Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к молочному скотоводству и к основным способам отбора коров с целью повышения их воспроизводительных качеств.
Цитогенетический мониторинг делает необходимым изучение процесса ассоциаций акроцентрических хромосом у крупного рогатого скота.
Для установления факта ассоциаций предложено несколько критериев, которые основаны на установлении предельной величины, определяющей расстояние друг от друга ассоциирующих хромосом. По мнение Гальперина Х. (1968), за ассоциации акроцентрических хромосом можно принять сближение их коротких плеч на расстояние, не большее размера длинного плеча наименьшего из акроцентриков, участвующего в формировании ассоциации. Нанкин Х. (1970) за межцентромерное расстояние при ассоциации допускал ширину хроматиды. Жданова Н.С. (1971) максимальное расстояние при ассоциациях хромосом принимала равным половине хроматиды больших акроцентрических хромосом. Согласно мнению других авторов, безусловными формами ассоциаций являются соединения акроцентриков спутниками, вне зависимости от расстояния между центромерами хромосом, и специфические фигуры групп ассоциирующих хромосом (Жигачев А.И., Никитин Н.С., Черкасов В.В., 1984). Некоторые авторы (Editehadi M., 1978; Fruland A., Mikkelson M., 1983; Бакай А.В., 1986; Красота В.Ф., Бакай А.В., Семенов А.С., 1988) описывают ассоциации акроцентрических хромосом с мета- и субметацентрическими.
Для анализа ассоциаций акроцентрических хромосом использовались клетки, удовлетворяющие следующим критериям: наличие полного набора хромосом и благоприятное для анализа расположение акроцентриков.
Изучение архитектоники ядра соматических клеток расширило понимание механизмов функционирования наследственного аппарата. Установлено, что расположение хромосом в ядре носит не случайный, а определенный закономерный характер. Они могут быть размещены в центре или на периферии ядра; отмечаются также парное расположение гомологичных хромосом и группировка (ассоциации) непарных хромосом. Выявлено, что определенные группировки акроцентрических хромосом являются следствием их функциональной деятельности.
Связь гетерохроматических участков хромосом с ядерными мембранами определяет фиксирование положение X-хромосомы в интерфазном ядре и митозе. Явление закономерного расположения хромосом в виде концентрических зон и локализации хромосом в определенных зонах ядра (от центра к периферии) вызывает предположение, что существует не только эффект положения гена, но и ядерный эффект положения.
В настоящее время не подлежит сомнению, что существует определенный порядок расположения хромосом в ядре в период интерфазы и метафазы. Возможно, что одним из факторов, препятствующих дезориентации хромосом, является их способность вступать в ассоциации (Прокофьева-Бельговская А.А., Гиндилис В.М., 1966; Семенов А.С., 2007).
Способ оценки кариологического статуса коров с учетом пространственной ориентации хромосом может быть использован в практике цитогенетического анализа высокопродуктивных коров, коров-доноров и коров-быкопроизводящих групп, а также для предварительной характеристики цитогенетической полноценности их потомства.
Задачей изобретения является разработка способа для прогнозирования и выявления коров с нарушениями репродуктивных функций.
Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика нарушений репродуктивных функций у высокопродуктивных коров с использованием цитогенетического анализа, позволяющего комплексно оценить и установить кариологический статус коров и коров-доноров.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что оценку коров проводят с учетом пространственной ориентации X-хромосом и высокой способностью вступать их в ассоциации, а именно фиксированное положение X-хромосом в центре интерфазного ядра позволяет комплексно оценить и установить кариологический статус коров и коров-доноров.
Пример
Для цитогенетического анализа используют кровь коров. Лейкоциты помещают в культивационную смесь и добавляют туда стимулятор деления лейкоцитов фитогемагглютинин (ФГА). Культивирование проводится в термостате при 37-38°С в присутствии антибиотиков, для предотвращения роста микроорганизмов. Наибольшее количество делящихся лейкоцитов обнаруживается через 72 ч культивирования. За 1-1,5 ч до фиксации во флаконы с культурой вводится колхицин (0,004%-ный водный раствор, 0,2-0,3 мл на флакон). Для этой операции стерильность не требуется. Через 1-1,5 ч культивирование прекращают, культуру разливают по центрифужным пробиркам, центрифугируют 5-10 мин и гипотонируют. Гипотонизация продолжается 20-30 минут при определенной температуре, в результате чего клетки набухают, и хромосомы несколько отходят друг от друга. После центрифугирования 800-1000 об/мин в течение 10 мин гипотонический раствор заменяют фиксатором. Фиксатор готовится из 3 частей безводного метанола и 1 части безводной («ледяной») уксусной кислоты. Общее время фиксации должно составлять не менее 40 мин, при этом порцию фиксатора следует заменять свежей не менее 1-3 раз в зависимости от продолжительности фиксации. Фиксатор используется только свежеприготовленный и охлажденный до 4°; фиксация проводится при этой же температуре. Последнюю порцию фиксатора следует прилить к осадку клеток в количестве 0,5 мл и ресуспензировать в ней осадок. Капли взвеси клеток помещают на предметное стекло и высушивают феном. Лучше использовать охлажденные стекла, тогда они хорошо распространяются по очень тщательно вымытому и обезжиренному стеклу. Окраска рутинная (обычная) красителем Гимза (азур-эозин) - 3 мл маточного раствора в метаноле довести до 100 мл фосфатным буфером с рН=6,8. Время окраски - 45 мин.
