Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской отраслям промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин [1, 4].
Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.
Вместе с тем рационализация подхода к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должна основываться на закономерностях, связанных с процессами стабилизации нормобиоценоза, в особенности, учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательная смена микробиоценозов в процессе онтогенеза, в результате которой происходит вытеснение одних видов микроорганизмов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в данных условиях. При этом образуется сукцессионный ряд - серия, с конечным формированием относительно стабильного биоценоза. Данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте; в то же время у взрослых людей состав бифидофлоры относительно стабилен [8].
Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью основными видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].
Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерии (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8, 9].
Виды В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum характерны для микробиоценоза детей младшего возраста. Вместе с тем уже на новом методическом уровне подтверждены данные о том, что виды В. bifidum и В. longum остаются доминантными представителями бифидофлоры человека во все возрастные периоды жизни. Это означает, что оптимальная формула пробиотического средства должна включать как «подвижную», меняющуюся в процессе онтогенеза часть, которая комплементарна микробиоценозу определенной возрастной категории людей, так и «консервативную», состоящую из видов, стабильно сохраняющихся в процессе онтогенеза. В связи с этим селекция перспективных штаммов бифидобактерий, относящихся к видам В. bifidum и В. longum, как универсальных и наиболее распространенных, представляет особый интерес при создании средств коррекции микрофлоры.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. bifidum OV-7, обладающего антагонистической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.
Штамм В. bifidum OV-7 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №215.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. bifidum OV-7 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. bifidum OV-7, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. bifidum OV-7 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного человека.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические свойства
Клетки штамма В. bifidum OV-7 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные тонкие палочки с утолщениями на обоих концах, расположенные попарно под углом в 90° друг к другу или группами, образуя древовидную структуру или «рога оленя».
В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму тонких комет длиной 8-12 мм с расширяющимся хвостом.
Физиолого-биохимические свойства
Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,5-4,0. Ферментирует лактозу, фруктозу, вариабельно арабинозу, ксилозу, рафтилозу. Не ферментирует мальтозу, сахарозу, галактозу, раффинозу, рамнозу, салицин, маннозу, целлобиозу, трегалозу, мелецитозу, сорбитол, эскулин, маннитол.
Генотипирование штамма В. bifidum OV-7 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272011 и EU 272017.
Культуральные свойства
Штамм активно накапливает биомассу на различных производственных средах до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (табл.1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Данные, представленные в табл.1, показывают, что штамм В. bifidum OV-7 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 109 КОЕ/мл. При этом отмечаются высокие показатели титруемой кислотности, что говорит об активном накоплении органических кислот. Молоко сквашивает к 24 часам культивирования с образованием ровного без сыворотки сгустка с приятным кисломолочным запахом и вкусом. При культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 75 °Т.
В табл.2 представлены данные культивирования штамма В. bifidum OV-7 в течение 96 часов на обезжиренном молоке и бифидум-среде.
Данные, представленные в табл.2, демонстрируют, что при длительном культивировании штамма В. bifidum OV-7 при нарастании содержания органических кислот в культуральной жидкости и обезжиренном молоке не происходит снижения содержания жизнеспособных клеток бифидобактерий, что говорит о высокой устойчивости штамма В. bifidum OV-7 к кислой среде.
Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. bifidum OV-7 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями. Устойчив к кислой среде. Сквашивает молоко, что делает возможным изготовление на его основе ферментированных кисломолочных продуктов с ценными лечебно-профилактическими и органолептическими свойствами.
Антагонистическая активность штамма В. bifidum OV-7 изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (таблица 3).
Результаты, представленные в табл.3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. bifidum OV-7 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов) их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. bifidum OV-7 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.
Чувствительность к антибиотикам штамма В. bifidum OV-7 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в табл.4.
Как видно из табл.4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, гентамицину, промежуточно устойчив к стрептомицину, ципрофлоксацину, ломефлоксацину, пефлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.
Безвредность
В опыте изучения острой токсичности штамма В. bifidum OV-7 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×107 КОЕ на животное гибели мышей не отмечено.
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. bifidum OV-7 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу с содержанием бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков и к повышенной кислотности среды культивирования. Сквашивает молоко с образованием сгустка. Безвреден при введении лабораторным животным.
Представленные данные изучения штамма В. bifidum OV-7 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.
Пример 1. Использование штамма В. bifidum OV-7 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-7 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока 0,5 л, пептон 2 г, лактоза 10 г, хлористый натрий 5 г, цистеин 0,2 г, агар-агар 1 г, дистиллированная вода 0,5 литра; рН среды 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. bifidum OV-7 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-7 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.
Пример 3. Использование штамма В. bifidum OV-7 для получения бактерийного препарата.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-7 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 108 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.
Пример 4. Использование штамма В. bifidum OV-7 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.
Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 108 КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма В. bifidum OV-7 для получения гигиенических и косметических средств.
Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. bifidum OV-7 с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример 6. Использование штамма В. bifidum OV-7 для получения кисломолочного продукта.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-7 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до
107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 108 КОЕ/мл бифидобактерий.
Источники информации
1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. / Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.
3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, №7, с.55.
4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.
6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г. Н Габричевского, 1986, с.64-69.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004., 52 с.
8. Соколова К.Я., Соловьева И.В. / Дисбактериозы. Теория и практика. Н.Новгород, 1999, 198 с.
9. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования. Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.
Штамм Bifidobacterium bifidum OV-7 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. И. Габричевского Роспотребнадзора под №215. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, повышенной кислотности. Сквашивает молоко с образованием ровного сгустка. Нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. bifidum OV-7 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, и расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 4 табл.
Штамм Bifidobacterium bifldum OV-7 коллекционный номер №215, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
