммов Bifidobacterium animalis subsp. lactis для приготовления на их основе пробиотических продуктов и БАДов. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 1 пр.

1. Штамм Bifidobacterium animalis subsp. lactis ВБА1, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, депонированный в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», имеющий регистрационный номер ВКПМ № Ас-2185 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID ΝΟ: 1 фрагмента генома.

2. Штамм Bifidobacterium animalis subsp.lactis ВБА2, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, депонированный в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» и имеющий регистрационный номер ВКПМ № Ас-2186 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 фрагмента генома.