Стекло с препаратом просматривают по всей площади с перемещением его по длине и ширине при малом увеличении (200-400 раз).
Под малым увеличением метафазная пластина помещается в центре поля зрения. На стекло в месте ее расположения помещается капля иммерсионного масла, и микроскоп переводится на большое увеличение (900-1350 раз).
Требуется определить пригодность метафазной пластинки для анализа. Годными считаются метафазы округлой или эллипсоидной формы. Все хромосомы должны лежать в одной плоскости, иметь сходную степень спирализации. Наложения хромосом друг на друга снижают пригодность метафазы для анализа.
Наиболее простой способ изучения пространственного расположения хромосом - визуальный учет хромосомных ассоциаций. Ассоциированными считаются хромосомы с близко расположенными центромерами, расстояние между которыми не превышает диаметра (толщины) хромосомного плеча, и между которыми нет других хромосом. Подсчитывается число хромосом, вступивших в ассоциацию, число ассоциаций в клетке, число клеток с ассоциациями и доля (%) таких клеток среди всех изученных метафаз.
Для каждого животного просматривают не менее 100 метафаз, под микроскопом.
У каждой коровы определили долю клеток с ассоциативной способностью и выделили клетки со смещением X-хромосом к центру.
Анализ, проведенный описанным способом для групп коров, показал, что коровы с нарушением репродуктивных функций (аборт и мертворождения) имеют 81,0% клеток способных образовывать ассоциации. При этом клеток со смещением Х-хромосом к центру выявлено 55,6% (таблица 1).
Половые хромосомы в метафазе митоза занимают периферическое положение. У коров-бридеров (повторное осеменение) доля клеток с ассоциациями - 79,0%, причем у 44,3% клеток наблюдаем смещение Х-хромосомы к центру.
У животных без патологий и нарушений репродуктивных функций ассоциативной способности хромосом составляют 52,0%, и смещение X-хромосомы отмечают только у 2,0% коров.
Способ оценки кариологического статуса коров с учетом пространственной ориентации хромосом может быть использован в практике цитогенетического анализа высокопродуктивных коров, коров-доноров и коров-быкопроизводящих групп, а также для предварительной характеристики цитогенетической полноценности их потомства.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу отбора коров с целью повышения их воспроизводительных качеств. Оценку кариологического статуса коров проводят с учетом ассоциативной способности хромосом и пространственной ориентации X-хромосом, а именно фиксированное положение X-хромосом в центре интерфазного ядра. Способ позволяет комплексно оценить и установить кариологический статус коров и коров-доноров. 1 табл.
Способ цитогенетического анализа коров с целью предварительной характеристики генетической полноценности их потомства, включающий оценку коров с учетом пространственной ориентации X-хромосом, а именно фиксированным положением X-хромосом в центре интерфазного ядра, где коровы с нарушением репродуктивных функций (аборт и мертворождения) имеют 81,0% клеток, способных образовывать ассоциации, при этом клеток со смещением Х-хромосом к центру выявлено 55,6%, половые хромосомы в метафазе митоза занимают периферическое положение; у коров-бридеров доля клеток с ассоциациями - 79,0%, причем у 44,3% клеток наблюдается смещение Х–хромосомы к центру; у животных без патологий и нарушений репродуктивных функций способность хромосом вступать в ассоциации составляет 52,0%, и при этом смещение X-хромосомы отмечают только у 2,0% коров.
| БАКАЙ А.В, и др., Кариологический анализ у коров с различными нарушениями репродуктивных функций, Международный научно-исследовательский журнал, N7 (49), 2016, часть 4, июль DOI: 10.18454/IRJ.2016.49.084 | |||
| БАКАЙ А.И., Воспроизводительные качества голштинизированных коров с разным уровнем кариотипической нестабильности, автореферат диссертации, |
